Name: isolation and analysis of traceable and functionalized extracellular vesicles from the plasma and solid tissues
Uploaded: 2022-10-17T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Analysis of Traceable and Functionalized Extracellular Vesicles from the Plasma and Solid Tissues at JoVE.com

Ce travail a été soutenu par des subventions de la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (32000974, 81870796, 82170988 et 81930025) et de la China Postdoctoral Science Foundation (2019M663986 et BX20190380). Nous sommes reconnaissants de l’aide du Centre national expérimental de démonstration de l’enseignement de la médecine de base (AMFU).

Les expériences sur les animaux ont été réalisées conformément aux lignes directrices du Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux de la quatrième Université médicale militaire et aux directives ARRIVE. Pour la présente étude, des souris C57Bl/6 âgées de 8 semaines (aucune préférence pour les femelles ou les mâles) ont été utilisées. Les étapes de l’isolement des VE plasmatiques et tissulaires sont illustrées à la figure 1. Le plasma est pris comme...

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	<li>Abels, E. R., Breakefield, X. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introduction+to+extracellular+vesicles:+biogenesis,+RNA+cargo+selection,+content,+release,+and+uptake.">Introduction to extracellular vesicles: biogenesis, RNA cargo selection, content, release, and uptake.</a> Cellular and Molecular Neurobiology. 36 (3), 301-312 (2016).</li><li>Mathieu, M., Martin-Jaular, L., Lavieu, G., Th&#233;ry, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specificities+of+secretion+and+uptake+of+exosomes+and+other+extracellular+vesicles+for+cell-to-cell+communication.">Specificities of secretion and uptake of exosomes and other extracellular vesicles for cell-to-cell communication.</a> Nature Cell Biology. 21 (1), 9-17 (2019).</li><li>Van Niel, G., D'Angelo, G., Raposo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shedding+light+on+the+cell+biology+of+extracellular+vesicles.">Shedding light on the cell biology of extracellular vesicles.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (4), 213-228 (2018).</li><li>Witwer, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardization+of+sample+collection,+isolation+and+analysis+methods+in+extracellular+vesicle+research.">Standardization of sample collection, isolation and analysis methods in extracellular vesicle research.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 2 (1), 20360 (2013).</li><li>Keshtkar, S., Azarpira, N., Ghahremani, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cell-derived+extracellular+vesicles:+novel+frontiers+in+regenerative+medicine.">Mesenchymal stem cell-derived extracellular vesicles: novel frontiers in regenerative medicine.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 9 (1), 63 (2018).</li><li>Thietart, S., Rautou, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles+as+biomarkers+in+liver+diseases:+A+clinician's+point+of+view.">Extracellular vesicles as biomarkers in liver diseases: A clinician's point of view.</a> Journal of Hepatology. 73 (6), 1507-1525 (2020).</li><li>Xia, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Damaged+brain+accelerates+bone+healing+by+releasing+small+extracellular+vesicles+that+target+osteoprogenitors.">Damaged brain accelerates bone healing by releasing small extracellular vesicles that target osteoprogenitors.</a> Nature Communications. 12 (1), 6043 (2021).</li><li>In’t Veld, S. G. J. G., Wurdinger, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor-educated+pletelets.">Tumor-educated pletelets.</a> Blood. 133 (22), 2359-2364 (2019).</li><li>Schwager, S. C., Reinhart-King, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanobiology+of+microvesicle+release,+uptake,+and+microvesicle-mediated+activation.">Mechanobiology of microvesicle release, uptake, and microvesicle-mediated activation.</a> Current Topics in Membranes. 86, 255-278 (2020).</li><li>Brahmer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=endothelial+cells+and+leukocytes+contribute+to+the+exercise-triggered+release+of+extracellular+vesicles+into+the+circulation.">endothelial cells and leukocytes contribute to the exercise-triggered release of extracellular vesicles into the circulation.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 8 (1), 1615820 (2019).</li><li>Yang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood+collection+through+subclavian+vein+puncture+in+mice.">Blood collection through subclavian vein puncture in mice.</a> Journal of Visualized Experiments. (147), e59556 (2019).</li><li>Han, L., Lam, E. W., Sun, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles+in+the+tumor+microenvironment:+old+stories,+but+new+tales.">Extracellular vesicles in the tumor microenvironment: old stories, but new tales.</a> Molecular Cancer. 18 (1), 59 (2019).</li><li>Gelibter, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+storage+on+extracellular+vesicles:+A+systematic+study.">The impact of storage on extracellular vesicles: A systematic study.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 11 (2), 12162 (2022).</li><li>Forsyth, C. B., Mathews, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphocytes+utilize+CD11b/CD18+for+adhesion+to+Candida+albicans.">Lymphocytes utilize CD11b/CD18 for adhesion to Candida albicans.</a> Cellular Immunology. 170 (1), 91-100 (1996).</li><li>Kodama, J., Kaito, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoclast+multinucleation:+review+of+current+literature.">Osteoclast multinucleation: review of current literature.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (16), 5685 (2020).</li><li>Welsh, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MIFlowCyt-EV:+a+framework+for+standardized+reporting+of+extracellular+vesicle+flow+cytometry+experiments.">MIFlowCyt-EV: a framework for standardized reporting of extracellular vesicle flow cytometry experiments.