Name: isolation and analysis of traceable and functionalized extracellular vesicles from the plasma and solid tissues
Uploaded: 2022-10-17T14:00:00
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Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse der National Natural Science Foundation of China (32000974, 81870796, 82170988 und 81930025) und der China Postdoctoral Science Foundation (2019M663986 und BX20190380) unterstützt. Wir sind dankbar für die Unterstützung des National Experimental Teaching Demonstration Center for Basic Medicine (AMFU).

Die Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien des Komitees für institutionelle Tierpflege und -nutzung der Vierten Militärmedizinischen Universität und den ARRIVE-Richtlinien durchgeführt. Für die vorliegende Studie wurden 8 Wochen alte C57Bl/6-Mäuse (keine Präferenz für Weibchen oder Männchen) verwendet. Die Schritte zur Isolierung von Plasma- und Gewebe-EVs sind in Abbildung 1 dargestellt. Das Plasma wird als Repräsentant herangezogen, um das Verfahren zur Isoli...

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	<li>Abels, E. R., Breakefield, X. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introduction+to+extracellular+vesicles:+biogenesis,+RNA+cargo+selection,+content,+release,+and+uptake.">Introduction to extracellular vesicles: biogenesis, RNA cargo selection, content, release, and uptake.</a> Cellular and Molecular Neurobiology. 36 (3), 301-312 (2016).</li><li>Mathieu, M., Martin-Jaular, L., Lavieu, G., Th&#233;ry, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specificities+of+secretion+and+uptake+of+exosomes+and+other+extracellular+vesicles+for+cell-to-cell+communication.">Specificities of secretion and uptake of exosomes and other extracellular vesicles for cell-to-cell communication.</a> Nature Cell Biology. 21 (1), 9-17 (2019).</li><li>Van Niel, G., D'Angelo, G., Raposo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shedding+light+on+the+cell+biology+of+extracellular+vesicles.">Shedding light on the cell biology of extracellular vesicles.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (4), 213-228 (2018).</li><li>Witwer, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardization+of+sample+collection,+isolation+and+analysis+methods+in+extracellular+vesicle+research.">Standardization of sample collection, isolation and analysis methods in extracellular vesicle research.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 2 (1), 20360 (2013).</li><li>Keshtkar, S., Azarpira, N., Ghahremani, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cell-derived+extracellular+vesicles:+novel+frontiers+in+regenerative+medicine.">Mesenchymal stem cell-derived extracellular vesicles: novel frontiers in regenerative medicine.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 9 (1), 63 (2018).</li><li>Thietart, S., Rautou, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles+as+biomarkers+in+liver+diseases:+A+clinician's+point+of+view.">Extracellular vesicles as biomarkers in liver diseases: A clinician's point of view.</a> Journal of Hepatology. 73 (6), 1507-1525 (2020).</li><li>Xia, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Damaged+brain+accelerates+bone+healing+by+releasing+small+extracellular+vesicles+that+target+osteoprogenitors.">Damaged brain accelerates bone healing by releasing small extracellular vesicles that target osteoprogenitors.</a> Nature Communications. 12 (1), 6043 (2021).</li><li>In’t Veld, S. G. J. G., Wurdinger, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor-educated+pletelets.">Tumor-educated pletelets.</a> Blood. 133 (22), 2359-2364 (2019).</li><li>Schwager, S. C., Reinhart-King, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanobiology+of+microvesicle+release,+uptake,+and+microvesicle-mediated+activation.">Mechanobiology of microvesicle release, uptake, and microvesicle-mediated activation.</a> Current Topics in Membranes. 86, 255-278 (2020).</li><li>Brahmer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=endothelial+cells+and+leukocytes+contribute+to+the+exercise-triggered+release+of+extracellular+vesicles+into+the+circulation.">endothelial cells and leukocytes contribute to the exercise-triggered release of extracellular vesicles into the circulation.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 8 (1), 1615820 (2019).</li><li>Yang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood+collection+through+subclavian+vein+puncture+in+mice.">Blood collection through subclavian vein puncture in mice.</a> Journal of Visualized Experiments. (147), e59556 (2019).</li><li>Han, L., Lam, E. W., Sun, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles+in+the+tumor+microenvironment:+old+stories,+but+new+tales.">Extracellular vesicles in the tumor microenvironment: old stories, but new tales.</a> Molecular Cancer. 18 (1), 59 (2019).</li><li>Gelibter, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+storage+on+extracellular+vesicles:+A+systematic+study.">The impact of storage on extracellular vesicles: A systematic study.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 11 (2), 12162 (2022).