Name: isolation and analysis of traceable and functionalized extracellular vesicles from the plasma and solid tissues
Uploaded: 2022-10-17T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Analysis of Traceable and Functionalized Extracellular Vesicles from the Plasma and Solid Tissues at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מהקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (32000974, 81870796, 82170988 ו- 81930025) והקרן למדע פוסט-דוקטורט בסין (2019M663986 ו- BX20190380). אנו אסירי תודה על הסיוע של המרכז הלאומי להדגמת הוראה ניסויית לרפואה בסיסית (AMFU).

הניסויים בבעלי חיים בוצעו בהתאם להנחיות הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של האוניברסיטה הרפואית הצבאית הרביעית והנחיות ARRIVE. במחקר הנוכחי נעשה שימוש בעכברי C57Bl/6 בני 8 שבועות (ללא העדפה לנקבות או לזכרים). השלבים הכרוכים בבידוד פלזמה ורקמות חשמליות מודגמות באיור 1. הפל...

<ol>
	<li>Abels, E. R., Breakefield, X. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introduction+to+extracellular+vesicles:+biogenesis,+RNA+cargo+selection,+content,+release,+and+uptake.">Introduction to extracellular vesicles: biogenesis, RNA cargo selection, content, release, and uptake.</a> Cellular and Molecular Neurobiology. 36 (3), 301-312 (2016).</li><li>Mathieu, M., Martin-Jaular, L., Lavieu, G., Th&#233;ry, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specificities+of+secretion+and+uptake+of+exosomes+and+other+extracellular+vesicles+for+cell-to-cell+communication.">Specificities of secretion and uptake of exosomes and other extracellular vesicles for cell-to-cell communication.</a> Nature Cell Biology. 21 (1), 9-17 (2019).</li><li>Van Niel, G., D'Angelo, G., Raposo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shedding+light+on+the+cell+biology+of+extracellular+vesicles.">Shedding light on the cell biology of extracellular vesicles.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (4), 213-228 (2018).</li><li>Witwer, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardization+of+sample+collection,+isolation+and+analysis+methods+in+extracellular+vesicle+research.">Standardization of sample collection, isolation and analysis methods in extracellular vesicle research.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 2 (1), 20360 (2013).</li><li>Keshtkar, S., Azarpira, N., Ghahremani, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cell-derived+extracellular+vesicles:+novel+frontiers+in+regenerative+medicine.">Mesenchymal stem cell-derived extracellular vesicles: novel frontiers in regenerative medicine.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 9 (1), 63 (2018).</li><li>Thietart, S., Rautou, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles+as+biomarkers+in+liver+diseases:+A+clinician's+point+of+view.">Extracellular vesicles as biomarkers in liver diseases: A clinician's point of view.</a> Journal of Hepatology. 73 (6), 1507-1525 (2020).</li><li>Xia, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Damaged+brain+accelerates+bone+healing+by+releasing+small+extracellular+vesicles+that+target+osteoprogenitors.">Damaged brain accelerates bone healing by releasing small extracellular vesicles that target osteoprogenitors.</a> Nature Communications. 12 (1), 6043 (2021).</li><li>In’t Veld, S. G. J. G., Wurdinger, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor-educated+pletelets.">Tumor-educated pletelets.</a> Blood. 133 (22), 2359-2364 (2019).</li><li>Schwager, S. C., Reinhart-King, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanobiology+of+microvesicle+release,+uptake,+and+microvesicle-mediated+activation.">Mechanobiology of microvesicle release, uptake, and microvesicle-mediated activation.</a> Current Topics in Membranes. 86, 255-278 (2020).</li><li>Brahmer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=endothelial+cells+and+leukocytes+contribute+to+the+exercise-triggered+release+of+extracellular+vesicles+into+the+circulation.">endothelial cells and leukocytes contribute to the exercise-triggered release of extracellular vesicles into the circulation.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 8 (1), 1615820 (2019).</li><li>Yang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood+collection+through+subclavian+vein+puncture+in+mice.">Blood collection through subclavian vein puncture in mice.</a> Journal of Visualized Experiments. (147), e59556 (2019).</li><li>Han, L., Lam, E. W., Sun, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles+in+the+tumor+microenvironment:+old+stories,+but+new+tales.">Extracellular vesicles in the tumor microenvironment: old stories, but new tales.</a> Molecular Cancer. 18 (1), 59 (2019).</li><li>Gelibter, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+storage+on+extracellular+vesicles:+A+systematic+study.">The impact of storage on extracellular vesicles: A systematic study.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 11 (2), 12162 (2022).</li><li>Forsyth, C. B., Mathews, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphocytes+utilize+CD11b/CD18+for+adhesion+to+Candida+albicans.">Lymphocytes utilize CD11b/CD18 for adhesion to Candida albicans.</a> Cellular Immunology. 170 (1), 91-100 (1996).</li><li>Kodama, J., Kaito, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoclast+multinucleation:+review+of+current+literature.">Osteoclast multinucleation: review of current literature.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (16), 5685 (2020).</li><li>Welsh, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MIFlowCyt-EV:+a+framework+for+standardized+reporting+of+extracellular+vesicle+flow+cytometry+experiments.">MIFlowCyt-EV: a framework for standardized reporting of extracellular vesicle flow cytometry experiments.