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 9 (1), 1713526 (2020).</li><li>Durcin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterisation+of+adipocyte-derived+extracellular+vesicle+subtypes+identifies+distinct+protein+and+lipid+signatures+for+large+and+small+extracellular+vesicles.">Characterisation of adipocyte-derived extracellular vesicle subtypes identifies distinct protein and lipid signatures for large and small extracellular vesicles.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1305677 (2017).</li><li>Kowal, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+comparison+defines+novel+markers+to+characterize+heterogeneous+populations+of+extracellular+vesicle+subtypes.">Proteomic comparison defines novel markers to characterize heterogeneous populations of extracellular vesicle subtypes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (8), 968-977 (2016).</li><li>Noren Hooten, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+extracellular+vesicle+protein+cargo+with+race+and+clinical+markers+of+mortality.">Association of extracellular vesicle protein cargo with race and clinical markers of mortality.</a> Scientific Reports. 9 (1), 17582 (2019).</li><li>Sidhom, K., Obi, P. O., Saleem, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+exosomal+isolation+methods:+is+size+exclusion+chromatography+the+best+option.">A review of exosomal isolation methods: is size exclusion chromatography the best option.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (18), 6466 (2020).</li><li>Pietrowska, M., Wlosowicz, A., Gawin, M., Widlak, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MS-based+proteomic+analysis+of+serum+and+plasma:+problem+of+high+abundant+components+and+lights+and+shadows+of+albumin+removal.">MS-based proteomic analysis of serum and plasma: problem of high abundant components and lights and shadows of albumin removal.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 1073, 57-76 (2019).</li><li>Coumans, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methodological+guidelines+to+study+extracellular+vesicles.">Methodological guidelines to study extracellular vesicles.</a> Circulation Research. 120 (10), 1632-1648 (2017).</li><li>Th&#233;ry, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimal+information+for+studies+of+extracellular+vesicles+2018+(MISEV2018):+a+position+statement+of+the+International+Society+for+Extracellular+Vesicles+and+update+of+the+MISEV2014+guidelines.">Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).</li><li>Witwer, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardization+of+sample+collection,+isolation+and+analysis+methods+in+extracellular+vesicle+research.">Standardization of sample collection, isolation and analysis methods in extracellular vesicle research.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 2 (1), 20360 (2013).</li><li>Coumans, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methodological+guidelines+to+study+extracellular+vesicles.">Methodological guidelines to study extracellular vesicles.</a> Circulation Research. 120 (10), 1632-1648 (2017).</li><li>G&#246;rgens, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+storage+conditions+stabilizing+extracellular+vesicles+preparations.">Identification of storage conditions stabilizing extracellular vesicles preparations.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 11 (6), 12238 (2020).</li><li>Maroto, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+storage+temperature+on+airway+exosome+integrity+for+diagnostic+and+functional+analyses.">Effects of storage temperature on airway exosome integrity for diagnostic and functional analyses.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1359478 (2017).</li><li>Zheng, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoptotic+vesicles+restore+liver+macrophage+homeostasis+to+counteract+type+2+diabetes.">Apoptotic vesicles restore liver macrophage homeostasis to counteract type 2 diabetes.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 10 (7), 12109 (2021).</li><li>Liu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+apoptotic+bodies+maintain+mesenchymal+stem+cell+homeostasis+and+ameliorate+osteopenia+via+transferring+multiple+cellular+factors.">Circulating apoptotic bodies maintain mesenchymal stem cell homeostasis and ameliorate osteopenia via transferring multiple cellular factors.</a> Cell Research. 28 (9), 918-933 (2018).</li><li>Vander Pol, E., van Gemert, M. J., Sturk, A., Nieuwland, R., van Leeuwen, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+vs.+swarm+detection+of+microparticles+and+exosomes+by+flow+cytometry.">Single vs. swarm detection of microparticles and exosomes by flow cytometry.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 10 (5), 919-930 (2012).</li><li>Dawson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+lipid+rafts+(detergent-resistant+microdomains)+and+comparison+to+extracellular+vesicles+(exosomes).">Isolation of lipid rafts (detergent-resistant microdomains) and comparison to extracellular vesicles (exosomes).</a> Methods in Molecular Biology. 2187, 99-112 (2021).</li><li>Zhang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles:+Natural+liver-accumulating+drug+delivery+vehicles+for+the+treatment+of+liver+diseases.">Extracellular vesicles: Natural liver-accumulating drug delivery vehicles for the treatment of liver diseases.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 10 (2), 12030 (2020).</li><li>Vella, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rigorous+method+to+enrich+for+exosomes+from+brain+tissue.">A rigorous method to enrich for exosomes from brain tissue.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1348885 (2017).</li></ol>