</li><li>Forsyth, C. B., Mathews, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphocytes+utilize+CD11b/CD18+for+adhesion+to+Candida+albicans.">Lymphocytes utilize CD11b/CD18 for adhesion to Candida albicans.</a> Cellular Immunology. 170 (1), 91-100 (1996).</li><li>Kodama, J., Kaito, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoclast+multinucleation:+review+of+current+literature.">Osteoclast multinucleation: review of current literature.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (16), 5685 (2020).</li><li>Welsh, J. 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O., Saleem, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+exosomal+isolation+methods:+is+size+exclusion+chromatography+the+best+option.">A review of exosomal isolation methods: is size exclusion chromatography the best option.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (18), 6466 (2020).</li><li>Pietrowska, M., Wlosowicz, A., Gawin, M., Widlak, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MS-based+proteomic+analysis+of+serum+and+plasma:+problem+of+high+abundant+components+and+lights+and+shadows+of+albumin+removal.">MS-based proteomic analysis of serum and plasma: problem of high abundant components and lights and shadows of albumin removal.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 1073, 57-76 (2019).</li><li>Coumans, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methodological+guidelines+to+study+extracellular+vesicles.">Methodological guidelines to study extracellular vesicles.</a> Circulation Research. 120 (10), 1632-1648 (2017).</li><li>Th&#233;ry, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimal+information+for+studies+of+extracellular+vesicles+2018+(MISEV2018):+a+position+statement+of+the+International+Society+for+Extracellular+Vesicles+and+update+of+the+MISEV2014+guidelines.">Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).</li><li>Witwer, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardization+of+sample+collection,+isolation+and+analysis+methods+in+extracellular+vesicle+research.">Standardization of sample collection, isolation and analysis methods in extracellular vesicle research.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 2 (1), 20360 (2013).</li><li>Coumans, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methodological+guidelines+to+study+extracellular+vesicles.">Methodological guidelines to study extracellular vesicles.</a> Circulation Research. 120 (10), 1632-1648 (2017).</li><li>G&#246;rgens, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+storage+conditions+stabilizing+extracellular+vesicles+preparations.">Identification of storage conditions stabilizing extracellular vesicles preparations.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 11 (6), 12238 (2020).</li><li>Maroto, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+storage+temperature+on+airway+exosome+integrity+for+diagnostic+and+functional+analyses.">Effects of storage temperature on airway exosome integrity for diagnostic and functional analyses.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1359478 (2017).</li><li>Zheng, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoptotic+vesicles+restore+liver+macrophage+homeostasis+to+counteract+type+2+diabetes.">Apoptotic vesicles restore liver macrophage homeostasis to counteract type 2 diabetes.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 10 (7), 12109 (2021).</li><li>Liu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+apoptotic+bodies+maintain+mesenchymal+stem+cell+homeostasis+and+ameliorate+osteopenia+via+transferring+multiple+cellular+factors.">Circulating apoptotic bodies maintain mesenchymal stem cell homeostasis and ameliorate osteopenia via transferring multiple cellular factors.</a> Cell Research. 28 (9), 918-933 (2018).</li><li>Vander Pol, E., van Gemert, M. J., Sturk, A., Nieuwland, R., van Leeuwen, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+vs.+swarm+detection+of+microparticles+and+exosomes+by+flow+cytometry.">Single vs. swarm detection of microparticles and exosomes by flow cytometry.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 10 (5), 919-930 (2012).</li><li>Dawson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+lipid+rafts+(detergent-resistant+microdomains)+and+comparison+to+extracellular+vesicles+(exosomes).">Isolation of lipid rafts (detergent-resistant microdomains) and comparison to extracellular vesicles (exosomes).</a> Methods in Molecular Biology. 2187, 99-112 (2021).</li><li>Zhang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles:+Natural+liver-accumulating+drug+delivery+vehicles+for+the+treatment+of+liver+diseases.">Extracellular vesicles: Natural liver-accumulating drug delivery vehicles for the treatment of liver diseases.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 10 (2), 12030 (2020).</li><li>Vella, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rigorous+method+to+enrich+for+exosomes+from+brain+tissue.">A rigorous method to enrich for exosomes from brain tissue.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1348885 (2017).</li></ol>