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 9 (1), 1713526 (2020).</li><li>Durcin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterisation+of+adipocyte-derived+extracellular+vesicle+subtypes+identifies+distinct+protein+and+lipid+signatures+for+large+and+small+extracellular+vesicles.">Characterisation of adipocyte-derived extracellular vesicle subtypes identifies distinct protein and lipid signatures for large and small extracellular vesicles.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1305677 (2017).</li><li>Kowal, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+comparison+defines+novel+markers+to+characterize+heterogeneous+populations+of+extracellular+vesicle+subtypes.">Proteomic comparison defines novel markers to characterize heterogeneous populations of extracellular vesicle subtypes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (8), 968-977 (2016).</li><li>Noren Hooten, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+extracellular+vesicle+protein+cargo+with+race+and+clinical+markers+of+mortality.">Association of extracellular vesicle protein cargo with race and clinical markers of mortality.</a> Scientific Reports. 9 (1), 17582 (2019).</li><li>Sidhom, K., Obi, P. O., Saleem, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+exosomal+isolation+methods:+is+size+exclusion+chromatography+the+best+option.">A review of exosomal isolation methods: is size exclusion chromatography the best option.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (18), 6466 (2020).</li><li>Pietrowska, M., Wlosowicz, A., Gawin, M., Widlak, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MS-based+proteomic+analysis+of+serum+and+plasma:+problem+of+high+abundant+components+and+lights+and+shadows+of+albumin+removal.">MS-based proteomic analysis of serum and plasma: problem of high abundant components and lights and shadows of albumin removal.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 1073, 57-76 (2019).</li><li>Coumans, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methodological+guidelines+to+study+extracellular+vesicles.">Methodological guidelines to study extracellular vesicles.</a> Circulation Research. 120 (10), 1632-1648 (2017).</li><li>Th&#233;ry, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimal+information+for+studies+of+extracellular+vesicles+2018+(MISEV2018):+a+position+statement+of+the+International+Society+for+Extracellular+Vesicles+and+update+of+the+MISEV2014+guidelines.">Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).</li><li>Witwer, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardization+of+sample+collection,+isolation+and+analysis+methods+in+extracellular+vesicle+research.">Standardization of sample collection, isolation and analysis methods in extracellular vesicle research.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 2 (1), 20360 (2013).</li><li>Coumans, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methodological+guidelines+to+study+extracellular+vesicles.">Methodological guidelines to study extracellular vesicles.</a> Circulation Research. 120 (10), 1632-1648 (2017).</li><li>G&#246;rgens, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+storage+conditions+stabilizing+extracellular+vesicles+preparations.">Identification of storage conditions stabilizing extracellular vesicles preparations.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 11 (6), 12238 (2020).</li><li>Maroto, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+storage+temperature+on+airway+exosome+integrity+for+diagnostic+and+functional+analyses.">Effects of storage temperature on airway exosome integrity for diagnostic and functional analyses.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1359478 (2017).</li><li>Zheng, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoptotic+vesicles+restore+liver+macrophage+homeostasis+to+counteract+type+2+diabetes.">Apoptotic vesicles restore liver macrophage homeostasis to counteract type 2 diabetes.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 10 (7), 12109 (2021).</li><li>Liu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+apoptotic+bodies+maintain+mesenchymal+stem+cell+homeostasis+and+ameliorate+osteopenia+via+transferring+multiple+cellular+factors.">Circulating apoptotic bodies maintain mesenchymal stem cell homeostasis and ameliorate osteopenia via transferring multiple cellular factors.</a> Cell Research. 28 (9), 918-933 (2018).</li><li>Vander Pol, E., van Gemert, M. J., Sturk, A., Nieuwland, R., van Leeuwen, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+vs.+swarm+detection+of+microparticles+and+exosomes+by+flow+cytometry.">Single vs. swarm detection of microparticles and exosomes by flow cytometry.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 10 (5), 919-930 (2012).</li><li>Dawson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+lipid+rafts+(detergent-resistant+microdomains)+and+comparison+to+extracellular+vesicles+(exosomes).">Isolation of lipid rafts (detergent-resistant microdomains) and comparison to extracellular vesicles (exosomes).</a> Methods in Molecular Biology. 2187, 99-112 (2021).</li><li>Zhang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles:+Natural+liver-accumulating+drug+delivery+vehicles+for+the+treatment+of+liver+diseases.">Extracellular vesicles: Natural liver-accumulating drug delivery vehicles for the treatment of liver diseases.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 10 (2), 12030 (2020).</li><li>Vella, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rigorous+method+to+enrich+for+exosomes+from+brain+tissue.">A rigorous method to enrich for exosomes from brain tissue.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1348885 (2017).</li></ol>

