Name: isolation and analysis of traceable and functionalized extracellular vesicles from the plasma and solid tissues
Uploaded: 2022-10-17T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Analysis of Traceable and Functionalized Extracellular Vesicles from the Plasma and Solid Tissues at JoVE.com

تم دعم هذا العمل بمنح من المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (32000974 و 81870796 و 82170988 و 81930025) ومؤسسة علوم ما بعد الدكتوراه الصينية (2019M663986 و BX20190380). نحن ممتنون للمساعدة التي قدمها المركز الوطني التجريبي للتدريس التجريبي للطب الأساسي (AMFU).

تم إجراء التجارب على الحيوانات وفقا للمبادئ التوجيهية للجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسية للجامعة الطبية العسكرية الرابعة وإرشادات ARRIVE. بالنسبة للدراسة الحالية ، تم استخدام الفئران C57Bl / 6 البالغة من العمر 8 أسابيع (لا يوجد تفضيل للإناث أو الذكور). يوضح الشكل 1 الخطوات ال?...

<ol>
	<li>Abels, E. R., Breakefield, X. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introduction+to+extracellular+vesicles:+biogenesis,+RNA+cargo+selection,+content,+release,+and+uptake.">Introduction to extracellular vesicles: biogenesis, RNA cargo selection, content, release, and uptake.</a> Cellular and Molecular Neurobiology. 36 (3), 301-312 (2016).</li><li>Mathieu, M., Martin-Jaular, L., Lavieu, G., Th&#233;ry, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specificities+of+secretion+and+uptake+of+exosomes+and+other+extracellular+vesicles+for+cell-to-cell+communication.">Specificities of secretion and uptake of exosomes and other extracellular vesicles for cell-to-cell communication.</a> Nature Cell Biology. 21 (1), 9-17 (2019).</li><li>Van Niel, G., D'Angelo, G., Raposo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shedding+light+on+the+cell+biology+of+extracellular+vesicles.">Shedding light on the cell biology of extracellular vesicles.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (4), 213-228 (2018).</li><li>Witwer, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardization+of+sample+collection,+isolation+and+analysis+methods+in+extracellular+vesicle+research.">Standardization of sample collection, isolation and analysis methods in extracellular vesicle research.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 2 (1), 20360 (2013).</li><li>Keshtkar, S., Azarpira, N., Ghahremani, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cell-derived+extracellular+vesicles:+novel+frontiers+in+regenerative+medicine.">Mesenchymal stem cell-derived extracellular vesicles: novel frontiers in regenerative medicine.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 9 (1), 63 (2018).</li><li>Thietart, S., Rautou, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles+as+biomarkers+in+liver+diseases:+A+clinician's+point+of+view.">Extracellular vesicles as biomarkers in liver diseases: A clinician's point of view.</a> Journal of Hepatology. 73 (6), 1507-1525 (2020).</li><li>Xia, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Damaged+brain+accelerates+bone+healing+by+releasing+small+extracellular+vesicles+that+target+osteoprogenitors.">Damaged brain accelerates bone healing by releasing small extracellular vesicles that target osteoprogenitors.</a> Nature Communications. 12 (1), 6043 (2021).</li><li>In’t Veld, S. G. J. G., Wurdinger, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor-educated+pletelets.">Tumor-educated pletelets.</a> Blood. 133 (22), 2359-2364 (2019).</li><li>Schwager, S. C., Reinhart-King, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanobiology+of+microvesicle+release,+uptake,+and+microvesicle-mediated+activation.">Mechanobiology of microvesicle release, uptake, and microvesicle-mediated activation.</a> Current Topics in Membranes. 86, 255-278 (2020).</li><li>Brahmer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=endothelial+cells+and+leukocytes+contribute+to+the+exercise-triggered+release+of+extracellular+vesicles+into+the+circulation.">endothelial cells and leukocytes contribute to the exercise-triggered release of extracellular vesicles into the circulation.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 8 (1), 1615820 (2019).</li><li>Yang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood+collection+through+subclavian+vein+puncture+in+mice.">Blood collection through subclavian vein puncture in mice.</a> Journal of Visualized Experiments. (147), e59556 (2019).</li><li>Han, L., Lam, E. W., Sun, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles+in+the+tumor+microenvironment:+old+stories,+but+new+tales.">Extracellular vesicles in the tumor microenvironment: old stories, but new tales.</a> Molecular Cancer. 18 (1), 59 (2019).</li><li>Gelibter, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+storage+on+extracellular+vesicles:+A+systematic+study.">The impact of storage on extracellular vesicles: A systematic study.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 11 (2), 12162 (2022).</li><li>Forsyth, C. B., Mathews, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphocytes+utilize+CD11b/CD18+for+adhesion+to+Candida+albicans.">Lymphocytes utilize CD11b/CD18 for adhesion to Candida albicans.</a> Cellular Immunology. 170 (1), 91-100 (1996).</li><li>Kodama, J., Kaito, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoclast+multinucleation:+review+of+current+literature.">Osteoclast multinucleation: review of current literature.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (16), 5685 (2020).</li><li>Welsh, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MIFlowCyt-EV:+a+framework+for+standardized+reporting+of+extracellular+vesicle+flow+cytometry+experiments.">MIFlowCyt-EV: a framework for standardized reporting of extracellular vesicle flow cytometry experiments.