Name: isolation and analysis of traceable and functionalized extracellular vesicles from the plasma and solid tissues
Uploaded: 2022-10-17T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Analysis of Traceable and Functionalized Extracellular Vesicles from the Plasma and Solid Tissues at JoVE.com

Este trabalho foi apoiado por bolsas da Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (32000974, 81870796, 82170988 e 81930025) e da Fundação de Ciência Pós-Doutoral da China (2019M663986 e BX20190380). Somos gratos pela assistência do National Experimental Teaching Demonstration Center for Basic Medicine (AMFU).

Os experimentos com animais foram realizados de acordo com as Diretrizes do Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Quarta Universidade Médica Militar e as diretrizes do ARRIVE. Para o presente estudo, camundongos C57Bl/6 com 8 semanas de idade (sem preferência por fêmeas ou machos) foram utilizados. As etapas envolvidas no isolamento dos EVs plasmáticos e teciduais estão ilustradas na Figura 1. O plasma é tomado como um representante para descrever o procedimento de isol...

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	<li>Abels, E. R., Breakefield, X. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introduction+to+extracellular+vesicles:+biogenesis,+RNA+cargo+selection,+content,+release,+and+uptake.">Introduction to extracellular vesicles: biogenesis, RNA cargo selection, content, release, and uptake.</a> Cellular and Molecular Neurobiology. 36 (3), 301-312 (2016).</li><li>Mathieu, M., Martin-Jaular, L., Lavieu, G., Th&#233;ry, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specificities+of+secretion+and+uptake+of+exosomes+and+other+extracellular+vesicles+for+cell-to-cell+communication.">Specificities of secretion and uptake of exosomes and other extracellular vesicles for cell-to-cell communication.</a> Nature Cell Biology. 21 (1), 9-17 (2019).</li><li>Van Niel, G., D'Angelo, G., Raposo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shedding+light+on+the+cell+biology+of+extracellular+vesicles.">Shedding light on the cell biology of extracellular vesicles.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (4), 213-228 (2018).</li><li>Witwer, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardization+of+sample+collection,+isolation+and+analysis+methods+in+extracellular+vesicle+research.">Standardization of sample collection, isolation and analysis methods in extracellular vesicle research.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 2 (1), 20360 (2013).</li><li>Keshtkar, S., Azarpira, N., Ghahremani, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cell-derived+extracellular+vesicles:+novel+frontiers+in+regenerative+medicine.">Mesenchymal stem cell-derived extracellular vesicles: novel frontiers in regenerative medicine.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 9 (1), 63 (2018).</li><li>Thietart, S., Rautou, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles+as+biomarkers+in+liver+diseases:+A+clinician's+point+of+view.">Extracellular vesicles as biomarkers in liver diseases: A clinician's point of view.</a> Journal of Hepatology. 73 (6), 1507-1525 (2020).</li><li>Xia, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Damaged+brain+accelerates+bone+healing+by+releasing+small+extracellular+vesicles+that+target+osteoprogenitors.">Damaged brain accelerates bone healing by releasing small extracellular vesicles that target osteoprogenitors.</a> Nature Communications. 12 (1), 6043 (2021).</li><li>In’t Veld, S. G. J. G., Wurdinger, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor-educated+pletelets.">Tumor-educated pletelets.</a> Blood. 133 (22), 2359-2364 (2019).</li><li>Schwager, S. C., Reinhart-King, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanobiology+of+microvesicle+release,+uptake,+and+microvesicle-mediated+activation.">Mechanobiology of microvesicle release, uptake, and microvesicle-mediated activation.</a> Current Topics in Membranes. 86, 255-278 (2020).</li><li>Brahmer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=endothelial+cells+and+leukocytes+contribute+to+the+exercise-triggered+release+of+extracellular+vesicles+into+the+circulation.">endothelial cells and leukocytes contribute to the exercise-triggered release of extracellular vesicles into the circulation.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 8 (1), 1615820 (2019).</li><li>Yang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood+collection+through+subclavian+vein+puncture+in+mice.">Blood collection through subclavian vein puncture in mice.</a> Journal of Visualized Experiments. (147), e59556 (2019).</li><li>Han, L., Lam, E. W., Sun, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles+in+the+tumor+microenvironment:+old+stories,+but+new+tales.">Extracellular vesicles in the tumor microenvironment: old stories, but new tales.</a> Molecular Cancer. 18 (1), 59 (2019).</li><li>Gelibter, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+storage+on+extracellular+vesicles:+A+systematic+study.">The impact of storage on extracellular vesicles: A systematic study.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 11 (2), 12162 (2022).</li><li>Forsyth, C. B., Mathews, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphocytes+utilize+CD11b/CD18+for+adhesion+to+Candida+albicans.">Lymphocytes utilize CD11b/CD18 for adhesion to Candida albicans.