Lors de l’étude des caractéristiques, du devenir et de la fonction des véhicules électriques, il est crucial d’isoler les véhicules électriques à haut rendement et à faible contamination. Diverses méthodes existent pour extraire les VE, telles que la centrifugation par gradient de densité (DGC), la chromatographie d’exclusion de taille (SEC) et les tests d’immunocapture 4,20. Ici, l’une des méthodes les plus couramment utilisées, la centrifu...

Des vésicules extracellulaires (VE) ont été proposées pour définir les structures extracellulaires enfermées dans la bicouche lipidiquelibérée par les cellules 1, qui jouent un rôle important dans divers événements physiologiques et pathologiques2. Les VE libérés par les cellules saines peuvent être divisés en deux catégories principales, à savoir les exosomes (ou petits VE) formés par une voie de trafic endocytaire intracellulaire3 et les microvésicules (ou gros VE) développées par le bourgeonnement vers l’extérieur de la membrane plasmique de la cellule4. Alors que de nombreuses études portent sur la fonction des VE prélevés in vitrosur des cellules cultivées 5, les VE issus de la circulation ou des tissus sont plus complexes et hétérogènes, ce qui a l’avantage de refléter l’état réel de l’organisme in vivo6. En outre, presque tous les types de tissus peuvent produire des VE in vivo , et ces VE peuvent agir comme messagers dans le tissu ou être transférés par divers fluides corporels, en particulier le sang périphérique, pour faciliter la communication systémique7. Les VE dans la circulation et les tissus sont également des cibles pour le diagnostic et le traitement des maladies8.
Alors que les exosomes ont été intensivement étudiés ces dernières années, les microvésicules ont également des fonctions biologiques importantes, qui peuvent être facilement extraites sans ultracentrifugation, favorisant ainsi la recherche fondamentale et clinique9. Notamment, un problème critique concernant les VE isolés de la circulation et des tissus est qu’ils sont dérivés de différents types de cellules10. Étant donné que les microvésicules sont soufflées à partir de la membrane plasmique et caractérisées par une abondance de molécules de surface cellulaire9, il est possible d’utiliser des marqueurs membranaires cellulaires parents pour identifier l’origine cellulaire de ces VE. Plus précisément, la technique de cytométrie en flux (FC) peut être appliquée pour détecter les marqueurs membranaires. De plus, les chercheurs peuvent isoler les véhicules électriques et effectuer d’autres analyses en fonction des cargaisons fonctionnelles.
Le présent protocole prévoit une procédure rigoureuse pour extraire et caractériser les VE à partir d’échantillons in vivo. Les VE sont isolés par centrifugation différentielle, et la caractérisation des VE comprend l’identification morphologique par analyse de suivi des nanoparticules (NTA) et la microscopie électronique à transmission (MET), l’analyse d’origine par FC et l’analyse de la cargaison de protéines par transfert Western. Le plasma sanguin et l’os maxillaire des souris sont utilisés comme représentants. Les chercheurs peuvent se référer à ce protocole pour les VE provenant d’autres sources et apporter les modifications correspondantes.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>4% paraformaldehyde&#160;</td>
			<td>Biosharp</td>
			<td>143174</td>
			<td>Transmission electron microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa fluor 488 anti-goat secondary antibody</td>
			<td>Yeason</td>
			<td>34306ES60</td>
			<td>Flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa fluor 488 anti-rabbit secondary antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11008</td>
			<td>Flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD18 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab131044</td>
			<td>Flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD81 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab109201</td>
			<td>Western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD9 antibody</td>
			<td>Huabio</td>
			<td>ET1601-9</td>
			<td>Western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mitofilin antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab110329</td>
			<td>Western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APOA1 Rabbit pAb</td>
			<td>Abclone</td>
			<td>A14211</td>
			<td>Western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA protein assay kit</td>
			<td>TIANGEN</td>
			<td>PA115</td>
			<td>Western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BLUeye Prestained Protein Ladder</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>94964-500UL</td>
			<td>Western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>MP Biomedical</td>
			<td>218072801</td>
			<td>Western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caveolin-1 antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-53564</td>
			<td>Western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellMask Orange plasma membrane stain</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C10045</td>