Bei der Untersuchung der Merkmale, des Verbleibs und der Funktion von Elektrofahrzeugen ist es von entscheidender Bedeutung, Elektrofahrzeuge mit hoher Ausbeute und geringer Kontamination zu isolieren. Es gibt verschiedene Methoden zur Extraktion von EVs, wie z. B. Dichtegradientenzentrifugation (DGC), Größenausschlusschromatographie (SEC) und Immunocapture-Assays 4,20. Hier kam eine der am häufigsten verwendeten Methoden, die Differentialzentrifugation, zum E...

Extrazelluläre Vesikel (EVs) wurden vorgeschlagen, um zellfreigesetzte Lipiddoppelschicht-eingeschlossene extrazelluläre Strukturenzu definieren 1, die eine wichtige Rolle bei verschiedenen physiologischen und pathologischen Ereignissenspielen 2. EVs, die von gesunden Zellen freigesetzt werden, können grob in zwei Hauptkategorien unterteilt werden, nämlich Exosomen (oder kleine EVs), die durch einen intrazellulären endozytären Transportweg3 gebildet werden, und Mikrovesikel (oder große EVs), die durch die nach außen gerichtete Knospung der Plasmamembran der Zelle4 entstehen. Während sich viele Studien auf die Funktion von EVs konzentrieren, die aus kultivierten Zellen in vitro5 gewonnen wurden, sind EVs, die aus dem Kreislauf oder Gewebe stammen, komplexer und heterogener, was den Vorteil hat, dass sie den wahren Zustand des Organismus in vivo widerspiegeln 6. Darüber hinaus können fast alle Arten von Geweben EVs in vivo produzieren, und diese EVs können als Botenstoffe innerhalb des Gewebes fungieren oder von verschiedenen Körperflüssigkeiten, insbesondere dem peripheren Blut, übertragen werden, um die systemische Kommunikation zu erleichtern7. EVs im Kreislauf und im Gewebe sind auch Ziele für die Diagnose und Behandlung von Krankheiten8.
Während Exosomen in den letzten Jahren intensiv erforscht wurden, haben Mikrovesikel auch wichtige biologische Funktionen, die ohne Ultrazentrifugation leicht extrahiert werden können und so die Grundlagen- und klinische Forschung fördern9. Ein kritisches Problem in Bezug auf EVs, die aus dem Kreislauf und dem Gewebe isoliert wurden, besteht darin, dass sie von verschiedenen Zelltypen stammen10. Da Mikrovesikel von der Plasmamembran abgeblasen werden und durch eine Fülle von Zelloberflächenmolekülen9 gekennzeichnet sind, ist die Verwendung von Markern für die Mutterzellmembran zur Identifizierung des zellulären Ursprungs dieser EVs möglich. Insbesondere kann die Technik der Durchflusszytometrie (FC) zum Nachweis von Membranmarkern eingesetzt werden. Darüber hinaus können die Forscher die Elektrofahrzeuge isolieren und weitere Analysen auf der Grundlage der funktionalen Ladungen durchführen.
Das vorliegende Protokoll bietet ein gründliches Verfahren zur Extraktion und Charakterisierung von EVs aus in vivo Proben. Die EVs werden mittels Differentialzentrifugation isoliert, und die Charakterisierung der EVs umfasst die morphologische Identifizierung mittels Nanopartikel-Tracking-Analyse (NTA) und Transmissionselektronenmikroskopie (TEM), Herkunftsanalyse mittels FC und Proteinfrachtanalyse mittels Western Blot. Das Blutplasma und der Oberkieferknochen von Mäusen werden als Repräsentanten verwendet. Forscher können auf dieses Protokoll für Elektrofahrzeuge aus anderen Quellen zurückgreifen und entsprechende Änderungen vornehmen.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>4% paraformaldehyde&#160;</td>
			<td>Biosharp</td>
			<td>143174</td>
			<td>Transmission electron microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa fluor 488 anti-goat secondary antibody</td>
			<td>Yeason</td>
			<td>34306ES60</td>
			<td>Flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa fluor 488 anti-rabbit secondary antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11008</td>
			<td>Flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD18 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab131044</td>
			<td>Flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD81 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab109201</td>
			<td>Western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD9 antibody</td>
			<td>Huabio</td>
			<td>ET1601-9</td>
			<td>Western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mitofilin antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab110329</td>
			<td>Western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APOA1 Rabbit pAb</td>
			<td>Abclone</td>
			<td>A14211</td>
			<td>Western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA protein assay kit</td>
			<td>TIANGEN</td>
			<td>PA115</td>
			<td>Western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BLUeye Prestained Protein Ladder</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>94964-500UL</td>
			<td>Western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>MP Biomedical</td>
			<td>218072801</td>
			<td>Western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caveolin-1 antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-53564</td>
			<td>Western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellMask Orange plasma membrane stain</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C10045</td>
