Name: isolation and analysis of traceable and functionalized extracellular vesicles from the plasma and solid tissues
Uploaded: 2022-10-17T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Analysis of Traceable and Functionalized Extracellular Vesicles from the Plasma and Solid Tissues at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af tilskud fra National Natural Science Foundation of China (32000974, 81870796, 82170988 og 81930025) og China Postdoctoral Science Foundation (2019M663986 og BX20190380). Vi er taknemmelige for hjælpen fra National Experimental Teaching Demonstration Center for Basic Medicine (AMFU).

Dyreforsøgene blev udført i overensstemmelse med retningslinjerne fra Institutional Animal Care and Use Committee fra Fourth Military Medical University og ARRIVE-retningslinjerne. Til denne undersøgelse blev 8 uger gamle C57Bl/6-mus (ingen præference for hverken hunner eller hanner) anvendt. De trin, der er involveret i isolering af plasma- og vævs-EV'er, er illustreret i figur 1. Plasmaet tages som en repræsentant for at beskrive EV-isolationsproceduren fra kropsvæsker. Den maksill?...

<ol>
	<li>Abels, E. R., Breakefield, X. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introduction+to+extracellular+vesicles:+biogenesis,+RNA+cargo+selection,+content,+release,+and+uptake.">Introduction to extracellular vesicles: biogenesis, RNA cargo selection, content, release, and uptake.</a> Cellular and Molecular Neurobiology. 36 (3), 301-312 (2016).</li><li>Mathieu, M., Martin-Jaular, L., Lavieu, G., Th&#233;ry, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specificities+of+secretion+and+uptake+of+exosomes+and+other+extracellular+vesicles+for+cell-to-cell+communication.">Specificities of secretion and uptake of exosomes and other extracellular vesicles for cell-to-cell communication.</a> Nature Cell Biology. 21 (1), 9-17 (2019).</li><li>Van Niel, G., D'Angelo, G., Raposo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shedding+light+on+the+cell+biology+of+extracellular+vesicles.">Shedding light on the cell biology of extracellular vesicles.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (4), 213-228 (2018).</li><li>Witwer, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardization+of+sample+collection,+isolation+and+analysis+methods+in+extracellular+vesicle+research.">Standardization of sample collection, isolation and analysis methods in extracellular vesicle research.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 2 (1), 20360 (2013).</li><li>Keshtkar, S., Azarpira, N., Ghahremani, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cell-derived+extracellular+vesicles:+novel+frontiers+in+regenerative+medicine.">Mesenchymal stem cell-derived extracellular vesicles: novel frontiers in regenerative medicine.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 9 (1), 63 (2018).</li><li>Thietart, S., Rautou, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles+as+biomarkers+in+liver+diseases:+A+clinician's+point+of+view.">Extracellular vesicles as biomarkers in liver diseases: A clinician's point of view.</a> Journal of Hepatology. 73 (6), 1507-1525 (2020).</li><li>Xia, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Damaged+brain+accelerates+bone+healing+by+releasing+small+extracellular+vesicles+that+target+osteoprogenitors.">Damaged brain accelerates bone healing by releasing small extracellular vesicles that target osteoprogenitors.</a> Nature Communications. 12 (1), 6043 (2021).</li><li>In’t Veld, S. G. J. G., Wurdinger, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor-educated+pletelets.">Tumor-educated pletelets.</a> Blood. 133 (22), 2359-2364 (2019).</li><li>Schwager, S. C., Reinhart-King, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanobiology+of+microvesicle+release,+uptake,+and+microvesicle-mediated+activation.">Mechanobiology of microvesicle release, uptake, and microvesicle-mediated activation.</a> Current Topics in Membranes. 86, 255-278 (2020).</li><li>Brahmer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=endothelial+cells+and+leukocytes+contribute+to+the+exercise-triggered+release+of+extracellular+vesicles+into+the+circulation.">endothelial cells and leukocytes contribute to the exercise-triggered release of extracellular vesicles into the circulation.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 8 (1), 1615820 (2019).</li><li>Yang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood+collection+through+subclavian+vein+puncture+in+mice.">Blood collection through subclavian vein puncture in mice.</a> Journal of Visualized Experiments. (147), e59556 (2019).</li><li>Han, L., Lam, E. W., Sun, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles+in+the+tumor+microenvironment:+old+stories,+but+new+tales.">Extracellular vesicles in the tumor microenvironment: old stories, but new tales.</a> Molecular Cancer. 18 (1), 59 (2019).</li><li>Gelibter, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+storage+on+extracellular+vesicles:+A+systematic+study.">The impact of storage on extracellular vesicles: A systematic study.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 11 (2), 12162 (2022).</li><li>Forsyth, C. B., Mathews, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphocytes+utilize+CD11b/CD18+for+adhesion+to+Candida+albicans.">Lymphocytes utilize CD11b/CD18 for adhesion to Candida albicans.</a> Cellular Immunology. 170 (1), 91-100 (1996).</li><li>Kodama, J., Kaito, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoclast+multinucleation:+review+of+current+literature.">Osteoclast multinucleation: review of current literature.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (16), 5685 (2020).</li><li>Welsh, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MIFlowCyt-EV:+a+framework+for+standardized+reporting+of+extracellular+vesicle+flow+cytometry+experiments.">MIFlowCyt-EV: a framework for standardized reporting of extracellular vesicle flow cytometry experiments.