			<td>Flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemiluminescence</td>
			<td>Amersham Biosciences</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved operating scissor</td>
			<td>JZ Surgical Instrument</td>
			<td>J21040</td>
			<td>EV isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electronic balance</td>
			<td>Zhi Ke</td>
			<td>ZK-DST</td>
			<td>EV isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epoch spectrophotometer</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3810X</td>
			<td>EV isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flotillin-1 antibody</td>
			<td>PTM BIO</td>
			<td>PTM-5369</td>
			<td>Western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel imaging system</td>
			<td>Tanon</td>
			<td>4600</td>
			<td>Western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Golgin84</td>
			<td>Novus</td>
			<td>nbp1-83352</td>
			<td>Western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grids - Formvar/Carbon Coated - Copper 200 mesh</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>24915</td>
			<td>Transmission electron microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin Solution</td>
			<td>StemCell&#160;</td>
			<td>7980</td>
			<td>EV isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liberase Research Grade</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>5401127001</td>
			<td>EV isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscopic tweezer</td>
			<td>JZ Surgical Instrument</td>
			<td>JD1020</td>
			<td>EV isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NovoCyte flow cytometer</td>
			<td>ACEA</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Omni-PAGE Hepes-Tris Gels Hepes 4~20%, 10 wells</td>
			<td>Epizyme</td>
			<td>LK206</td>
			<td>Western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OSCAR(D-19) antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>SC-34235</td>
			<td>Flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (2x)</td>
			<td>ZHHC</td>
			<td>PW013</td>
			<td>Western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pentobarbital sodium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>57-33-0</td>
			<td>Anesthetization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L)</td>
			<td>Jacson</td>
			<td>115-035-003</td>
			<td>Western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)</td>
			<td>Jacson</td>
			<td>111-035-003</td>
			<td>Western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphotungstic acid</td>
			<td>RHAWN</td>
			<td>12501-23-4</td>
			<td>Transmission electron microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PKM2(d78a4) xp rabbit&#160; mab&#160;</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>4053t</td>
			<td>Western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene (PE) film</td>
			<td>Xiang yi</td>
			<td>200150055</td>
			<td>Transmission electron microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyvinylidene fluoride membranes&#160;</td>
			<td>Roche</td>
			<td>3010040001</td>
			<td>Western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitors</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4693132001</td>
			<td>Western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant anti-PGD antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab129199</td>
			<td>Western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RIPA lysis buffer</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>P0013</td>
			<td>Western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS-PAGE loading buffer (5x)</td>
			<td>Cwbio</td>
			<td>CW0027S</td>
			<td>Western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Size beads</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>F13839</td>
			<td>Flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tabletop High-Speed Micro Centrifuges</td>
			<td>Hitachi</td>
			<td>CT15E</td>
			<td>EV isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transmission electron microscope</td>
			<td>HITACHI</td>
			<td>H-7650</td>
			<td>Transmission electron microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>19472</td>
			<td>Western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex Mixer Genie</td>
			<td>Scientific Industries</td>
			<td>SI0425</td>
			<td>EV isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZetaView BASIC NTA - Nanoparticle Tracking Video Microscope PMX-120</td>
			<td>Particle Metrix</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Nanoparticle tracking analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-Actinin-4 Rabbit mAb</td>
			<td>Abclone</td>
			<td>A3379</td>
			<td>Western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-actin</td>
			<td>Cwbio</td>
			<td>CW0096M</td>
			<td>Western blot</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and analysis of traceable and functionalized extracellular vesicles from the plasma and solid tissues