			<td>Flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemiluminescence</td>
			<td>Amersham Biosciences</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved operating scissor</td>
			<td>JZ Surgical Instrument</td>
			<td>J21040</td>
			<td>EV isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electronic balance</td>
			<td>Zhi Ke</td>
			<td>ZK-DST</td>
			<td>EV isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epoch spectrophotometer</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3810X</td>
			<td>EV isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flotillin-1 antibody</td>
			<td>PTM BIO</td>
			<td>PTM-5369</td>
			<td>Western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel imaging system</td>
			<td>Tanon</td>
			<td>4600</td>
			<td>Western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Golgin84</td>
			<td>Novus</td>
			<td>nbp1-83352</td>
			<td>Western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grids - Formvar/Carbon Coated - Copper 200 mesh</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>24915</td>
			<td>Transmission electron microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin Solution</td>
			<td>StemCell&#160;</td>
			<td>7980</td>
			<td>EV isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liberase Research Grade</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>5401127001</td>
			<td>EV isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscopic tweezer</td>
			<td>JZ Surgical Instrument</td>
			<td>JD1020</td>
			<td>EV isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NovoCyte flow cytometer</td>
			<td>ACEA</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Omni-PAGE Hepes-Tris Gels Hepes 4~20%, 10 wells</td>
			<td>Epizyme</td>
			<td>LK206</td>
			<td>Western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OSCAR(D-19) antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>SC-34235</td>
			<td>Flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (2x)</td>
			<td>ZHHC</td>
			<td>PW013</td>
			<td>Western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pentobarbital sodium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>57-33-0</td>
			<td>Anesthetization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L)</td>
			<td>Jacson</td>
			<td>115-035-003</td>
			<td>Western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)</td>
			<td>Jacson</td>
			<td>111-035-003</td>
			<td>Western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphotungstic acid</td>
			<td>RHAWN</td>
			<td>12501-23-4</td>
			<td>Transmission electron microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PKM2(d78a4) xp rabbit&#160; mab&#160;</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>4053t</td>
			<td>Western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene (PE) film</td>
			<td>Xiang yi</td>
			<td>200150055</td>
			<td>Transmission electron microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyvinylidene fluoride membranes&#160;</td>
			<td>Roche</td>
			<td>3010040001</td>
			<td>Western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitors</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4693132001</td>
			<td>Western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant anti-PGD antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab129199</td>
			<td>Western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RIPA lysis buffer</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>P0013</td>
			<td>Western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS-PAGE loading buffer (5x)</td>
			<td>Cwbio</td>
			<td>CW0027S</td>
			<td>Western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Size beads</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>F13839</td>
			<td>Flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tabletop High-Speed Micro Centrifuges</td>
			<td>Hitachi</td>
			<td>CT15E</td>
			<td>EV isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transmission electron microscope</td>
			<td>HITACHI</td>
			<td>H-7650</td>
			<td>Transmission electron microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>19472</td>
			<td>Western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex Mixer Genie</td>
			<td>Scientific Industries</td>
			<td>SI0425</td>
			<td>EV isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZetaView BASIC NTA - Nanoparticle Tracking Video Microscope PMX-120</td>
			<td>Particle Metrix</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Nanoparticle tracking analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-Actinin-4 Rabbit mAb</td>
			<td>Abclone</td>
			<td>A3379</td>
			<td>Western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-actin</td>
			<td>Cwbio</td>
			<td>CW0096M</td>
			<td>Western blot</td>
		</tr>
	</tbody>
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isolation and analysis of traceable and functionalized extracellular vesicles from the plasma and solid tissues