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 9 (1), 1713526 (2020).</li><li>Durcin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterisation+of+adipocyte-derived+extracellular+vesicle+subtypes+identifies+distinct+protein+and+lipid+signatures+for+large+and+small+extracellular+vesicles.">Characterisation of adipocyte-derived extracellular vesicle subtypes identifies distinct protein and lipid signatures for large and small extracellular vesicles.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1305677 (2017).</li><li>Kowal, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+comparison+defines+novel+markers+to+characterize+heterogeneous+populations+of+extracellular+vesicle+subtypes.">Proteomic comparison defines novel markers to characterize heterogeneous populations of extracellular vesicle subtypes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (8), 968-977 (2016).</li><li>Noren Hooten, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+extracellular+vesicle+protein+cargo+with+race+and+clinical+markers+of+mortality.">Association of extracellular vesicle protein cargo with race and clinical markers of mortality.</a> Scientific Reports. 9 (1), 17582 (2019).</li><li>Sidhom, K., Obi, P. O., Saleem, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+exosomal+isolation+methods:+is+size+exclusion+chromatography+the+best+option.">A review of exosomal isolation methods: is size exclusion chromatography the best option.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (18), 6466 (2020).</li><li>Pietrowska, M., Wlosowicz, A., Gawin, M., Widlak, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MS-based+proteomic+analysis+of+serum+and+plasma:+problem+of+high+abundant+components+and+lights+and+shadows+of+albumin+removal.">MS-based proteomic analysis of serum and plasma: problem of high abundant components and lights and shadows of albumin removal.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 1073, 57-76 (2019).</li><li>Coumans, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methodological+guidelines+to+study+extracellular+vesicles.">Methodological guidelines to study extracellular vesicles.</a> Circulation Research. 120 (10), 1632-1648 (2017).</li><li>Th&#233;ry, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimal+information+for+studies+of+extracellular+vesicles+2018+(MISEV2018):+a+position+statement+of+the+International+Society+for+Extracellular+Vesicles+and+update+of+the+MISEV2014+guidelines.">Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).</li><li>Witwer, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardization+of+sample+collection,+isolation+and+analysis+methods+in+extracellular+vesicle+research.">Standardization of sample collection, isolation and analysis methods in extracellular vesicle research.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 2 (1), 20360 (2013).</li><li>Coumans, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methodological+guidelines+to+study+extracellular+vesicles.">Methodological guidelines to study extracellular vesicles.</a> Circulation Research. 120 (10), 1632-1648 (2017).</li><li>G&#246;rgens, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+storage+conditions+stabilizing+extracellular+vesicles+preparations.">Identification of storage conditions stabilizing extracellular vesicles preparations.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 11 (6), 12238 (2020).</li><li>Maroto, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+storage+temperature+on+airway+exosome+integrity+for+diagnostic+and+functional+analyses.">Effects of storage temperature on airway exosome integrity for diagnostic and functional analyses.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1359478 (2017).</li><li>Zheng, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoptotic+vesicles+restore+liver+macrophage+homeostasis+to+counteract+type+2+diabetes.">Apoptotic vesicles restore liver macrophage homeostasis to counteract type 2 diabetes.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 10 (7), 12109 (2021).</li><li>Liu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+apoptotic+bodies+maintain+mesenchymal+stem+cell+homeostasis+and+ameliorate+osteopenia+via+transferring+multiple+cellular+factors.">Circulating apoptotic bodies maintain mesenchymal stem cell homeostasis and ameliorate osteopenia via transferring multiple cellular factors.</a> Cell Research. 28 (9), 918-933 (2018).</li><li>Vander Pol, E., van Gemert, M. J., Sturk, A., Nieuwland, R., van Leeuwen, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+vs.+swarm+detection+of+microparticles+and+exosomes+by+flow+cytometry.">Single vs. swarm detection of microparticles and exosomes by flow cytometry.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 10 (5), 919-930 (2012).</li><li>Dawson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+lipid+rafts+(detergent-resistant+microdomains)+and+comparison+to+extracellular+vesicles+(exosomes).">Isolation of lipid rafts (detergent-resistant microdomains) and comparison to extracellular vesicles (exosomes).</a> Methods in Molecular Biology. 2187, 99-112 (2021).</li><li>Zhang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles:+Natural+liver-accumulating+drug+delivery+vehicles+for+the+treatment+of+liver+diseases.">Extracellular vesicles: Natural liver-accumulating drug delivery vehicles for the treatment of liver diseases.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 10 (2), 12030 (2020).</li><li>Vella, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rigorous+method+to+enrich+for+exosomes+from+brain+tissue.">A rigorous method to enrich for exosomes from brain tissue.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1348885 (2017).</li></ol>