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 9 (1), 1713526 (2020).</li><li>Durcin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterisation+of+adipocyte-derived+extracellular+vesicle+subtypes+identifies+distinct+protein+and+lipid+signatures+for+large+and+small+extracellular+vesicles.">Characterisation of adipocyte-derived extracellular vesicle subtypes identifies distinct protein and lipid signatures for large and small extracellular vesicles.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1305677 (2017).</li><li>Kowal, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+comparison+defines+novel+markers+to+characterize+heterogeneous+populations+of+extracellular+vesicle+subtypes.">Proteomic comparison defines novel markers to characterize heterogeneous populations of extracellular vesicle subtypes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (8), 968-977 (2016).</li><li>Noren Hooten, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+extracellular+vesicle+protein+cargo+with+race+and+clinical+markers+of+mortality.">Association of extracellular vesicle protein cargo with race and clinical markers of mortality.</a> Scientific Reports. 9 (1), 17582 (2019).</li><li>Sidhom, K., Obi, P. O., Saleem, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+exosomal+isolation+methods:+is+size+exclusion+chromatography+the+best+option.">A review of exosomal isolation methods: is size exclusion chromatography the best option.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (18), 6466 (2020).</li><li>Pietrowska, M., Wlosowicz, A., Gawin, M., Widlak, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MS-based+proteomic+analysis+of+serum+and+plasma:+problem+of+high+abundant+components+and+lights+and+shadows+of+albumin+removal.">MS-based proteomic analysis of serum and plasma: problem of high abundant components and lights and shadows of albumin removal.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 1073, 57-76 (2019).</li><li>Coumans, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methodological+guidelines+to+study+extracellular+vesicles.">Methodological guidelines to study extracellular vesicles.</a> Circulation Research. 120 (10), 1632-1648 (2017).</li><li>Th&#233;ry, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimal+information+for+studies+of+extracellular+vesicles+2018+(MISEV2018):+a+position+statement+of+the+International+Society+for+Extracellular+Vesicles+and+update+of+the+MISEV2014+guidelines.">Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).</li><li>Witwer, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardization+of+sample+collection,+isolation+and+analysis+methods+in+extracellular+vesicle+research.">Standardization of sample collection, isolation and analysis methods in extracellular vesicle research.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 2 (1), 20360 (2013).</li><li>Coumans, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methodological+guidelines+to+study+extracellular+vesicles.">Methodological guidelines to study extracellular vesicles.</a> Circulation Research. 120 (10), 1632-1648 (2017).</li><li>G&#246;rgens, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+storage+conditions+stabilizing+extracellular+vesicles+preparations.">Identification of storage conditions stabilizing extracellular vesicles preparations.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 11 (6), 12238 (2020).</li><li>Maroto, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+storage+temperature+on+airway+exosome+integrity+for+diagnostic+and+functional+analyses.">Effects of storage temperature on airway exosome integrity for diagnostic and functional analyses.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1359478 (2017).</li><li>Zheng, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoptotic+vesicles+restore+liver+macrophage+homeostasis+to+counteract+type+2+diabetes.">Apoptotic vesicles restore liver macrophage homeostasis to counteract type 2 diabetes.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 10 (7), 12109 (2021).</li><li>Liu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+apoptotic+bodies+maintain+mesenchymal+stem+cell+homeostasis+and+ameliorate+osteopenia+via+transferring+multiple+cellular+factors.">Circulating apoptotic bodies maintain mesenchymal stem cell homeostasis and ameliorate osteopenia via transferring multiple cellular factors.</a> Cell Research. 28 (9), 918-933 (2018).</li><li>Vander Pol, E., van Gemert, M. J., Sturk, A., Nieuwland, R., van Leeuwen, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+vs.+swarm+detection+of+microparticles+and+exosomes+by+flow+cytometry.">Single vs. swarm detection of microparticles and exosomes by flow cytometry.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 10 (5), 919-930 (2012).</li><li>Dawson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+lipid+rafts+(detergent-resistant+microdomains)+and+comparison+to+extracellular+vesicles+(exosomes).">Isolation of lipid rafts (detergent-resistant microdomains) and comparison to extracellular vesicles (exosomes).</a> Methods in Molecular Biology. 2187, 99-112 (2021).</li><li>Zhang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles:+Natural+liver-accumulating+drug+delivery+vehicles+for+the+treatment+of+liver+diseases.">Extracellular vesicles: Natural liver-accumulating drug delivery vehicles for the treatment of liver diseases.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 10 (2), 12030 (2020).</li><li>Vella, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rigorous+method+to+enrich+for+exosomes+from+brain+tissue.">A rigorous method to enrich for exosomes from brain tissue.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1348885 (2017).</li></ol>