Les vésicules extracellulaires (VE) circulantes et résidentes dans les tissus représentent des cibles prometteuses en tant que nouveaux biomarqueurs théranostiques, et elles apparaissent comme des acteurs importants dans le maintien de l’homéostasie de l’organisme et la progression d’un large éventail de maladies. Alors que les recherches actuelles se concentrent sur la caractérisation des exosomes endogènes d’origine endosomale, les microvésicules qui s’échappent de la membrane plasmique ont attiré de plus en plus d’attention dans les domaines de la santé et de la maladie, qui se caractérisent par une abondance de molécules de surface récapitulant la signature membranaire des cellules mères. Ici, une procédure reproductible est présentée basée sur la centrifugation différentielle pour extraire et caractériser les VE du plasma et des tissus solides, tels que l’os. Le protocole décrit en outre le profilage ultérieur des antigènes de surface et des cargaisons protéiques des véhicules électriques, qui sont donc traçables pour leurs dérivations et identifiés avec des composants liés à la fonction potentielle. Cette méthode sera utile pour l’analyse corrélative, fonctionnelle et mécaniste des VE dans les études biologiques, physiologiques et pathologiques.

Selon le flux de travail expérimental, les VE peuvent être extraits du sang périphérique et des tissus solides (Figure 1). L’os maxillaire d’une souris âgée de 8 semaines est d’environ 0,1 ± 0,05 g, et environ 300 μL de plasma peuvent être prélevés sur la souris. En suivant les étapes du protocole, 0,3 mg et 3 μg de VE peuvent être collectés, respectivement. Comme analysé par TEM et NTA, les caractéristiques morphologiques typiques des VE sont des vésicules membranair...

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Isolation and Analysis of Traceable and Functionalized Extracellular Vesicles from the Plasma and Solid Tissues

Le présent protocole décrit une méthode pour extraire les vésicules extracellulaires du sang périphérique et des tissus solides avec profilage ultérieur des antigènes de surface et des cargaisons de protéines.