כאשר בוחנים את התכונות, הגורל והתפקוד של כלי רכב חשמליים, חיוני לבודד כלי רכב חשמליים עם תפוקה גבוהה וזיהום נמוך. קיימות שיטות שונות לחילוץ כלי רכב חשמליים, כגון צנטריפוגת שיפוע צפיפות (DGC), כרומטוגרפיה של אי הכללת גודל (SEC) ומבחני לכידת חיסון 4,20. כאן נעשה שימו?...

שלפוחיות חוץ-תאיות (EVs) הוצעו כדי להגדיר מבנים חוץ-תאיים מוקפים דו-שכבתיים של שומנים בתאים1, הממלאים תפקידים חשובים באירועים פיזיולוגיים ופתולוגיים שונים2. ניתן לחלק באופן כללי כלי רכב חשמליים המשוחררים על ידי תאים בריאים לשתי קטגוריות עיקריות: אקסוזומים (או כלי רכב חשמליים קטנים) הנוצרים באמצעות מסלול סחר אנדוציטי תוך-תאי3 ומיקרו-שלפוחיות (או EV גדולות) המתפתחות על ידי הניצנים החיצוניים של קרום הפלזמה של תא4. בעוד שמחקרים רבים מתמקדים בתפקוד של כלי רכב חשמליים שנאספו מתאים בתרבית במבחנה5, כלי רכב חשמליים שמקורם במחזור הדם או ברקמות מורכבים והטרוגניים יותר, שיש להם יתרון בכך שהם משקפים את המצב האמיתי של האורגניזם in vivo6. יתר על כן, כמעט כל סוגי הרקמות יכולים לייצר EVs in vivo , ורכבים חשמליים אלה יכולים לפעול כשליחים בתוך הרקמה או להיות מועברים על ידי נוזלי גוף שונים, במיוחד הדם ההיקפי, כדי להקל על תקשורת מערכתית7. כלי רכב חשמליים במחזור הדם וברקמות הם גם מטרות לאבחון מחלות ולטיפול בהן8.
בעוד האקסוזומים נחקרו באופן אינטנסיבי בשנים האחרונות, למיקרו-שלפוחיות יש גם תפקידים ביולוגיים חשובים, אותם ניתן לחלץ בקלות ללא אולטרה-צנטריפוגה, ובכך לקדם מחקר בסיסי וקליני9. יש לציין כי סוגיה קריטית בנוגע לרכבים חשמליים המבודדים ממחזור הדם ומהרקמות היא שהם נגזרים מסוגי תאים שונים10. מאחר שמיקרו-שלפוחיות מובלות מממברנת הפלזמה ומוצגות על ידי שפע של מולקולות פני התא9, שימוש בסמנים של קרום תא האב כדי לזהות את המקור התאי של כלי רכב חשמליים אלה הוא אפשרי. באופן ספציפי, ניתן ליישם את טכניקת ציטומטריית הזרימה (FC) כדי לזהות סמני ממברנה. יתר על כן, החוקרים יכולים לבודד את כלי הרכב החשמליים ולבצע ניתוחים נוספים המבוססים על המטענים הפונקציונליים.
הפרוטוקול הנוכחי מספק הליך יסודי לחילוץ ואפיון כלי רכב חשמליים מדגימות in vivo. כלי הרכב החשמליים מבודדים באמצעות צנטריפוגה דיפרנציאלית, ואפיון כלי הרכב החשמליים כולל זיהוי מורפולוגי באמצעות ניתוח מעקב אחר ננו-חלקיקים (NTA) ומיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת (TEM), ניתוח מקור באמצעות FC וניתוח מטעני חלבונים באמצעות כתם מערבי. פלסמת הדם והעצם המקסימלית של עכברים משמשים כנציגים. חוקרים יכולים להתייחס לפרוטוקול זה עבור כלי רכב חשמליים ממקורות אחרים ולבצע שינויים מתאימים.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>4% paraformaldehyde&#160;</td>
			<td>Biosharp</td>
			<td>143174</td>
			<td>Transmission electron microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa fluor 488 anti-goat secondary antibody</td>
			<td>Yeason</td>
			<td>34306ES60</td>
			<td>Flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa fluor 488 anti-rabbit secondary antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11008</td>
			<td>Flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD18 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab131044</td>
			<td>Flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD81 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab109201</td>
			<td>Western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD9 antibody</td>
			<td>Huabio</td>
			<td>ET1601-9</td>
			<td>Western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mitofilin antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab110329</td>
			<td>Western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APOA1 Rabbit pAb</td>
			<td>Abclone</td>
			<td>A14211</td>
			<td>Western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA protein assay kit</td>
			<td>TIANGEN</td>
			<td>PA115</td>
			<td>Western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BLUeye Prestained Protein Ladder</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>94964-500UL</td>
			<td>Western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>MP Biomedical</td>
			<td>218072801</td>
			<td>Western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caveolin-1 antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-53564</td>
			<td>Western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellMask Orange plasma membrane stain</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C10045</td>
			<td>Flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemiluminescence</td>
			<td>Amersham Biosciences</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved operating scissor</td>
			<td>JZ Surgical Instrument</td>
			<td>J21040</td>
			<td>EV isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electronic balance</td>
			<td>Zhi Ke</td>
			<td>ZK-DST</td>