عند دراسة ميزات ومصير ووظيفة المركبات الكهربائية ، من الضروري عزل المركبات الكهربائية ذات العائد العالي والتلوث المنخفض. توجد طرق مختلفة لاستخراج المركبات الكهربائية ، مثل الطرد المركزي المتدرج الكثافة (DGC) ، وكروماتوغرافيا استبعاد الحجم (SEC) ، ومقايسات التقاط المناعة 4,20</...

تم اقتراح الحويصلات خارج الخلية (EVs) لتحديد الهياكل خارج الخلية المغلقة بطبقة ثنائية من الدهون1 ، والتي تلعب أدوارا مهمة في مختلف الأحداث الفسيولوجية والمرضية2. يمكن تقسيم EVs التي تطلقها الخلايا السليمة على نطاق واسع إلى فئتين رئيسيتين ، وهما exosomes (أو EVs الصغيرة) التي تشكلت من خلال مسار الاتجار داخل الخلايا3 والحويصلات الدقيقة (أو EVs الكبيرة) التي طورها التبرعم الخارجي لغشاء البلازماللخلية 4. بينما تركز العديد من الدراسات على وظيفة EVs التي تم جمعها من الخلايا المستزرعة في المختبر5 ، فإن EVs المشتقة من الدورة الدموية أو الأنسجة أكثر تعقيدا وغير متجانسة ، والتي لها ميزة تعكس الحالة الحقيقية للكائن الحي في الجسم الحي6. علاوة على ذلك ، يمكن لجميع أنواع الأنسجة تقريبا إنتاج EVs في الجسم الحي ، ويمكن أن تعمل هذه المركبات الكهربائية كرسائل داخل الأنسجة أو يتم نقلها بواسطة سوائل الجسم المختلفة ، وخاصة الدم المحيطي ، لتسهيل الاتصال الجهازي7. EVs في الدورة الدموية والأنسجة هي أيضا أهداف لتشخيص الأمراض وعلاجها8.
في حين تمت دراسة الإكسوسومات بشكل مكثف في السنوات الأخيرة ، فإن الحويصلات الدقيقة لها أيضا وظائف بيولوجية مهمة ، والتي يمكن استخراجها بسهولة دون الطرد المركزي الفائق ، وبالتالي تعزيز البحوث الأساسية والسريرية9. والجدير بالذكر أن القضية الحرجة المتعلقة بالمركبات الكهربائية المعزولة من الدورة الدموية والأنسجة هي أنها مشتقة من أنواع مختلفة من الخلايا10. نظرا لأن الحويصلات الدقيقة يتم نفخها من غشاء البلازما وتتميز بوفرة من جزيئات سطح الخلية9 ، فإن استخدام علامات غشاء الخلية الأم لتحديد الأصل الخلوي لهذه المركبات الكهربائية أمر ممكن. على وجه التحديد ، يمكن تطبيق تقنية قياس التدفق الخلوي (FC) للكشف عن علامات الغشاء. علاوة على ذلك ، يمكن للباحثين عزل المركبات الكهربائية وإجراء مزيد من التحليلات بناء على الشحنات الوظيفية.
يوفر البروتوكول الحالي إجراء شاملا لاستخراج وتوصيف المركبات الكهربائية من عينات الجسم الحي. يتم عزل المركبات الكهربائية عن طريق الطرد المركزي التفاضلي ، ويشمل توصيف المركبات الكهربائية التحديد المورفولوجي عبر تحليل تتبع الجسيمات النانوية (NTA) والمجهر الإلكتروني النافذ (TEM) ، وتحليل الأصل عبر FC ، وتحليل شحنة البروتين عبر اللطخة الغربية. يتم استخدام بلازما الدم وعظم الفك العلوي للفئران كممثلين. يمكن للباحثين الرجوع إلى هذا البروتوكول للمركبات الكهربائية من مصادر أخرى وإجراء التعديلات المقابلة.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>4% paraformaldehyde&#160;</td>
			<td>Biosharp</td>
			<td>143174</td>
			<td>Transmission electron microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa fluor 488 anti-goat secondary antibody</td>
			<td>Yeason</td>
			<td>34306ES60</td>
			<td>Flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa fluor 488 anti-rabbit secondary antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11008</td>
			<td>Flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD18 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab131044</td>
			<td>Flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD81 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab109201</td>
			<td>Western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD9 antibody</td>
			<td>Huabio</td>
			<td>ET1601-9</td>
			<td>Western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mitofilin antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab110329</td>
			<td>Western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APOA1 Rabbit pAb</td>
			<td>Abclone</td>
			<td>A14211</td>
			<td>Western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA protein assay kit</td>
			<td>TIANGEN</td>
			<td>PA115</td>
			<td>Western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BLUeye Prestained Protein Ladder</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>94964-500UL</td>
			<td>Western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>MP Biomedical</td>
			<td>218072801</td>
			<td>Western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caveolin-1 antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-53564</td>
			<td>Western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellMask Orange plasma membrane stain</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C10045</td>
			<td>Flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemiluminescence</td>
			<td>Amersham Biosciences</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved operating scissor</td>
			<td>JZ Surgical Instrument</td>
			<td>J21040</td>
			<td>EV isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electronic balance</td>