Når man studerer elbilers funktioner, skæbne og funktion, er det afgørende at isolere elbiler med højt udbytte og lav forurening. Der findes forskellige metoder til ekstraktion af elbiler, såsom densitetsgradientcentrifugering (DGC), størrelsesekskluderingskromatografi (SEC) og immunocapture-assays 4,20. Her blev en af de mest almindeligt anvendte metoder, differentiel centrifugering, brugt; Fordelene ved dette er, at det ikke er tidskrævende, det generere...

Ekstracellulære vesikler (EV'er) er blevet foreslået til at definere cellefrigivne lipid-dobbeltlag-lukkede ekstracellulære strukturer1, som spiller vigtige roller i forskellige fysiologiske og patologiske hændelser2. EV'er frigivet af raske celler kan groft opdeles i to hovedkategorier, nemlig exosomer (eller små EV'er) dannet gennem en intracellulær endocytisk traffickingvej3 og mikrovesikler (eller store EV'er) udviklet ved udadgående spirende af plasmamembranen i cellen4. Mens mange undersøgelser fokuserer på funktionen af EV'er indsamlet fra dyrkede celler in vitro5, er EV'er afledt af cirkulationen eller væv mere komplekse og heterogene, hvilket har den fordel, at de afspejler organismens sande tilstand in vivo6. Desuden kan næsten alle former for væv producere EV'er in vivo , og disse EV'er kan fungere som budbringere i vævet eller overføres af forskellige kropsvæsker, især det perifere blod, for at lette systemisk kommunikation7. Elbiler i kredsløb og væv er også mål for sygdomsdiagnose og -behandling8.
Mens exosomer er blevet intensivt undersøgt i de senere år, har mikrovesikler også vigtige biologiske funktioner, som let kan ekstraheres uden ultracentrifugering, hvilket fremmer grundlæggende og klinisk forskning9. Især er et kritisk problem vedrørende elbiler, der er isoleret fra cirkulation og væv, at de stammer fra forskellige celletyper10. Da mikrovesikler blæses fra plasmamembranen og fremhæves af en overflod af celleoverflademolekyler9, er det muligt at bruge modercellemembranmarkører til at identificere den cellulære oprindelse af disse EV'er. Specifikt kan flowcytometriteknikken (FC) anvendes til at detektere membranmarkører. Desuden kan forskerne isolere elbilerne og lave yderligere analyser baseret på de funktionelle laster.
Denne protokol giver en grundig procedure til ekstraktion og karakterisering af elbiler fra in vivo-prøver. EV'erne isoleres via differentiel centrifugering, og karakteriseringen af EV'er inkluderer morfologisk identifikation via nanopartikelsporingsanalyse (NTA) og transmissionselektronmikroskopi (TEM), oprindelsesanalyse via FC og proteinlastanalyse via western blot. Blodplasma og maksillær knogle hos mus anvendes som repræsentanter. Forskere kan henvise til denne protokol for elbiler fra andre kilder og foretage tilsvarende ændringer.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>4% paraformaldehyde&#160;</td>
			<td>Biosharp</td>
			<td>143174</td>
			<td>Transmission electron microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa fluor 488 anti-goat secondary antibody</td>
			<td>Yeason</td>
			<td>34306ES60</td>
			<td>Flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa fluor 488 anti-rabbit secondary antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11008</td>
			<td>Flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD18 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab131044</td>
			<td>Flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD81 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab109201</td>
			<td>Western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD9 antibody</td>
			<td>Huabio</td>
			<td>ET1601-9</td>
			<td>Western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mitofilin antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab110329</td>
			<td>Western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APOA1 Rabbit pAb</td>
			<td>Abclone</td>
			<td>A14211</td>
			<td>Western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA protein assay kit</td>
			<td>TIANGEN</td>
			<td>PA115</td>
			<td>Western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BLUeye Prestained Protein Ladder</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>94964-500UL</td>
			<td>Western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>MP Biomedical</td>
			<td>218072801</td>
			<td>Western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caveolin-1 antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-53564</td>
			<td>Western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellMask Orange plasma membrane stain</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C10045</td>
			<td>Flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemiluminescence</td>
			<td>Amersham Biosciences</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved operating scissor</td>