			<td>EV isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epoch spectrophotometer</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3810X</td>
			<td>EV isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flotillin-1 antibody</td>
			<td>PTM BIO</td>
			<td>PTM-5369</td>
			<td>Western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel imaging system</td>
			<td>Tanon</td>
			<td>4600</td>
			<td>Western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Golgin84</td>
			<td>Novus</td>
			<td>nbp1-83352</td>
			<td>Western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grids - Formvar/Carbon Coated - Copper 200 mesh</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>24915</td>
			<td>Transmission electron microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin Solution</td>
			<td>StemCell&#160;</td>
			<td>7980</td>
			<td>EV isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liberase Research Grade</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>5401127001</td>
			<td>EV isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscopic tweezer</td>
			<td>JZ Surgical Instrument</td>
			<td>JD1020</td>
			<td>EV isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NovoCyte flow cytometer</td>
			<td>ACEA</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Omni-PAGE Hepes-Tris Gels Hepes 4~20%, 10 wells</td>
			<td>Epizyme</td>
			<td>LK206</td>
			<td>Western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OSCAR(D-19) antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>SC-34235</td>
			<td>Flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (2x)</td>
			<td>ZHHC</td>
			<td>PW013</td>
			<td>Western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pentobarbital sodium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>57-33-0</td>
			<td>Anesthetization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L)</td>
			<td>Jacson</td>
			<td>115-035-003</td>
			<td>Western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)</td>
			<td>Jacson</td>
			<td>111-035-003</td>
			<td>Western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphotungstic acid</td>
			<td>RHAWN</td>
			<td>12501-23-4</td>
			<td>Transmission electron microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PKM2(d78a4) xp rabbit&#160; mab&#160;</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>4053t</td>
			<td>Western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene (PE) film</td>
			<td>Xiang yi</td>
			<td>200150055</td>
			<td>Transmission electron microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyvinylidene fluoride membranes&#160;</td>
			<td>Roche</td>
			<td>3010040001</td>
			<td>Western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitors</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4693132001</td>
			<td>Western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant anti-PGD antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab129199</td>
			<td>Western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RIPA lysis buffer</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>P0013</td>
			<td>Western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS-PAGE loading buffer (5x)</td>
			<td>Cwbio</td>
			<td>CW0027S</td>
			<td>Western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Size beads</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>F13839</td>
			<td>Flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tabletop High-Speed Micro Centrifuges</td>
			<td>Hitachi</td>
			<td>CT15E</td>
			<td>EV isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transmission electron microscope</td>
			<td>HITACHI</td>
			<td>H-7650</td>
			<td>Transmission electron microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>19472</td>
			<td>Western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex Mixer Genie</td>
			<td>Scientific Industries</td>
			<td>SI0425</td>
			<td>EV isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZetaView BASIC NTA - Nanoparticle Tracking Video Microscope PMX-120</td>
			<td>Particle Metrix</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Nanoparticle tracking analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-Actinin-4 Rabbit mAb</td>
			<td>Abclone</td>
			<td>A3379</td>
			<td>Western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-actin</td>
			<td>Cwbio</td>
			<td>CW0096M</td>
			<td>Western blot</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and analysis of traceable and functionalized extracellular vesicles from the plasma and solid tissues