			<td>Zhi Ke</td>
			<td>ZK-DST</td>
			<td>EV isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epoch spectrophotometer</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3810X</td>
			<td>EV isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flotillin-1 antibody</td>
			<td>PTM BIO</td>
			<td>PTM-5369</td>
			<td>Western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel imaging system</td>
			<td>Tanon</td>
			<td>4600</td>
			<td>Western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Golgin84</td>
			<td>Novus</td>
			<td>nbp1-83352</td>
			<td>Western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grids - Formvar/Carbon Coated - Copper 200 mesh</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>24915</td>
			<td>Transmission electron microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin Solution</td>
			<td>StemCell&#160;</td>
			<td>7980</td>
			<td>EV isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liberase Research Grade</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>5401127001</td>
			<td>EV isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscopic tweezer</td>
			<td>JZ Surgical Instrument</td>
			<td>JD1020</td>
			<td>EV isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NovoCyte flow cytometer</td>
			<td>ACEA</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Omni-PAGE Hepes-Tris Gels Hepes 4~20%, 10 wells</td>
			<td>Epizyme</td>
			<td>LK206</td>
			<td>Western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OSCAR(D-19) antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>SC-34235</td>
			<td>Flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (2x)</td>
			<td>ZHHC</td>
			<td>PW013</td>
			<td>Western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pentobarbital sodium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>57-33-0</td>
			<td>Anesthetization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L)</td>
			<td>Jacson</td>
			<td>115-035-003</td>
			<td>Western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)</td>
			<td>Jacson</td>
			<td>111-035-003</td>
			<td>Western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphotungstic acid</td>
			<td>RHAWN</td>
			<td>12501-23-4</td>
			<td>Transmission electron microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PKM2(d78a4) xp rabbit&#160; mab&#160;</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>4053t</td>
			<td>Western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene (PE) film</td>
			<td>Xiang yi</td>
			<td>200150055</td>
			<td>Transmission electron microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyvinylidene fluoride membranes&#160;</td>
			<td>Roche</td>
			<td>3010040001</td>
			<td>Western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitors</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4693132001</td>
			<td>Western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant anti-PGD antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab129199</td>
			<td>Western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RIPA lysis buffer</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>P0013</td>
			<td>Western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS-PAGE loading buffer (5x)</td>
			<td>Cwbio</td>
			<td>CW0027S</td>
			<td>Western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Size beads</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>F13839</td>
			<td>Flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tabletop High-Speed Micro Centrifuges</td>
			<td>Hitachi</td>
			<td>CT15E</td>
			<td>EV isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transmission electron microscope</td>
			<td>HITACHI</td>
			<td>H-7650</td>
			<td>Transmission electron microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>19472</td>
			<td>Western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex Mixer Genie</td>
			<td>Scientific Industries</td>
			<td>SI0425</td>
			<td>EV isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZetaView BASIC NTA - Nanoparticle Tracking Video Microscope PMX-120</td>
			<td>Particle Metrix</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Nanoparticle tracking analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-Actinin-4 Rabbit mAb</td>
			<td>Abclone</td>
			<td>A3379</td>
			<td>Western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-actin</td>
			<td>Cwbio</td>
			<td>CW0096M</td>
			<td>Western blot</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and analysis of traceable and functionalized extracellular vesicles from the plasma and solid tissues