			<td>JZ Surgical Instrument</td>
			<td>J21040</td>
			<td>EV isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electronic balance</td>
			<td>Zhi Ke</td>
			<td>ZK-DST</td>
			<td>EV isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epoch spectrophotometer</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3810X</td>
			<td>EV isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flotillin-1 antibody</td>
			<td>PTM BIO</td>
			<td>PTM-5369</td>
			<td>Western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel imaging system</td>
			<td>Tanon</td>
			<td>4600</td>
			<td>Western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Golgin84</td>
			<td>Novus</td>
			<td>nbp1-83352</td>
			<td>Western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grids - Formvar/Carbon Coated - Copper 200 mesh</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>24915</td>
			<td>Transmission electron microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin Solution</td>
			<td>StemCell&#160;</td>
			<td>7980</td>
			<td>EV isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liberase Research Grade</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>5401127001</td>
			<td>EV isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscopic tweezer</td>
			<td>JZ Surgical Instrument</td>
			<td>JD1020</td>
			<td>EV isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NovoCyte flow cytometer</td>
			<td>ACEA</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Omni-PAGE Hepes-Tris Gels Hepes 4~20%, 10 wells</td>
			<td>Epizyme</td>
			<td>LK206</td>
			<td>Western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OSCAR(D-19) antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>SC-34235</td>
			<td>Flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (2x)</td>
			<td>ZHHC</td>
			<td>PW013</td>
			<td>Western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pentobarbital sodium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>57-33-0</td>
			<td>Anesthetization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L)</td>
			<td>Jacson</td>
			<td>115-035-003</td>
			<td>Western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)</td>
			<td>Jacson</td>
			<td>111-035-003</td>
			<td>Western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphotungstic acid</td>
			<td>RHAWN</td>
			<td>12501-23-4</td>
			<td>Transmission electron microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PKM2(d78a4) xp rabbit&#160; mab&#160;</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>4053t</td>
			<td>Western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene (PE) film</td>
			<td>Xiang yi</td>
			<td>200150055</td>
			<td>Transmission electron microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyvinylidene fluoride membranes&#160;</td>
			<td>Roche</td>
			<td>3010040001</td>
			<td>Western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitors</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4693132001</td>
			<td>Western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant anti-PGD antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab129199</td>
			<td>Western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RIPA lysis buffer</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>P0013</td>
			<td>Western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS-PAGE loading buffer (5x)</td>
			<td>Cwbio</td>
			<td>CW0027S</td>
			<td>Western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Size beads</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>F13839</td>
			<td>Flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tabletop High-Speed Micro Centrifuges</td>
			<td>Hitachi</td>
			<td>CT15E</td>
			<td>EV isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transmission electron microscope</td>
			<td>HITACHI</td>
			<td>H-7650</td>
			<td>Transmission electron microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>19472</td>
			<td>Western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex Mixer Genie</td>
			<td>Scientific Industries</td>
			<td>SI0425</td>
			<td>EV isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZetaView BASIC NTA - Nanoparticle Tracking Video Microscope PMX-120</td>
			<td>Particle Metrix</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Nanoparticle tracking analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-Actinin-4 Rabbit mAb</td>
			<td>Abclone</td>
			<td>A3379</td>
			<td>Western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-actin</td>
			<td>Cwbio</td>
			<td>CW0096M</td>
			<td>Western blot</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and analysis of traceable and functionalized extracellular vesicles from the plasma and solid tissues