שלפוחיות חוץ-תאיות (EVs) במחזור הדם ושוכנות רקמות מייצגות מטרות מבטיחות כסמנים ביולוגיים תרנוסטיים חדשים, והן מתגלות כשחקנים חשובים בשמירה על הומאוסטזיס אורגניזם והתקדמות של קשת רחבה של מחלות. בעוד המחקר הנוכחי מתמקד באפיון של אקסוזומים אנדוגניים עם מקור אנדוזומלי, microvesicles blebbing מן קרום פלזמה זכו לתשומת לב גוברת בבריאות וחולי, אשר מתאפיינים על ידי שפע של מולקולות פני השטח לשחזר את חתימת הממברנה של תאי הורה. כאן מוצג הליך הניתן לשחזור המבוסס על צנטריפוגה דיפרנציאלית לחילוץ ואפיון כלי רכב חשמליים מהפלזמה ומרקמות מוצקות, כגון העצם. הפרוטוקול מתאר גם פרופיל עוקב של אנטיגנים על פני השטח ומטעני חלבונים של כלי רכב חשמליים, אשר ניתן לעקוב אחר נגזרותיהם ומזוהים עם רכיבים הקשורים לתפקוד פוטנציאלי. שיטה זו תהיה שימושית לניתוח קורלטיבי, פונקציונלי ומכניסטי של כלי רכב חשמליים במחקרים ביולוגיים, פיזיולוגיים ופתולוגיים.

בהתאם לתהליך העבודה הניסיוני, ניתן לחלץ כלי רכב חשמליים מהדם ההיקפי ומהרקמות המוצקות (איור 1). העצם המקסימלית של עכבר בגיל 8 שבועות היא כ 0.1 ± 0.05 גרם, וכ 300 μL של פלזמה ניתן לאסוף מהעכבר. בעקבות שלבי הפרוטוקול, ניתן לאסוף 0.3 מ"ג ו-3 מיקרוגרם של כלי רכב חשמליים, בהתאמה. כפי שנותחו על...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Analysis of Traceable and Functionalized Extracellular Vesicles from the Plasma and Solid Tissues at JoVE.com

Isolation and Analysis of Traceable and Functionalized Extracellular Vesicles from the Plasma and Solid Tissues

הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטה לחילוץ שלפוחיות חוץ-תאיות מהדם ההיקפי ומרקמות מוצקות עם פרופיל עוקב של אנטיגנים על פני השטח ומטעני חלבונים.

בידוד וניתוח של שלפוחיות חוץ-תאיות ניתנות למעקב ומתפקדות מהפלזמה והרקמות המוצקות

Circulating and tissue-resident extracellular vesicles (EVs) represent promising targets as novel theranostic biomarkers, and they emerge as important ...