تمثل الحويصلات خارج الخلية المنتشرة والمقيمة في الأنسجة (EVs) أهدافا واعدة كمؤشرات حيوية علاجية جديدة ، وتظهر كلاعبين مهمين في الحفاظ على التوازن العضوي وتطور مجموعة واسعة من الأمراض. بينما يركز البحث الحالي على توصيف الإكسوسومات الداخلية ذات الأصل الإندوسومي ، اكتسبت الحويصلات الدقيقة التي تتدفق من غشاء البلازما اهتماما متزايدا في الصحة والمرض ، والتي تتميز بوفرة من الجزيئات السطحية التي تلخص توقيع الغشاء للخلايا الأم. هنا ، يتم تقديم إجراء قابل للتكرار يعتمد على الطرد المركزي التفاضلي لاستخراج وتوصيف المركبات الكهربائية من البلازما والأنسجة الصلبة ، مثل العظام. يصف البروتوكول كذلك التنميط اللاحق للمستضدات السطحية وشحنات البروتين من المركبات الكهربائية ، والتي يمكن تتبعها بالتالي لاشتقاقاتها وتحديدها بمكونات تتعلق بالوظيفة المحتملة. ستكون هذه الطريقة مفيدة للتحليل الترابطي والوظيفي والميكانيكي للمركبات الكهربائية في الدراسات البيولوجية والفسيولوجية والمرضية.

وفقا لسير العمل التجريبي ، يمكن استخراج EVs من الدم المحيطي والأنسجة الصلبة (الشكل 1). يبلغ عظم الفك العلوي للفأر الذي يبلغ من العمر 8 أسابيع حوالي 0.1 ± 0.05 جم ، ويمكن جمع حوالي 300 ميكرولتر من البلازما من الماوس. باتباع خطوات البروتوكول ، يمكن جمع 0.3 ملغ و 3 ميكروغرام من EVs ، على الت...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Analysis of Traceable and Functionalized Extracellular Vesicles from the Plasma and Solid Tissues at JoVE.com

Isolation and Analysis of Traceable and Functionalized Extracellular Vesicles from the Plasma and Solid Tissues

يصف هذا البروتوكول طريقة لاستخراج الحويصلات خارج الخلية من الدم المحيطي والأنسجة الصلبة مع التنميط اللاحق للمستضدات السطحية وشحنات البروتين.

عزل وتحليل الحويصلات خارج الخلية التي يمكن تتبعها والوظيفية من البلازما والأنسجة الصلبة

Circulating and tissue-resident extracellular vesicles (EVs) represent promising targets as novel theranostic biomarkers, and they emerge as important ...