Cirkulerende og vævsresidente ekstracellulære vesikler (EV'er) repræsenterer lovende mål som nye teranostiske biomarkører, og de fremstår som vigtige aktører i vedligeholdelsen af organismens homeostase og progressionen af et bredt spektrum af sygdomme. Mens den nuværende forskning fokuserer på karakterisering af endogene eksosomer med den endosomale oprindelse, har mikrovesikler, der blebber fra plasmamembranen, fået stigende opmærksomhed inden for sundhed og sygdom, som er kendetegnet ved en overflod af overflademolekyler, der rekapitulerer membransignaturen af moderceller. Her præsenteres en reproducerbar procedure baseret på differentiel centrifugering til ekstraktion og karakterisering af EV'er fra plasma og fast væv, såsom knoglen. Protokollen beskriver yderligere efterfølgende profilering af overfladeantigener og proteinlaster af EV'er, som således kan spores for deres afledninger og identificeres med komponenter relateret til potentiel funktion. Denne metode vil være nyttig til korrelativ, funktionel og mekanistisk analyse af EV'er i biologiske, fysiologiske og patologiske undersøgelser.

Ifølge den eksperimentelle arbejdsgang kan EV'er ekstraheres fra perifert blod og fast væv (figur 1). Den maksillære knogle hos en mus i alderen 8 uger er ca. 0,1 ± 0,05 g, og ca. 300 μL plasma kan opsamles fra musen. Ved at følge protokoltrinnene kan der indsamles henholdsvis 0,3 mg og 3 μg elbiler. Som analyseret af TEM og NTA er de typiske morfologiske egenskaber ved EV'er runde kopformede membranvesikler med en diameter på 50-300 nm (figur 2). FC kan...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Analysis of Traceable and Functionalized Extracellular Vesicles from the Plasma and Solid Tissues at JoVE.com

Isolation and Analysis of Traceable and Functionalized Extracellular Vesicles from the Plasma and Solid Tissues

Denne protokol beskriver en metode til ekstraktion af ekstracellulære vesikler fra perifert blod og fast væv med efterfølgende profilering af overfladeantigener og proteinlaster.