Zirkulierende und geweberesidente extrazelluläre Vesikel (EVs) stellen vielversprechende Ziele als neuartige theranostische Biomarker dar und erweisen sich als wichtige Akteure bei der Aufrechterhaltung der organismischen Homöostase und dem Fortschreiten eines breiten Spektrums von Krankheiten. Während sich die aktuelle Forschung auf die Charakterisierung endogener Exosomen mit endosomalem Ursprung konzentriert, haben Mikrovesikel, die aus der Plasmamembran blähen, zunehmend an Aufmerksamkeit in den Bereichen Gesundheit und Krankheit gewonnen, die sich durch eine Fülle von Oberflächenmolekülen auszeichnen, die die Membransignatur von Elternzellen rekapitulieren. In dieser Arbeit wird ein reproduzierbares Verfahren vorgestellt, das auf der Differentialzentrifugation basiert, um EVs aus dem Plasma und festen Geweben, wie z.B. dem Knochen, zu extrahieren und zu charakterisieren. Das Protokoll beschreibt darüber hinaus die anschließende Profilierung von Oberflächenantigenen und Proteinladungen von EVs, die somit auf ihre Ableitungen zurückgeführt und mit Komponenten identifiziert werden können, die mit einer potenziellen Funktion in Verbindung stehen. Diese Methode wird für die korrelative, funktionelle und mechanistische Analyse von EVs in biologischen, physiologischen und pathologischen Studien nützlich sein.

Entsprechend dem experimentellen Arbeitsablauf können EVs aus dem peripheren Blut und festen Geweben extrahiert werden (Abbildung 1). Der Oberkieferknochen einer Maus im Alter von 8 Wochen beträgt ca. 0,1 ± 0,05 g, und es können ca. 300 μl Plasma aus der Maus entnommen werden. Nach den Protokollschritten können 0,3 mg bzw. 3 μg EVs gesammelt werden. Wie mittels TEM und NTA analysiert, sind die typischen morphologischen Merkmale von EVs runde becherförmige Membranvesikel mit einem Dur...

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Isolation and Analysis of Traceable and Functionalized Extracellular Vesicles from the Plasma and Solid Tissues

Das vorliegende Protokoll beschreibt eine Methode zur Extraktion extrazellulärer Vesikel aus dem peripheren Blut und festem Gewebe mit anschließender Profilierung von Oberflächenantigenen und Proteinladungen.

Isolierung und Analyse von nachweisbaren und funktionalisierten extrazellulären Vesikeln aus dem Plasma und festen Geweben

Circulating and tissue-resident extracellular vesicles (EVs) represent promising targets as novel theranostic biomarkers, and they emerge as important ...