يوفر هذا البروتوكول طريقة مجدية لعزل وجمع الحويصلات الصحيحة خارج الخلية من معظم الدم والأنسجة الصلبة ، وخاصة تحليل مصدرها ومحتويات البروتين ، مما يساعد على إجراء المزيد من التجارب الوظيفية. إلى جانب الغلة العالية والتلوث المنخفض ، فإن الميزة الرئيسية لهذا البروتوكول هي تحليل المستضدات السطحية وشحنات البروتين من المركبات الكهربائية وهو أمر مفيد للدراسات الفسيولوجية والمرضية. يسهل تشخيص سرطانات الأمراض ، مثل الأمراض الالتهابية وهشاشة العظام من خلال الكشف عن العلامات السطحية للخلايا الأبوية للحويصلات خارج الخلية باستخدام مقياس التدفق الخلوي.كمية الحويصلة خارج الخلية من الأنسجة أمر بالغ الأهمية للتجارب التالية. تأكد من أن تركيز الحويصلة خارج الخلية ليس مرتفعا. التحلي بالصبر لأداء التخفيف.للبدء ، قم بإعداد عينات عظم الفك العلوي عن طريق عزل عظم الفك العلوي بملاقط ومقص العيون وغسلها باستخدام برنامج تلفزيوني للتخلص من الأنسجة الرخوة بالملاقط. ثم ضع عظم الفك العلوي في أنابيب طرد مركزي 1.5 ملليلتر وقطع العظم إلى قطع صغيرة قطرها ملليمتر واحد بالمقص. أضف كمية معينة من Liberase لتغطية الأنسجة واحتضانها لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية.بعد ذلك ، قم بطرد العينة عند 800 جرام لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية ونقل المادة الطافية بعناية باستخدام ماصة إلى أنابيب طرد مركزي جديدة ونظيفة سعة 1.5 ملليلتر. بعد الطرد المركزي لعينات البلازما والعظام المحضرة لمدة 15 دقيقة عند 2،500 جم وأربع درجات مئوية لإزالة حطام الخلايا الكبيرة والصفائح الدموية المتبقية ، قم بنقل المواد الطافية بعناية إلى أنابيب طرد مركزي جديدة ونظيفة سعة 1.5 ملليلتر وأجهزة طرد مركزي عند 16،800 جم لمدة 30 دقيقة عند أربع درجات مئوية. بعد ذلك ، تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الكريات في كل أنبوب بمليلتر واحد من PBS.بعد الطرد المركزي والتخلص من المادة الطافية كما هو موضح سابقا ، مرة أخرى ، أعد تعليق الكريات في كل أنبوب ب 50 ميكرولترا من PBS وقم بتخزين هذه العينات عند أربع درجات مئوية لمدة تقل عن 24 ساعة أو يفضل استخدامها على الفور للتحليلات. أعد تعليق العينات ب 500 ميكرولتر من PBS وانقل 50 ميكرولترا إلى أنبوب طرد مركزي جديد ونظيف سعة 1.5 ملليلتر كعنصر تحكم فارغ يسمى الأنبوب A و 50 ميكرولترا آخر في أنبوب طرد مركزي نظيف آخر سعة 1.5 ملليلتر كأنبوب تلطيخ بسيط ل FITC ، المسمى الأنبوب B.أضف 0.5 ميكرولتر من صبغة الغشاء إلى الأنبوب الأساسي لتلطيخ الغشاء أثناء الحضانة لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. بعد الطرد المركزي للأنبوب الأساسي لمدة 30 دقيقة عند 16،800 جم والتخلص من المادة الطافية ، أعد تعليق الكريات ب 200 ميكرولتر من PBS.قسم كل عينة سعة 50 ميكرولترا إلى أربعة أنابيب طرد مركزي سعة 1.5 ملليلتر لأنابيب تلطيخ بسيطة ل PE المسمى بالأنبوب C ، وتلطيخ علامات السطح المسمى بالأنبوب D ، وعناصر التحكم الثانوية للأجسام المضادة فقط المسماة بالأنبوب E.أضف الجسم المضاد الأساسي لمستقبلات ناقضة العظم المرتبطة وعينات الحويصلة العظمية خارج الخلية بالإضافة إلى عينات الأجسام المضادة CD-18 وحويصلة البلازما خارج الخلية إلى الأنبوب B والأنبوب D بشكل منفصل ، الحضانة لمدة ساعة واحدة عند أربع درجات مئوية. أجهزة الطرد المركزي الأنابيب وتجاهل المادة الطافية كما هو موضح سابقا وإعادة تعليق الكريات مع 500 ميكرولتر من PBS. مرة أخرى ، أجهزة الطرد المركزي لمدة 30 دقيقة عند 16 ، 800 G وأربع درجات مئوية لإزالة الأجسام المضادة الأولية الإضافية.بعد التخلص من المادة الطافية ، أعد تعليق الكريات ب 50 ميكرولترا من PBS ، متبوعا بإضافة الأجسام المضادة الثانوية المترافقة FITC على التوالي في الأنبوب E.