Isolement et analyse de vésicules extracellulaires traçables et fonctionnalisées à partir du plasma et des tissus solides

Circulating and tissue-resident extracellular vesicles (EVs) represent promising targets as novel theranostic biomarkers, and they emerge as important ...

Ce protocole fournit un moyen réalisable d’isoler et de collecter les bonnes vésicules extracellulaires de la plupart des tissus sanguins et solides, en particulier d’analyser leur source et leur contenu protéique, ce qui aide à poursuivre les expériences fonctionnelles. Outre un rendement élevé et une faible contamination, le principal avantage de ce protocole est l’analyse des antigènes de surface et des cargaisons de protéines des VE, ce qui est utile pour les études physiologiques et pathologiques. Il facilite le diagnostic des cancers de maladies, telles que les maladies inflammatoires et l’ostéoporose grâce à la détection de marqueurs de surface des cellules parentales des vésicules extracellulaires avec un cytomètre en flux.La quantité de vésicule extracellulaire tissulaire est critique pour les expériences suivantes. Assurez-vous que la concentration de vésicule extracellulaire n’est pas élevée. Soyez patient pour effectuer la dilution.Pour commencer, préparez les échantillons d’os maxillaire en isolant l’os maxillaire avec une pince à épiler et des ciseaux ophtalmiques et lavez-les avec du PBS pour vous débarrasser des tissus mous avec une pince à épiler. Ensuite, mettez l’os maxillaire dans des tubes centrifugés de 1,5 millilitre et coupez l’os en petits morceaux d’un millimètre de diamètre avec des ciseaux. Ajouter une certaine quantité de Liberase pour couvrir le tissu et incuber pendant 30 minutes à 37 degrés Celsius.Ensuite, centrifugez l’échantillon à 800 G pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius et transférez soigneusement le surnageant avec une pipette dans un tube centrifuge neuf et propre de 1,5 millilitre. Après avoir centrifugé les échantillons de plasma et d’os préparés pendant 15 minutes à 2 500 g et quatre degrés Celsius pour éliminer les gros débris cellulaires et les plaquettes restantes, transférer soigneusement les surnageants dans des tubes à centrifuger neufs et propres de 1,5 millilitre et centrifuger à 16 800 g pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius. Ensuite, jetez le surnageant et remettez en suspension les granulés dans chaque tube avec un millilitre de PBS.Après avoir centrifugé et jeté le surnageant comme démontré précédemment, encore une fois, remettre en suspension les pastilles dans chaque tube avec 50 microlitres de PBS et stocker ces échantillons à quatre degrés Celsius pendant moins de 24 heures ou de préférence les utiliser immédiatement pour les analyses. Resuspendre les échantillons avec 500 microlitres de PBS et transférer 50 microlitres dans un nouveau tube à centrifuger propre de 1,5 millilitre en tant que témoin vierge étiqueté comme tube A et 50 microlitres supplémentaires dans un autre tube centrifuge propre de 1,5 millilitre comme un simple tube de coloration pour FITC, étiqueté comme tube B.Ajouter 0,5 microlitre de colorant membranaire au tube primaire pour la coloration de la membrane tout en incubant pendant cinq minutes à température ambiante. Après avoir centrifugé le tube primaire pendant 30 minutes à 16 800 G et jeté le surnageant, remettre les pastilles en suspension avec 200 microlitres de PBS.Diviser chaque échantillon de 50 microlitres en quatre tubes centrifugés de 1,5 millilitre pour les tubes de coloration simples pour le PE étiqueté comme tube C, la coloration de marqueur de surface étiquetée comme tube D et les témoins d’anticorps secondaires marqués comme tube E.Ajouter l’anticorps primaire des échantillons de récepteurs associés aux ostéoclastes et aux vésicules extracellulaires osseuses ainsi que les échantillons d’anticorps CD-18 et de vésicules extracellulaires plasmatiques au tube B et au tube D séparément, incubation pendant une heure à quatre degrés Celsius. Centrifuger les tubes et jeter le surnageant comme démontré précédemment et remettre les pastilles en suspension avec 500 microlitres de PBS. Encore une fois, centrifuger pendant 30 minutes à 16, 800 G et quatre degrés Celsius pour éliminer les anticorps primaires supplémentaires.Après avoir jeté le surnageant, remettez les pastilles en suspension avec 50 microlitres de PBS, puis ajoutez respectivement des anticorps secondaires conjugués FITC dans le tube E.Incuber tous les tubes pendant une heure à quatre degrés Celsius dans l’obscurité. Diluer une goutte de suspension de billes de 0,2, 0,5 et un micromètre respectivement dans un