Dieses Protokoll bietet eine praktikable Möglichkeit, die richtigen extrazellulären Vesikel aus den meisten Blut- und Feststoffgeweben zu isolieren und zu sammeln, insbesondere ihre Quelle und den Proteingehalt zu analysieren, was weitere funktionelle Experimente unterstützt. Neben der hohen Ausbeute und der geringen Kontamination ist der Hauptvorteil dieses Protokolls die Analyse von Oberflächenantigenen und Proteinladungen von EVs, die für physiologische und pathologische Studien nützlich ist. Es erleichtert die Diagnose von Krebserkrankungen wie entzündlichen Erkrankungen und Osteoporose durch die Detektion von Oberflächenmarkern von Elternzellen extrazellulärer Vesikel mit einem Durchflusszytometer.Die Menge der extrazellulären Gewebevesikel ist entscheidend für die folgenden Experimente. Stellen Sie sicher, dass die Konzentration der extrazellulären Vesikel nicht hoch ist. Seien Sie geduldig, um die Verdünnung durchzuführen.Bereiten Sie zunächst die Oberkieferknochenproben vor, indem Sie den Oberkieferknochen mit einer Augenpinzette und einer Schere isolieren und mit PBS waschen, um das Weichgewebe mit einer Pinzette zu entfernen. Dann legen Sie den Oberkieferknochen in 1,5-Milliliter-Zentrifugenröhrchen und schneiden den Knochen mit einer Schere in kleine Stücke von einem Millimeter Durchmesser. Fügen Sie eine bestimmte Menge Liberase hinzu, um das Gewebe zu bedecken, und inkubieren Sie es 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius.Anschließend zentrifugieren Sie die Probe bei 800 G für 10 Minuten bei vier Grad Celsius und überführen den Überstand vorsichtig mit einer Pipette in ein neues und sauberes 1,5-Milliliter-Zentrifugenröhrchen. Nachdem die vorbereiteten Plasma- und Knochenproben 15 Minuten lang bei 2.500 G und vier Grad Celsius zentrifugiert wurden, um großzellige Trümmer und verbleibende Blutplättchen zu entfernen, werden die Überstände vorsichtig in neue und saubere 1,5-Milliliter-Zentrifugenröhrchen überführt und bei 16.800 G für 30 Minuten bei vier Grad Celsius zentrifugiert. Als nächstes wird der Überstand entsorgt und die Pellets in jedem Röhrchen mit einem Milliliter PBS resuspendiert.Nach dem Zentrifugieren und Verwerfen des Überstands, wie zuvor gezeigt, resuspendieren Sie die Pellets in jedem Röhrchen mit 50 Mikrolitern PBS und lagern Sie diese Proben bei vier Grad Celsius für weniger als 24 Stunden oder verwenden Sie sie vorzugsweise sofort für die Analysen. Resuspendieren Sie die Proben mit 500 Mikrolitern PBS und übertragen Sie 50 Mikroliter in ein neues und sauberes 1,5-Milliliter-Zentrifugenröhrchen als Leerkontrolle, das als Röhrchen A gekennzeichnet ist, und weitere 50 Mikroliter in ein weiteres sauberes 1,5-Milliliter-Zentrifugenröhrchen als einfaches Färberöhrchen für FITC, das als Röhrchen B gekennzeichnet ist.Geben Sie 0,5 Mikroliter Membranfarbstoff in das Primärröhrchen für die Membranfärbung, während Sie fünf Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Nachdem das Primärröhrchen 30 Minuten lang bei 16.800 G zentrifugiert und der Überstand verworfen wurde, werden die Pellets mit 200 Mikrolitern PBS resuspendiert.Jede 50-Mikroliter-Probe wird in vier 1,5-Milliliter-Zentrifugenröhrchen aufgeteilt, um einfache Färberöhrchen für PE zu erhalten, die als Röhrchen C markiert sind, Oberflächenmarker zu färben, die als Röhrchen D markiert sind, und sekundäre Antikörperkontrollen, die als Röhrchen E gekennzeichnet sind.Geben Sie den primären Antikörper von Osteoklasten-assoziierten Rezeptor- und Knochenextrazellulären Vesikelproben sowie CD-18-Antikörper- und Plasma-extrazelluläre Vesikelproben separat in Röhrchen B und Röhrchen D. eine Stunde lang bei vier Grad Celsius inkubieren. Zentrifugieren Sie die Röhrchen und entsorgen Sie den Überstand wie zuvor gezeigt und resuspendieren Sie die Pellets mit 500 Mikrolitern PBS. Zentrifugieren Sie erneut 30 Minuten lang bei 16.800 G und vier Grad Celsius, um die zusätzlichen primären Antikörper zu entfernen.Nach dem Verwerfen des Überstandes resuspendieren Sie die Pellets mit 50 Mikrolitern PBS, gefolgt von der Zugabe von FITC-konjugierten Sekundärantikörpern in Röhrchen E.Inkubieren Sie alle Röhrchen eine Stunde lang bei vier Grad Celsius im Dunkeln. Verdünnen Sie einen Tropfen 0,2-, 0,5- bzw. eine mikrometergroße Perlensuspension in einen Milliliter PBS. Führen Sie dann jede Größe von Beads durch, um sicherzustellen, dass das für extrazelluläre Vesikel gewählte Gate