احتضان جميع الأنابيب لمدة ساعة واحدة عند أربع درجات مئوية في الظلام. تمييع قطرة واحدة من 0.2 ، 0.5 ، وتعليق حبة واحدة بحجم ميكرومتر على التوالي في ملليلتر واحد من PBS. ثم قم بتشغيل كل حجم من الخرز للتأكد من البوابة المختارة للحويصلات خارج الخلية وتعيين عتبة مقياس التدفق الخلوي للبحث عن الخرز وسكان الحويصلات خارج الخلية باستخدام مبعثر داخلي أمامي مناسب.اضبط الحالة النهائية على حساب 100،000 جسيم مصبوغ بالغشاء وقم بتحليل العينة عبر مقياس التدفق الخلوي كما هو موضح في المخطوطة. أعد تعليق الكريات في 50 ميكرولترا من المخزن المؤقت RIPA-lysis واحتضانها لمدة 30 دقيقة على الجليد. لتحديد تركيزات البروتين لجميع العينات في الصفيحة الدقيقة 96 جيدا بواسطة مقايسة بروتين BCA ، قم بتخفيف ملليغرام لكل ملليلتر من BSA مع 0.9٪ من المحلول الملحي العادي إلى 0.5 ملليغرام لكل ملليلتر.عند 0.5 ملليغرام لكل ملليلتر من BSA و 0.9٪ من المياه المالحة العادية في ثلاثة آبار مكررة بأحجام معينة. ثم قم بإسقاط ميكرولتر من العينات وأضف 18 ميكرولترا من المياه المالحة العادية في ثلاثة آبار مكررة بشكل منفصل. بعد تحضير محلول عملي عن طريق خلط كاشف BCA A مع الكاشف B ، أضف 200 ميكرولتر من محلول العمل إلى كل بئر ورجه برفق لمدة 30 ثانية.ثم احتضان الصفيحة الدقيقة 96 جيدا لمدة 20 إلى 25 دقيقة عند 37 درجة مئوية وقياس الكثافة البصرية عند 596 نانومتر باستخدام مقياس الطيف الضوئي. بعد ذلك ، قم بتصدير البيانات ، وارسم منحنى قياسيا ، واحسب تركيز البروتين للعينات. وفقا للنتائج ، قم بتخفيف العينات إلى ميكروجرام واحد لكل ميكرولتر بنسبة 0.9٪ من محلول ملحي عادي وخمسة أضعاف تركيز مخزن التحميل SDS-PAGE وأغلق الأنابيب بغشاء محكم وسخن لمدة خمس دقائق عند 100 درجة مئوية.قم بتحميل العينات في سلم البروتين بتركيز متدرج من أربعة إلى 20٪ من جل تريس HEPy. قم بتشغيل الجل في المخزن المؤقت الجاري عند 80 فولت حتى تشكل البروتينات خطا. ثم قم بالتبديل إلى 120 فولت لمدة ساعة واحدة حتى تصبح صبغة التحميل في قاع الجل.انقل الجل إلى غشاء فلوريد البولي فينيليدين المحتضن مسبقا في كحول الميثيل لمدة 20 ثانية باستخدام نظام نقل رطب لنقله لمدة ساعة واحدة عند 200 مللي أمبير. قم بإعداد مخزن منع 5٪ BSA عن طريق إضافة 2.5 جرام من BSA و 50 ملليلتر من TBST في أنبوب طرد مركزي سعة 50 ملليلتر. سد الأغشية في هذا المخزن المؤقت لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة مع الإثارة.احتضان الأغشية بأجسام مضادة أولية محددة مخففة ب TBST إلى تركيز مناسب طوال الليل عند أربع درجات مئوية. اغسل الأغشية في المخزن المؤقت للغسيل أربع مرات واحتضن الأغشية بأجسام مضادة ثانوية مناسبة لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة مع الإثارة. بعد غسل الأغشية في المخزن المؤقت للغسيل أربع مرات ، قم بتصوير الأغشية باستخدام مجموعة التلألؤ الكيميائي في نظام التصوير الهلامي.كشف المجهر الإلكتروني النافذ وتحليل تتبع الجسيمات النانوية أن الخصائص المورفولوجية النموذجية للحويصلات خارج الخلية كانت مستديرة وعلى شكل كوب بقطر يتراوح من 500 إلى 300 نانومتر. يظهر تحليل قياس التدفق الخلوي النسب المئوية لعلامات غشائية محددة يتم التعبير عنها على الحويصلات خارج الخلية والتي تشير إلى أصلها من الخلايا الأم. يظهر تحليل اللطخة الغربية تعبير PGD و PKM2 على التوالي كممثل لمحتوى البروتين والحويصلات خارج الخلية في البلازما والحويصلات العظمية خارج الخلية ، مما يشير إلى الحالة الأيضية.تم الكشف عن التعبير السلبي ل Golgin-84 في الحويصلات خارج الخلية مع وجود ميتوفيلين ، ألفا أكتينين -4 ، أسطول -1 ، كافولين -1 ، وبيتا أكتين ، جنبا إلى جنب مع علامة الحويصلات CD9 ، في حين أن تعبير CD81 منخفض أو غائب مع عدم وجود APO-A-1 في الحويصلات خارج الخلية البلازما. الباحثون ، لذلك مع الأخذ في الاعتبار أن الخطوة 2.2 ، يجب أن يتم إعداد وهضم عينات الأنسجة بشكل كاف. خلاف ذلك ، فإن عدد الحويصلات خارج الخلية المستخرجة من الأنسجة محدود.يمكن حقن العلامة المسمى بقعة الفلورسنت للحويصلات خارج الخلية في الفم لعلاج المرحلة المرتبطة بالوظيفة المحتملة.