Isolering og analyse af sporbare og funktionaliserede ekstracellulære vesikler fra plasma og fast væv

Circulating and tissue-resident extracellular vesicles (EVs) represent promising targets as novel theranostic biomarkers, and they emerge as important ...

Denne protokol giver en gennemførlig måde at isolere og indsamle de rigtige ekstracellulære vesikler fra de fleste blod og faste væv, især analysere deres kilde og proteinindholdet, hvilket hjælper yderligere funktionelle eksperimenter. Udover højt udbytte og lav forurening er den største fordel ved denne protokol analyse af overfladeantigener og proteinlaster af EV'er, hvilket er nyttigt til fysiologiske og patologiske undersøgelser. Det letter diagnosen kræft i sygdomme, såsom inflammatoriske sygdomme og osteoporose gennem påvisning af overflademarkører af forældreceller af ekstracellulære vesikler med et flowcytometer.Mængden af vævs ekstracellulære vesikel er kritisk for følgende eksperimenter. Sørg for, at koncentrationen af ekstracellulær vesikel ikke er høj. Vær tålmodig med at udføre fortyndingen.Til at begynde med skal du forberede de maksillære knogleprøver ved at isolere den maksillære knogle med oftalmisk pincet og saks og vaske dem med PBS for at slippe af med blødt væv med pincet. Sæt derefter den maksillære knogle i 1,5 ml centrifugerør og skær knoglen i små stykker på en millimeter i diameter med en saks. Tilsæt en vis mængde Liberase for at dække vævet og inkuber i 30 minutter ved 37 grader Celsius.Derefter centrifugeres prøven ved 800 G i 10 minutter ved fire grader Celsius, og supernatanten overføres forsigtigt med en pipette til et nyt og rent 1,5 ml centrifugeglas. Efter centrifugering af de tilberedte plasma- og knogleprøver i 15 minutter ved 2, 500 G og fire grader Celsius for at fjerne store cellerester og resterende blodplader overføres supernatanterne forsigtigt til nye og rene 1,5 ml centrifugeglas og centrifugeres ved 16.800 G i 30 minutter ved fire grader Celsius. Derefter kasseres supernatanten, og pellets i hvert glas opslæmmes med en milliliter PBS.Efter centrifugering og kassering af supernatanten som tidligere påvist resuspenderes pellets i hvert glas igen med 50 mikroliter PBS, og prøverne opbevares ved fire grader Celsius i mindre end 24 timer, eller de skal helst straks anvendes til analyserne. Resuspender prøver med 500 mikroliter PBS og overfør 50 mikroliter til et nyt og rent 1,5 ml centrifugerør som en blind kontrol mærket som rør A og yderligere 50 mikroliter til et andet rent 1,5 ml centrifugerør som et simpelt farvningsrør til FITC, mærket som rør B.Tilsæt 0,5 mikroliter membranfarvestof til det primære rør til membranfarvning under inkubation i fem minutter ved stuetemperatur. Efter centrifugering af primærrøret i 30 minutter ved 16.800 G og kassering af supernatanten resuspenderes pellets med 200 mikroliter PBS.Opdel hver 50 mikroliter prøve i fire 1,5 ml centrifugerør til enkle farvningsrør til PE mærket som rør C, overflademarkørfarvning mærket som rør D og sekundære antistofkontroller mærket som rør E.Tilføj det primære antistof af osteoklastassocierede receptor- og knogleekstracellulære vesikelprøver samt CD-18-antistof- og plasmaekstracellulære vesikelprøver til rør B og rør D separat, inkubation i en time ved fire grader Celsius. Glassene centrifugeres, supernatanten kasseres som tidligere vist, og pellets resuspenderes med 500 mikroliter PBS. Centrifuger igen i 30 minutter ved 16.800 G og fire grader Celsius for at fjerne de ekstra primære antistoffer.Efter kassering af supernatanten resuspenderes pellets med 50 mikroliter PBS, efterfulgt af tilsætning af FITC-konjugerede sekundære antistoffer i henholdsvis rør E.Alle reagensglas inkuberes i en time ved fire grader Celsius i mørke. Fortynd henholdsvis en dråbe 0,2, 0,5 og en mikrometer perlesuspension til en milliliter PBS. Kør derefter hver