</a> Cellular Immunology. 170 (1), 91-100 (1996).</li><li>Kodama, J., Kaito, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoclast+multinucleation:+review+of+current+literature.">Osteoclast multinucleation: review of current literature.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (16), 5685 (2020).</li><li>Welsh, J. 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O., Saleem, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+exosomal+isolation+methods:+is+size+exclusion+chromatography+the+best+option.">A review of exosomal isolation methods: is size exclusion chromatography the best option.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (18), 6466 (2020).</li><li>Pietrowska, M., Wlosowicz, A., Gawin, M., Widlak, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MS-based+proteomic+analysis+of+serum+and+plasma:+problem+of+high+abundant+components+and+lights+and+shadows+of+albumin+removal.">MS-based proteomic analysis of serum and plasma: problem of high abundant components and lights and shadows of albumin removal.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 1073, 57-76 (2019).</li><li>Coumans, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methodological+guidelines+to+study+extracellular+vesicles.">Methodological guidelines to study extracellular vesicles.</a> Circulation Research. 120 (10), 1632-1648 (2017).</li><li>Th&#233;ry, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimal+information+for+studies+of+extracellular+vesicles+2018+(MISEV2018):+a+position+statement+of+the+International+Society+for+Extracellular+Vesicles+and+update+of+the+MISEV2014+guidelines.">Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).</li><li>Witwer, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardization+of+sample+collection,+isolation+and+analysis+methods+in+extracellular+vesicle+research.">Standardization of sample collection, isolation and analysis methods in extracellular vesicle research.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 2 (1), 20360 (2013).</li><li>Coumans, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methodological+guidelines+to+study+extracellular+vesicles.">Methodological guidelines to study extracellular vesicles.</a> Circulation Research. 120 (10), 1632-1648 (2017).</li><li>G&#246;rgens, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+storage+conditions+stabilizing+extracellular+vesicles+preparations.">Identification of storage conditions stabilizing extracellular vesicles preparations.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 11 (6), 12238 (2020).</li><li>Maroto, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+storage+temperature+on+airway+exosome+integrity+for+diagnostic+and+functional+analyses.">Effects of storage temperature on airway exosome integrity for diagnostic and functional analyses.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1359478 (2017).</li><li>Zheng, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoptotic+vesicles+restore+liver+macrophage+homeostasis+to+counteract+type+2+diabetes.">Apoptotic vesicles restore liver macrophage homeostasis to counteract type 2 diabetes.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 10 (7), 12109 (2021).</li><li>Liu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+apoptotic+bodies+maintain+mesenchymal+stem+cell+homeostasis+and+ameliorate+osteopenia+via+transferring+multiple+cellular+factors.">Circulating apoptotic bodies maintain mesenchymal stem cell homeostasis and ameliorate osteopenia via transferring multiple cellular factors.</a> Cell Research. 28 (9), 918-933 (2018).</li><li>Vander Pol, E., van Gemert, M. J., Sturk, A., Nieuwland, R., van Leeuwen, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+vs.+swarm+detection+of+microparticles+and+exosomes+by+flow+cytometry.">Single vs. swarm detection of microparticles and exosomes by flow cytometry.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 10 (5), 919-930 (2012).</li><li>Dawson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+lipid+rafts+(detergent-resistant+microdomains)+and+comparison+to+extracellular+vesicles+(exosomes).">Isolation of lipid rafts (detergent-resistant microdomains) and comparison to extracellular vesicles (exosomes).</a> Methods in Molecular Biology. 2187, 99-112 (2021).</li><li>Zhang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles:+Natural+liver-accumulating+drug+delivery+vehicles+for+the+treatment+of+liver+diseases.">Extracellular vesicles: Natural liver-accumulating drug delivery vehicles for the treatment of liver diseases.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 10 (2), 12030 (2020).</li><li>Vella, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rigorous+method+to+enrich+for+exosomes+from+brain+tissue.">A rigorous method to enrich for exosomes from brain tissue.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1348885 (2017).</li></ol>

Ao estudar as características, o destino e a função dos EVs, é crucial isolar EVs com alto rendimento e baixa contaminação. Existem vários métodos para extrair EVs, como centrifugação por gradiente de densidade (DGC), cromatografia de exclusão de tamanho (SEC) e ensaios de imunocaptura 4,20. Aqui, um dos métodos mais comumente utilizados, a centrifugação diferencial, foi usado; as vantagens disso são que não é demorado, gera um alto rendimento de...