פרוטוקול זה מספק דרך אפשרית לבודד ולאסוף את השלפוחיות החוץ-תאיות הנכונות מרוב הדם והרקמות המוצקות, במיוחד לנתח את מקורן ואת תכולת החלבון, מה שמסייע בהמשך ניסויים פונקציונליים. מלבד תפוקה גבוהה וזיהום נמוך, היתרון העיקרי של פרוטוקול זה הוא ניתוח של אנטיגנים פני השטח ומטעני חלבון של כלי רכב חשמליים, אשר שימושי עבור מחקרים פיזיולוגיים ופתולוגיים. זה מקל על אבחון של סרטן של מחלות, כגון מחלות דלקתיות אוסטאופורוזיס באמצעות זיהוי של סמנים פני השטח של תאים ההורים של שלפוחיות חוץ תאיות עם ציטומטר זרימה.כמות השלפוחית החוץ תאית של הרקמה היא קריטית לניסויים הבאים. יש לוודא כי ריכוז השלפוחית החוץ תאית אינו גבוה. היו סבלניים לבצע את הדילול.כדי להתחיל, להכין את דגימות עצם מקסילרי על ידי בידוד העצם המקסילרית עם פינצטה אופתלמית מספריים ולשטוף אותם עם PBS להיפטר רקמות רכות עם פינצטה. ואז לשים את העצם המקסילרית לתוך צינורות צנטריפוגה 1.5 מיליליטר לחתוך את העצם לחתיכות קטנות של קוטר מילימטר אחד עם מספריים. מוסיפים כמות מסוימת של ליבראז כדי לכסות את הרקמה ולדגור במשך 30 דקות בחום של 37 מעלות צלזיוס.לאחר מכן, צנטריפוגה את הדגימה ב 800 G במשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס בזהירות להעביר את supernatant עם פיפטה צינורות צנטריפוגה 1.5 מיליליטר חדש ונקי. לאחר צנטריפוגה של דגימות הפלזמה והעצם שהוכנו במשך 15 דקות ב -2, 500 גרם וארבע מעלות צלזיוס כדי להסיר פסולת תאים גדולים וטסיות שנותרו, העבירו בזהירות את הסופרנאטנטים לצינורות צנטריפוגות 1.5 מיליליטר חדשים ונקיים וצנטריפוגות ב -16, 800 גרם למשך 30 דקות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן, השליכו את הסופרנאטנט והשעו מחדש את הכדוריות בכל צינור עם מיליליטר אחד של PBS.לאחר צנטריפוגה והשלכת הסופרנאטנט כפי שהודגם קודם לכן, שוב, יש להשהות מחדש את הכדוריות בכל צינור עם 50 מיקרוליטר PBS ולאחסן דגימות אלה בארבע מעלות צלזיוס למשך פחות מ-24 שעות או עדיף להשתמש בהן מיד לצורך הניתוחים. השהה מחדש דגימות עם 500 מיקרוליטר PBS והעבר 50 מיקרוליטר לצינור צנטריפוגה חדש ונקי של 1.5 מיליליטר כבקרה ריקה המסומנת כצינור A ועוד 50 מיקרוליטר לצינור צנטריפוגה נקי אחר של 1.5 מיליליטר כצינור צביעה פשוט עבור FITC, המסומן כצינור B.הוסף 0.5 מיקרוליטר של צבע ממברנה לצינור הראשי לצביעת קרום תוך דגירה במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. לאחר צנטריפוגה הצינור הראשי במשך 30 דקות ב 16, 800 G והשלכת supernatant, להשעות מחדש את הכדורים עם 200 מיקרוליטר של PBS.חלק כל דגימה של 50 מיקרוליטר לארבע צינורות צנטריפוגות של 1.5 מיליליטר עבור צינורות צביעה פשוטים עבור PE המסומנים כצינור C, צביעת סמן פני השטח המסומנת כצינור D, ובקרות נוגדנים משניות בלבד המסומנות כצינור E.הוסף את הנוגדן העיקרי של דגימות קולטן הקשורות לאוסטאוקלסט ושלפוחית חוץ-תאית עצם, כמו גם דגימות נוגדנים CD-18 ושלפוחית פלזמה חוץ-תאיות לצינור B ולצינור D בנפרד, דגירה במשך שעה בארבע מעלות צלזיוס. צנטריפוגו את הצינורות והשליכו את הסופרנאטנט כפי שהודגם קודם לכן והשעו מחדש את הכדוריות עם 500 מיקרוליטר PBS. שוב, צנטריפוגה למשך 30 דקות ב 16, 800 G וארבע מעלות צלזיוס כדי להסיר את הנוגדנים הראשוניים הנוספים.לאחר השלכת הסופרנאטנט יש להשהות מחדש את הכדוריות עם 50 מיקרוליטר PBS, ולאחר מכן להוסיף נוגדנים משניים מצומדים של FITC בהתאמה בצינור E.לדגור על כל הצינורות למשך שעה אחת בארבע מעלות צלזיוס בחושך. יש לדלל טיפה אחת של 0.2, 0.5 ותרחיף חרוזים בגודל מיקרומטר אחד בהתאמה למיליליטר אחד של PBS. לאחר מכן הפעל כל גודל של חרוזים כדי לוודא את השער שנבחר עבור שלפוחיות חוץ-תאיות וקבע את סף ציטומטר הזרימה כדי לחפש את אוכלוסיית החרוזים והשלפוחיות החוץ תאיות באמצעות פיזור פנימי קדמי מתאים.