ausgewählt wurde, und legen Sie den Schwellenwert des Durchflusszytometers fest, um mit einer geeigneten Vorwärts-Innenstreuung nach den Beads und der extrazellulären Vesikelpopulation zu suchen.Legen Sie als Endbedingung die Berechnung von 100.000 membrangefärbten Partikeln fest und analysieren Sie die Probe mit einem Durchflusszytometer, wie im Manuskript beschrieben. Die Pellets werden in 50 Mikrolitern RIPA-Lysepuffer resuspendiert und 30 Minuten auf Eis inkubiert. Um die Proteinkonzentrationen aller Proben in der 96-Well-Mikrotiterplatte mit dem BCA-Proteinassay zu quantifizieren, werden die zwei Milligramm pro Milliliter BSA mit 0,9 % normaler Kochsalzlösung auf 0,5 Milligramm pro Milliliter verdünnt.Bei 0,5 Milligramm pro Milliliter BSA und 0,9 % normaler Kochsalzlösung in drei duplizierte Vertiefungen mit bestimmten Volumina. Lassen Sie dann zwei Mikroliter der Proben fallen und geben Sie 18 Mikroliter normale Kochsalzlösung separat in drei duplizierte Vertiefungen. Nachdem Sie eine Arbeitslösung durch Mischen von BCA-Reagenz A mit Reagenz B hergestellt haben, geben Sie 200 Mikroliter der Arbeitslösung in jede Vertiefung und schütteln Sie sie 30 Sekunden lang vorsichtig.Anschließend wird die 96-Well-Mikrotiterplatte für 20 bis 25 Minuten bei 37 Grad Celsius inkubiert und die optische Dichte bei 596 Nanometern mit dem Spektralphotometer gemessen. Exportieren Sie als Nächstes die Daten, zeichnen Sie eine Standardkurve und berechnen Sie die Proteinkonzentration der Proben. Den Ergebnissen zufolge werden die Proben mit 0,9 % normaler Kochsalzlösung und der fünffachen Konzentration des SDS-PAGE-Ladepuffers auf ein Mikrogramm pro Mikroliter verdünnt, die Röhrchen mit Folie dicht verschlossen und fünf Minuten lang bei 100 Grad Celsius erhitzt.Laden Sie die Proben in der Proteinleiter in eine Gradientenkonzentration von vier bis 20 % des Trisgels von HEPy. Lassen Sie das Gel im laufenden Puffer bei 80 Volt laufen, bis die Proteine eine Linie bilden. Schalten Sie dann für eine Stunde auf 120 Volt um, bis sich der Ladefarbstoff am Boden des Gels befindet.Übertragen Sie das Gel auf die in Methylalkohol vorinkubierte Polyvinylidenfluoridmembran für 20 Sekunden mit einem Nasstransfersystem, um es eine Stunde lang bei 200 Milliampere zu übertragen. Bereiten Sie 5%BSA-Blockierpuffer vor, indem Sie 2,5 Gramm BSA und 50 Milliliter TBST in ein 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen geben. Blockieren Sie die Membranen in diesem Puffer zwei Stunden lang bei Raumtemperatur unter Rühren.Inkubieren Sie die Membranen mit spezifischen Primärantikörpern, die mit TBST verdünnt sind, über Nacht bei vier Grad Celsius in die richtige Konzentration. Waschen Sie die Membranen viermal im Waschpuffer und inkubieren Sie die Membranen mit geeigneten Sekundärantikörpern eine Stunde lang bei Raumtemperatur unter Rühren. Nachdem Sie die Membranen viermal im Waschpuffer gewaschen haben, bilden Sie die Membranen mit dem Chemilumineszenz-Kit in einem Gel-Bildgebungssystem ab.Die Transmissionselektronenmikroskopie und die Nanopartikel-Tracking-Analyse zeigten, dass die typischen morphologischen Merkmale extrazellulärer Vesikel rund und becherförmig mit einem Durchmesser von 500 bis 300 Nanometern sind. Die durchflusszytometrische Analyse zeigt den prozentualen Anteil spezifischer Membranmarker, die auf extrazellulären Vesikeln exprimiert werden, was auf ihre Herkunft aus den Elternzellen hindeutet. Die Western-Blot-Analyse zeigt die Expression von PID bzw. PKM2 als repräsentativ für den Proteingehalt und die extrazellulären Plasmavesikel und die extrazellulären Knochenvesikel, was auf den metabolischen Status hinweist.Eine negative Expression von Golgin-84 in extrazellulären Vesikeln wurde durch die Anwesenheit von Mitofilin, Alpha-Actinin-4, Flotillin-1, Caveolin-1 und Beta-Aktin zusammen mit dem Vesikelmarker CD9 nachgewiesen, während die CD81-Expression gering oder gar nicht vorhanden ist und APO-A-1 in den extrazellulären Plasmavesikeln fehlt. Forscher, also unter Berücksichtigung von Schritt 2.2, die Präparation und der Aufschluss der Gewebeproben sollten ausreichend durchgeführt werden. Andernfalls ist die Anzahl der extrazellulären Vesikel, die aus dem Gewebe extrahiert werden, begrenzt.Die mit Markern markierte fluoreszierende Färbung der extrazellulären Vesikel kann in den Mund injiziert werden, um die Phase zu behandeln, die mit der potenziellen Funktion verbunden ist.