størrelse perler for at sikre dig porten valgt til ekstracellulære vesikler og indstil tærsklen for flowcytometeret for at søge efter perlerne og den ekstracellulære vesikelpopulation ved hjælp af en passende fremadrettet indvendig spredning.Indstil terminalbetingelsen som beregning af 100.000 membranfarvede partikler og analyser prøven via et flowcytometer som beskrevet i manuskriptet. Pellets resuspenderes i 50 mikroliter RIPA-lysis buffer og inkuberes i 30 minutter på is. For at kvantificere proteinkoncentrationerne af alle prøver i 96-brøndens mikroplade ved BCA-proteinanalysen fortyndes de to milligram pr. milliliter BSA med 0,9% normalt saltvand til 0,5 milligram pr. milliliter.Ved 0,5 milligram pr. milliliter BSA og 0,9% normalt saltvand i tre duplikerede brønde med visse mængder. Slip derefter to mikroliter af prøverne og tilsæt 18 mikroliter normalt saltvand i tre duplikerede brønde separat. Efter fremstilling af en arbejdsløsning ved at blande BCA-reagens A med reagens B tilsættes 200 mikroliter arbejdsløsning til hver brønd og rystes forsigtigt i 30 sekunder.Derefter inkuberes 96 brøndmikropladen i 20 til 25 minutter ved 37 grader Celsius og måler den optiske densitet ved 596 nanometer med spektrofotometeret. Derefter eksporteres dataene, tegner en standardkurve og beregner proteinkoncentrationen af prøverne. Ifølge resultaterne fortyndes prøverne til et mikrogram pr. Mikroliter med 0,9% normalt saltvand og fem gange koncentrationen af SDS-PAGE-belastningsbuffer og forsegles rørene med film tæt og opvarmes i fem minutter ved 100 grader Celsius.Læg prøverne i proteinstigen i en gradientkoncentration på fire til 20% HEPys trisgel. Kør gelen i løbebufferen ved 80 volt, indtil proteinerne danner en linje. Skift derefter til 120 volt i en time, indtil belastningsfarvestoffet er i bunden af gelen.Gelen overføres til polyvinylidenfluoridmembranen, der er præinkuberet i methylalkohol, i 20 sekunder ved hjælp af et vådoverførselssystem til overførsel i en time ved 200 milliampere. Forbered 5% BSA-blokerende buffer ved at tilsætte 2,5 gram BSA og 50 ml TBST i et 50 ml centrifugerør. Bloker membranerne i denne buffer i to timer ved stuetemperatur med omrøring.Inkuber membranerne med specifikke primære antistoffer fortyndet med TBST i korrekt koncentration natten over ved fire grader Celsius. Membranerne vaskes i vaskebufferen fire gange og inkuberes membranerne med egnede sekundære antistoffer i en time ved stuetemperatur under omrøring. Når du har vasket membranerne i vaskebufferen fire gange, skal du tage billeder af membranerne ved hjælp af kemiluminescenssættet i et gelbilleddannelsessystem.Transmissionselektronmikroskopien og nanopartikelsporingsanalysen afslørede, at de typiske morfologiske egenskaber ved ekstracellulære vesikler var runde og kopformede med en diameter på mellem 500 og 300 nanometer. Flowcytometrianalyse viser procentdelene af specifikke membranmarkører udtrykt på ekstracellulære vesikler, der indebærer deres oprindelse fra moderceller. Western blot-analyse viser ekspressionen af henholdsvis PGD og PKM2 som en repræsentant for proteinindhold og ekstracellulære plasmavesikler og knogleekstracellulære vesikler, hvilket indikerer metabolisk status.Negativ ekspression af Golgin-84 i ekstracellulære vesikler blev påvist med tilstedeværelsen af mitofilin, alfa-actinin-4, flotillin-1, caveolin-1 og beta-actin sammen med vesiklermarkør CD9, mens CD81-ekspression er lav eller fraværende med mangel på APO-A-1-eksistens i plasma-ekstracellulære vesikler. Forskere, så husk at trin 2.2, forberedelsen og fordøjelsen af vævsprøverne skal udføres tilstrækkeligt. Ellers er antallet af ekstracellulære vesikler ekstraheret fra vævene begrænset.Markøren mærket fluorescerende plet af de ekstracellulære vesikler kan injiceres i munden for at behandle den fase, der er knyttet til potentiel funktion.