millilitre de PBS. Ensuite, exécutez chaque taille de billes pour vous assurer de la porte choisie pour les vésicules extracellulaires et réglez le seuil du cytomètre en flux pour rechercher les billes et la population de vésicules extracellulaires à l’aide d’une dispersion interne appropriée.Définissez l’état terminal comme calculant 100 000 particules colorées sur membrane et analysez l’échantillon via un cytomètre en flux comme décrit dans le manuscrit. Remettez les pastilles en suspension dans 50 microlitres de tampon de lyse RIPA et incuber pendant 30 minutes sur de la glace. Pour quantifier les concentrations de protéines de tous les échantillons dans la microplaque à 96 puits par le dosage des protéines BCA, diluer les deux milligrammes par millilitre de BSA avec 0,9% de solution saline normale dans 0,5 milligrammes par millilitre.À 0,5 milligramme par millilitre de BSA et 0,9% de solution saline normale dans trois puits dupliqués avec certains volumes. Ensuite, déposez deux microlitres des échantillons et ajoutez 18 microlitres de solution saline normale dans trois puits dupliqués séparément. Après avoir préparé une solution de travail en mélangeant le réactif BCA A avec le réactif B, ajoutez 200 microlitres de la solution de travail à chaque puits et agitez doucement pendant 30 secondes.Incuber ensuite la microplaque de 96 puits pendant 20 à 25 minutes à 37 degrés Celsius et mesurer la densité optique à 596 nanomètres avec le spectrophotomètre. Ensuite, exportez les données, tracez une courbe standard et calculez la concentration en protéines des échantillons. Selon les résultats, diluer les échantillons à un microgramme par microlitre avec 0,9% de solution saline normale et cinq fois la concentration du tampon de chargement SDS-PAGE et sceller hermétiquement les tubes avec un film et chauffer pendant cinq minutes à 100 degrés Celsius.Chargez les échantillons dans l’échelle des protéines dans une concentration de gradient de quatre à 20% du tris gel de HEPy. Faites passer le gel dans le tampon courant à 80 volts jusqu’à ce que les protéines forment une ligne. Ensuite, passez à 120 volts pendant une heure jusqu’à ce que le colorant de chargement soit au fond du gel.Transférer le gel sur la membrane de fluorure de polyvinylidène pré-incubée dans de l’alcool méthylique pendant 20 secondes à l’aide d’un système de transfert humide pour transférer pendant une heure à 200 milliampères. Préparez un tampon de blocage à 5% BSA en ajoutant 2,5 grammes de BSA et 50 millilitres de TBST dans un tube à centrifuger de 50 millilitres. Bloquer les membranes dans ce tampon pendant deux heures à température ambiante avec agitation.Incuber les membranes avec des anticorps primaires spécifiques dilués avec TBST à une concentration appropriée pendant la nuit à quatre degrés Celsius. Laver les membranes dans le tampon de lavage quatre fois et incuber les membranes avec des anticorps secondaires appropriés pendant une heure à température ambiante avec agitation. Après avoir lavé les membranes dans le tampon de lavage quatre fois, imagez les membranes à l’aide du kit de chimiluminescence dans un système d’imagerie par gel.L’analyse de la microscopie électronique à transmission et du suivi des nanoparticules a révélé que les caractéristiques morphologiques typiques des vésicules extracellulaires étaient rondes et en forme de coupe avec un diamètre allant de 500 à 300 nanomètres. L’analyse par cytométrie de flux montre les pourcentages de marqueurs membranaires spécifiques exprimés sur les vésicules extracellulaires, ce qui implique leur origine à partir des cellules mères. L’analyse par transfert Western montre l’expression du DPI et de la PKM2 respectivement comme représentative de la teneur en protéines et des vésicules extracellulaires plasmatiques et des vésicules extracellulaires osseuses, indiquant l’état métabolique.L’expression négative de Golgin-84 dans les vésicules extracellulaires a été détectée avec la présence de mitofiline, d’alpha-actinine-4, de flottilline-1, de caveolin-1 et de bêta-actine, ainsi que du marqueur CD9 des vésicules, tandis que l’expression de CD81 est faible ou absente avec un manque d’existence d’APO-A-1 dans les vésicules extracellulaires plasmatiques. Les chercheurs, en gardant à l’esprit que l’étape 2.2, la préparation et la digestion des échantillons de tissus doivent être effectuées suffisamment. Sinon, le nombre de vésicules extracellulaires extracellulaires extraites des tissus est limité.Le marqueur marqué par coloration fluorescente des vésicules extracellulaires peut être injecté dans la bouche pour traiter la phase liée à la fonction potentielle.