הגדר את המצב הסופי כחישוב 100, 000 חלקיקים צבועים בממברנה ונתח את הדגימה באמצעות ציטומטר זרימה כמתואר בכתב היד. מרחפים מחדש את הכדוריות ב-50 מיקרוליטר של חיץ RIPA-ליזה ודגרים במשך 30 דקות על קרח. כדי לכמת את ריכוזי החלבונים של כל הדגימות במיקרו-צלחת של 96 בארות על ידי בדיקת חלבון BCA, דללו את שני המיליגרם למיליליטר של BSA עם 0.9% של מלוחים רגילים ל-0.5 מיליגרם למיליליטר.ב 0.5 מיליגרם למיליליטר של BSA ו 0.9% של מלוחים רגילים לתוך שלוש בארות משוכפלות עם נפחים מסוימים. לאחר מכן זרוק שני מיקרוליטרים של הדגימות והוסף 18 מיקרוליטר של מלוחים רגילים לשלוש בארות משוכפלות בנפרד. לאחר הכנת פתרון עבודה על ידי ערבוב מגיב BCA A עם מגיב B, להוסיף 200 מיקרוליטר של פתרון העבודה לכל באר ולנער בעדינות במשך 30 שניות.לאחר מכן דגרו על המיקרו-צלחת של 96 בארות במשך 20 עד 25 דקות ב-37 מעלות צלזיוס ומדדו את הצפיפות האופטית ב-596 ננומטר באמצעות הספקטרופוטומטר. לאחר מכן, לייצא את הנתונים, לצייר עקומה סטנדרטית, ולחשב את ריכוז החלבון של הדגימות. על פי התוצאות, יש לדלל את הדגימות למיקרוגרם אחד למיקרוליטר עם 0.9% מי מלח רגילים וריכוז גבוה פי חמישה ממאגר הטעינה SDS-PAGE ולאטום את הצינורות בסרט בחוזקה ובחום של חמש דקות ב-100 מעלות צלזיוס.העמיסו את הדגימות בסולם החלבונים לריכוז מדורג של ארבעה עד 20% ג'ל התריס של HEPy. הפעל את הג'ל במאגר הריצה במתח של 80 וולט עד שהחלבונים יוצרים קו. לאחר מכן עברו ל-120 וולט למשך שעה עד שצבע ההעמסה נמצא בתחתית הג'ל.מעבירים את הג'ל לקרום הפוליווינילידן פלואוריד המודגר מראש באלכוהול מתיל למשך 20 שניות באמצעות מערכת העברה רטובה להעברה למשך שעה ב-200 מיליאמפר. הכינו חיץ חוסם של 5% BSA על ידי הוספת 2.5 גרם BSA ו-50 מיליליטר TBST לצינור צנטריפוגה של 50 מיליליטר. חוסמים את הקרומים בחיץ זה למשך שעתיים בטמפרטורת החדר עם תסיסה.לדגור על הממברנות עם נוגדנים ראשוניים ספציפיים המדוללים ב-TBST לריכוז תקין למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס. לשטוף את הממברנות בחיץ הכביסה ארבע פעמים ולדגור את הממברנות עם נוגדנים משניים מתאימים במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר עם תסיסה. לאחר שטיפת הממברנות במאגר הכביסה ארבע פעמים, דמיינו את הממברנות באמצעות ערכת כימילומינסנציה במערכת הדמיה בג'ל.מיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת וניתוח מעקב אחר ננו-חלקיקים גילו כי המאפיינים המורפולוגיים האופייניים של שלפוחיות חוץ-תאיות היו עגולים ובצורת גביע בקוטר שנע בין 500 ל-300 ננומטר. ניתוח ציטומטריית זרימה מראה את האחוזים של סמני קרום ספציפיים המבוטאים על שלפוחיות חוץ-תאיות המרמזות על מקורם מתאי האב. ניתוח כתמים מערביים מראה את הביטוי של PGD ו- PKM2 בהתאמה כנציג של תכולת חלבונים ובועיות חוץ-תאיות בפלזמה ובועיות חוץ-תאיות עצם, מה שמצביע על המצב המטבולי.ביטוי שלילי של Golgin-84 בשלפוחיות חוץ-תאיות זוהה עם נוכחות של מיטופילין, אלפא-אקטינין-4, Flotillin-1, Caveolin-1 ובטא-אקטין יחד עם סמן שלפוחיות CD9, בעוד ביטוי CD81 נמוך או נעדר עם חוסר קיום APO-A-1 בשלפוחיות החוץ תאיות פלזמה. חוקרים, אז תוך התחשבות כי שלב 2.2, הכנה ועיכול של דגימות רקמה צריך להיעשות מספיק. אחרת, מספר שלפוחיות חוץ-תאיות המופקות מהרקמות מוגבל.ניתן להזריק את הסמן המסומן ככתם פלואורסצנטי של השלפוחיות החוץ תאיות לתוך הפה כדי לטפל בשלב הקשור לתפקוד פוטנציאלי.