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation and Analysis of Hematopoietic Stem Cells from the Placenta

Hematopoietic stem cells (HSCs) have the ability to self-renew and generate all cell types of the blood lineages throughout the lifetime of an individual. ...

Solid Phase Synthesis of a Functionalized Bis-Peptide Using "Safety Catch" Methodology

Fastfase-syntese af en funktionaliseret Bis-peptid ved anvendelse af &quot;sikkerheds&quot; Metode

In 1962, R.B. Merrifield published the first procedure using solid-phase peptide synthesis as a novel route to efficiently synthesize peptides. This ...

Techniques for the Analysis of Extracellular Vesicles Using Flow Cytometry

Teknikker til analyse af ekstracellulær Vesikler anvendelse af flowcytometri

Extracellular Vesicles (EVs) are small, membrane-derived vesicles found in bodily fluids that are highly involved in cell-cell communication and help ...

Enrichment of Extracellular Matrix Proteins from Tissues and Digestion into Peptides for Mass Spectrometry Analysis

Berigelse af ekstracellulære matrixproteiner fra væv og fordøjelse til peptider for massespektrometri Analyse

The extracellular matrix (ECM) is a complex meshwork of cross-linked proteins that provides biophysical and biochemical cues that are major regulators of ...

Analysis of Cell Suspensions Isolated from Solid Tissues by Spectral Flow Cytometry

Analyse af Cellesuspensioner isoleret fra Solid Væv af Spectral flowcytometri

Flow cytometry has been used for the past 40 years to define and analyze the phenotype of lymphoid and other hematopoietic cells. Initially restricted to ...

Flow Cytometric Analysis of Extracellular Vesicles from Cell-conditioned Media

Flow Cytometric analyse af ekstracellulære vesikler fra celle-aircondition medier

Flow cytometry (FC) is the method of choice for semi-quantitative measurement of cell-surface antigen markers. Recently, this technique has been used for ...

Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

Rensning og analyse af Caenorhabditis elegans Ekstracellulære Vesicles

The secretion of small membrane-bound vesicles into the external environment is a fundamental physiological process of all cells. These extracellular ...

Nanoparticle Tracking Analysis for the Quantification and Size Determination of Extracellular Vesicles

Nanopartikler Tracking Analyse for kvantificering og størrelse bestemmelse af ekstracellulære vesikler

The physiological and pathophysiological roles of extracellular vesicles (EVs) have become increasingly recognized, making the EV field a quickly evolving ...

Scalable Isolation and Purification of Extracellular Vesicles from Escherichia coli and Other Bacteria

Scalable Isolation and Purification of Extracellular Vesicles from Escherichia coli and Other Bacteria

Skalerbar isolering og oprensning af ekstracellulære vesikler fra Escherichia coli og andre bakterier

Diverse bacterial species secrete ~20-300 nm extracellular vesicles (EVs), comprised of lipids, proteins, nucleic acids, glycans, and other molecules ...