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation and Analysis of Hematopoietic Stem Cells from the Placenta

Isolement et analyse de cellules souches hématopoïétiques à partir du placenta

Hematopoietic stem cells (HSCs) have the ability to self-renew and generate all cell types of the blood lineages throughout the lifetime of an individual. ...

Recherche

Biologie

Solid Phase Synthesis of a Functionalized Bis-Peptide Using "Safety Catch" Methodology

Synthèse en phase solide d&#39;un bis-fonctionnalisé peptide en utilisant &quot;Sécurité Catch&quot; Méthodologie

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Techniques for the Analysis of Extracellular Vesicles Using Flow Cytometry

Techniques pour l&#39;analyse des vésicules extracellulaire par cytométrie en flux

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Enrichment of Extracellular Matrix Proteins from Tissues and Digestion into Peptides for Mass Spectrometry Analysis

Enrichissement de matrice extracellulaire de protéines à partir de tissus et la digestion en peptides pour l&#39;analyse de spectrométrie de masse

The extracellular matrix (ECM) is a complex meshwork of cross-linked proteins that provides biophysical and biochemical cues that are major regulators of ...

Analysis of Cell Suspensions Isolated from Solid Tissues by Spectral Flow Cytometry

Analyse des suspensions de cellules isolées de tissus solides par Spectral cytométrie en flux

Flow cytometry has been used for the past 40 years to define and analyze the phenotype of lymphoid and other hematopoietic cells. Initially restricted to ...

Flow Cytometric Analysis of Extracellular Vesicles from Cell-conditioned Media

Analyse par cytométrie en flux de vésicules extracellulaires de médias conditionné par cellule d’écoulement

Flow cytometry (FC) is the method of choice for semi-quantitative measurement of cell-surface antigen markers. Recently, this technique has been used for ...

Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

Purification et analyse de Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

The secretion of small membrane-bound vesicles into the external environment is a fundamental physiological process of all cells. These extracellular ...

Nanoparticle Tracking Analysis for the Quantification and Size Determination of Extracellular Vesicles

Analyse de suivi des nanoparticules pour la quantification et la détermination de la taille des vésicules extracellulaires

The physiological and pathophysiological roles of extracellular vesicles (EVs) have become increasingly recognized, making the EV field a quickly evolving ...

Scalable Isolation and Purification of Extracellular Vesicles from Escherichia coli and Other Bacteria

Scalable Isolation and Purification of Extracellular Vesicles from Escherichia coli and Other Bacteria

Isolement et purification évolutifs de vésicules extracellulaires à partir d’Escherichia coli et d’autres bactéries

Diverse bacterial species secrete ~20-300 nm extracellular vesicles (EVs), comprised of lipids, proteins, nucleic acids, glycans, and other molecules ...