Vesículas extracelulares (EVs) têm sido propostas para definir estruturas extracelulares liberadas de lipídios e fechadas por bicamadas1, que desempenham papéis importantes em vários eventos fisiológicos e patológicos2. Os EVs liberados por células saudáveis podem ser amplamente divididos em duas categorias principais, a saber, exossomos (ou pequenos EVs) formados através de uma via de tráfego endocítico intracelular3 e microvesículas (ou grandes EVs) desenvolvidas pelo brotamento externo da membrana plasmática da célula4. Enquanto muitos estudos enfocam a função dos EVs coletados de células cultivadas in vitro5, os EVs derivados da circulação ou tecidos são mais complexos e heterogêneos, o que tem a vantagem de refletir o verdadeiro estado do organismo in vivo6. Além disso, quase todos os tipos de tecidos podem produzir EVs in vivo, e esses EVs podem atuar como mensageiros dentro do tecido ou ser transferidos por vários fluidos corporais, especialmente o sangue periférico, para facilitar a comunicação sistêmica7. Os EVs na circulação e nos tecidos também são alvos para o diagnóstico e tratamento da doença8.
Enquanto os exossomos têm sido intensamente estudados nos últimos anos, as microvesículas também têm funções biológicas importantes, que podem ser facilmente extraídas sem ultracentrifugação, promovendo pesquisas básicas eclínicas9. Notadamente, uma questão crítica em relação aos EVs isolados da circulação e dos tecidos é que eles são derivados de diferentes tipos celulares10. Uma vez que as microvesículas são sopradas da membrana plasmática e caracterizadas por uma abundância de moléculas de superfície celular9, o uso de marcadores da membrana da célula de origem para identificar a origem celular desses EVs é viável. Especificamente, a técnica de citometria de fluxo (FC) pode ser aplicada para detectar marcadores de membrana. Além disso, os pesquisadores podem isolar os EVs e fazer análises adicionais com base nas cargas funcionais.
O presente protocolo fornece um procedimento minucioso para extração e caracterização de EVs de amostras in vivo. Os EVs são isolados via centrifugação diferencial, e a caracterização dos EVs inclui identificação morfológica via análise de rastreamento de nanopartículas (NTA) e microscopia eletrônica de transmissão (MET), análise de origem via FC e análise de carga proteica via western blot. O plasma sanguíneo e o osso maxilar de camundongos são usados como representantes. Os pesquisadores podem consultar este protocolo para EVs de outras fontes e fazer as modificações correspondentes.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>4% paraformaldehyde&#160;</td>
			<td>Biosharp</td>
			<td>143174</td>
			<td>Transmission electron microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa fluor 488 anti-goat secondary antibody</td>
			<td>Yeason</td>
			<td>34306ES60</td>
			<td>Flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa fluor 488 anti-rabbit secondary antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11008</td>
			<td>Flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD18 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab131044</td>
			<td>Flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD81 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab109201</td>
			<td>Western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD9 antibody</td>
			<td>Huabio</td>
			<td>ET1601-9</td>
			<td>Western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mitofilin antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab110329</td>
			<td>Western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APOA1 Rabbit pAb</td>
			<td>Abclone</td>
			<td>A14211</td>
			<td>Western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA protein assay kit</td>
			<td>TIANGEN</td>
			<td>PA115</td>
			<td>Western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BLUeye Prestained Protein Ladder</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>94964-500UL</td>
			<td>Western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>MP Biomedical</td>
			<td>218072801</td>
			<td>Western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caveolin-1 antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-53564</td>
			<td>Western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellMask Orange plasma membrane stain</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C10045</td>
			<td>Flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemiluminescence</td>
			<td>Amersham Biosciences</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved operating scissor</td>
			<td>JZ Surgical Instrument</td>
			<td>J21040</td>
			<td>EV isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electronic balance</td>
			<td>Zhi Ke</td>
			<td>ZK-DST</td>
			<td>EV isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epoch spectrophotometer</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3810X</td>
			<td>EV isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flotillin-1 antibody</td>
			<td>PTM BIO</td>
			<td>PTM-5369</td>
			<td>Western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel imaging system</td>
			<td>Tanon</td>
			<td>4600</td>
			<td>Western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Golgin84</td>
			<td>Novus</td>
			<td>nbp1-83352</td>