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation and Analysis of Hematopoietic Stem Cells from the Placenta

Isolierung und Analyse von hämatopoetischen Stammzellen aus der Plazenta

Hematopoietic stem cells (HSCs) have the ability to self-renew and generate all cell types of the blood lineages throughout the lifetime of an individual. ...

Forschung

Biologie

Solid Phase Synthesis of a Functionalized Bis-Peptide Using "Safety Catch" Methodology

Festphasensynthese eines funktionalisierten Bis-Peptids unter Verwendung von &quot;Safety-Catch&quot;-Methodik

In 1962, R.B. Merrifield published the first procedure using solid-phase peptide synthesis as a novel route to efficiently synthesize peptides. This ...

Techniques for the Analysis of Extracellular Vesicles Using Flow Cytometry

Techniken für die Analyse der extrazellulären Vesikeln mittels Durchflusszytometrie

Extracellular Vesicles (EVs) are small, membrane-derived vesicles found in bodily fluids that are highly involved in cell-cell communication and help ...

Enrichment of Extracellular Matrix Proteins from Tissues and Digestion into Peptides for Mass Spectrometry Analysis

Anreicherung von extrazellulären Matrixproteinen aus Gewebe und Verdauung in Peptide für Massenspektrometrie-Analyse

The extracellular matrix (ECM) is a complex meshwork of cross-linked proteins that provides biophysical and biochemical cues that are major regulators of ...

Analysis of Cell Suspensions Isolated from Solid Tissues by Spectral Flow Cytometry

Analyse von Zellsuspensionen isoliert von festen Geweben von Spectral Flow Cytometry

Flow cytometry has been used for the past 40 years to define and analyze the phenotype of lymphoid and other hematopoietic cells. Initially restricted to ...

Flow Cytometric Analysis of Extracellular Vesicles from Cell-conditioned Media

Fließen Sie durchflusszytometrischen Analyse der extrazellulären Vesikel aus Zelle konditioniertes Medien

Flow cytometry (FC) is the method of choice for semi-quantitative measurement of cell-surface antigen markers. Recently, this technique has been used for ...

Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

Reinigung und Analyse von Caenorhabditis elegans Extrazelluläre Vesikel

The secretion of small membrane-bound vesicles into the external environment is a fundamental physiological process of all cells. These extracellular ...

Nanoparticle Tracking Analysis for the Quantification and Size Determination of Extracellular Vesicles

Nanopartikel-Tracking-Analyse zur Quantifizierung und Größenbestimmung extrazellulärer Vesikel

The physiological and pathophysiological roles of extracellular vesicles (EVs) have become increasingly recognized, making the EV field a quickly evolving ...

Scalable Isolation and Purification of Extracellular Vesicles from Escherichia coli and Other Bacteria

Scalable Isolation and Purification of Extracellular Vesicles from Escherichia coli and Other Bacteria

Skalierbare Isolierung und Reinigung extrazellulärer Vesikel aus Escherichia coli und anderen Bakterien

Diverse bacterial species secrete ~20-300 nm extracellular vesicles (EVs), comprised of lipids, proteins, nucleic acids, glycans, and other molecules ...