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation and Analysis of Hematopoietic Stem Cells from the Placenta

בידוד ניתוח בתאי גזע hematopoietic מן השליה

Hematopoietic stem cells (HSCs) have the ability to self-renew and generate all cell types of the blood lineages throughout the lifetime of an individual. ...

Solid Phase Synthesis of a Functionalized Bis-Peptide Using "Safety Catch" Methodology

סינתזה שלב מוצק של פפטיד Bis פונקציונליות שימוש &quot;בטיחות תפוס&quot; מתודולוגיה

In 1962, R.B. Merrifield published the first procedure using solid-phase peptide synthesis as a novel route to efficiently synthesize peptides. This ...

Techniques for the Analysis of Extracellular Vesicles Using Flow Cytometry

טכניקות לניתוח של תאית שלפוחית ​​שימוש cytometry הזרימה

Extracellular Vesicles (EVs) are small, membrane-derived vesicles found in bodily fluids that are highly involved in cell-cell communication and help ...

Enrichment of Extracellular Matrix Proteins from Tissues and Digestion into Peptides for Mass Spectrometry Analysis

העשרה תאית מטריקס חלבונים מרקמות ועיכול לפפטידים לניתוח ספקטרומטריית המסה

The extracellular matrix (ECM) is a complex meshwork of cross-linked proteins that provides biophysical and biochemical cues that are major regulators of ...

Analysis of Cell Suspensions Isolated from Solid Tissues by Spectral Flow Cytometry

ניתוח של המתלים תא מבודד מרקמות Solid ידי זרימת cytometry ספקטרלי

Flow cytometry has been used for the past 40 years to define and analyze the phenotype of lymphoid and other hematopoietic cells. Initially restricted to ...

Flow Cytometric Analysis of Extracellular Vesicles from Cell-conditioned Media

זרימה Cytometric ניתוח של שלפוחית חוץ-תאית ממדיה ממוזגים-תא

Flow cytometry (FC) is the method of choice for semi-quantitative measurement of cell-surface antigen markers. Recently, this technique has been used for ...

Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

טיהור וניתוח מסחטות של האלקאים ושלפוחיות

The secretion of small membrane-bound vesicles into the external environment is a fundamental physiological process of all cells. These extracellular ...

Nanoparticle Tracking Analysis for the Quantification and Size Determination of Extracellular Vesicles

ניתוח מעקב חלקיקים לכימות וקביעת גודל של שלל חוץ-תאי

The physiological and pathophysiological roles of extracellular vesicles (EVs) have become increasingly recognized, making the EV field a quickly evolving ...

Scalable Isolation and Purification of Extracellular Vesicles from Escherichia coli and Other Bacteria

Scalable Isolation and Purification of Extracellular Vesicles from Escherichia coli and Other Bacteria

בידוד וטיהור מדרגיים של שלפוחיות חוץ-תאיות מ-Escherichia coli וחיידקים אחרים

Diverse bacterial species secrete ~20-300 nm extracellular vesicles (EVs), comprised of lipids, proteins, nucleic acids, glycans, and other molecules ...