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation and Analysis of Hematopoietic Stem Cells from the Placenta

العزلة وتحليل الخلايا الجذعية المكونة للدم من المشيمة

Hematopoietic stem cells (HSCs) have the ability to self-renew and generate all cell types of the blood lineages throughout the lifetime of an individual. ...

Solid Phase Synthesis of a Functionalized Bis-Peptide Using "Safety Catch" Methodology

الصلبة التجميعي المرحلة من الببتيد البس Functionalized استخدام &quot;سلامة الصيد&quot; منهجية

In 1962, R.B. Merrifield published the first procedure using solid-phase peptide synthesis as a novel route to efficiently synthesize peptides. This ...

Techniques for the Analysis of Extracellular Vesicles Using Flow Cytometry

تقنيات لتحليل خارج الخلية الحويصلات عن طريق التدفق الخلوي

Extracellular Vesicles (EVs) are small, membrane-derived vesicles found in bodily fluids that are highly involved in cell-cell communication and help ...

Enrichment of Extracellular Matrix Proteins from Tissues and Digestion into Peptides for Mass Spectrometry Analysis

إثراء خارج الخلية مصفوفة البروتينات من الأنسجة والهضم في الببتيدات لتحليل الطيف الكتلي

The extracellular matrix (ECM) is a complex meshwork of cross-linked proteins that provides biophysical and biochemical cues that are major regulators of ...

Analysis of Cell Suspensions Isolated from Solid Tissues by Spectral Flow Cytometry

تحليل معلقات خلية معزولة من الأنسجة الصلبة من قبل الطيفي التدفق الخلوي

Flow cytometry has been used for the past 40 years to define and analyze the phenotype of lymphoid and other hematopoietic cells. Initially restricted to ...

Flow Cytometric Analysis of Extracellular Vesicles from Cell-conditioned Media

تحليل سيتوميتريك من حويصلات خارج الخلية من خلية مكيفة وسائل الإعلام تدفق

Flow cytometry (FC) is the method of choice for semi-quantitative measurement of cell-surface antigen markers. Recently, this technique has been used for ...

Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

تنقية وتحليل Caenorhabditis elegans خارج الخلية الحويصلات

The secretion of small membrane-bound vesicles into the external environment is a fundamental physiological process of all cells. These extracellular ...

Nanoparticle Tracking Analysis for the Quantification and Size Determination of Extracellular Vesicles

تحليل تتبع الجسيمات النانوية لتحديد كمي وحجم الحويصلات خارج الخلية

The physiological and pathophysiological roles of extracellular vesicles (EVs) have become increasingly recognized, making the EV field a quickly evolving ...

Scalable Isolation and Purification of Extracellular Vesicles from Escherichia coli and Other Bacteria

Scalable Isolation and Purification of Extracellular Vesicles from Escherichia coli and Other Bacteria

عزل وتنقية الحويصلات خارج الخلية من الإشريكية القولونية والبكتيريا الأخرى قابلة للتطوير

Diverse bacterial species secrete ~20-300 nm extracellular vesicles (EVs), comprised of lipids, proteins, nucleic acids, glycans, and other molecules ...