			<td>Western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grids - Formvar/Carbon Coated - Copper 200 mesh</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>24915</td>
			<td>Transmission electron microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin Solution</td>
			<td>StemCell&#160;</td>
			<td>7980</td>
			<td>EV isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liberase Research Grade</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>5401127001</td>
			<td>EV isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscopic tweezer</td>
			<td>JZ Surgical Instrument</td>
			<td>JD1020</td>
			<td>EV isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NovoCyte flow cytometer</td>
			<td>ACEA</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Omni-PAGE Hepes-Tris Gels Hepes 4~20%, 10 wells</td>
			<td>Epizyme</td>
			<td>LK206</td>
			<td>Western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OSCAR(D-19) antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>SC-34235</td>
			<td>Flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (2x)</td>
			<td>ZHHC</td>
			<td>PW013</td>
			<td>Western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pentobarbital sodium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>57-33-0</td>
			<td>Anesthetization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L)</td>
			<td>Jacson</td>
			<td>115-035-003</td>
			<td>Western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)</td>
			<td>Jacson</td>
			<td>111-035-003</td>
			<td>Western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphotungstic acid</td>
			<td>RHAWN</td>
			<td>12501-23-4</td>
			<td>Transmission electron microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PKM2(d78a4) xp rabbit&#160; mab&#160;</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>4053t</td>
			<td>Western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene (PE) film</td>
			<td>Xiang yi</td>
			<td>200150055</td>
			<td>Transmission electron microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyvinylidene fluoride membranes&#160;</td>
			<td>Roche</td>
			<td>3010040001</td>
			<td>Western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitors</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4693132001</td>
			<td>Western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant anti-PGD antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab129199</td>
			<td>Western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RIPA lysis buffer</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>P0013</td>
			<td>Western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS-PAGE loading buffer (5x)</td>
			<td>Cwbio</td>
			<td>CW0027S</td>
			<td>Western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Size beads</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>F13839</td>
			<td>Flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tabletop High-Speed Micro Centrifuges</td>
			<td>Hitachi</td>
			<td>CT15E</td>
			<td>EV isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transmission electron microscope</td>
			<td>HITACHI</td>
			<td>H-7650</td>
			<td>Transmission electron microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>19472</td>
			<td>Western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex Mixer Genie</td>
			<td>Scientific Industries</td>
			<td>SI0425</td>
			<td>EV isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZetaView BASIC NTA - Nanoparticle Tracking Video Microscope PMX-120</td>
			<td>Particle Metrix</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Nanoparticle tracking analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-Actinin-4 Rabbit mAb</td>
			<td>Abclone</td>
			<td>A3379</td>
			<td>Western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-actin</td>
			<td>Cwbio</td>
			<td>CW0096M</td>
			<td>Western blot</td>
		</tr>
	</tbody>
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isolation and analysis of traceable and functionalized extracellular vesicles from the plasma and solid tissues

As vesículas extracelulares (EVs) circulantes e residentes nos tecidos representam alvos promissores como novos biomarcadores teranósticos, e emergem como importantes atores na manutenção da homeostase do organismo e na progressão de um amplo espectro de doenças. Enquanto a pesquisa atual se concentra na caracterização de exossomos endógenos com origem endossomal, microvesículas que sopram da membrana plasmática têm ganhado atenção crescente na saúde e na doença, que são caracterizadas por uma abundância de moléculas de superfície recapitulando a assinatura da membrana das células parentais. Aqui, um procedimento reprodutível é apresentado baseado na centrifugação diferencial para extrair e caracterizar EVs do plasma e tecidos sólidos, como o osso. O protocolo descreve ainda o perfil subsequente de antígenos de superfície e cargas proteicas de EVs, que são rastreáveis por suas derivações e identificados com componentes relacionados à função potencial. Este método será útil para análise correlacional, funcional e mecanística de EVs em estudos biológicos, fisiológicos e patológicos.

De acordo com o fluxo de trabalho experimental, os VE podem ser extraídos do sangue periférico e dos tecidos sólidos (Figura 1). O osso maxilar de um camundongo com 8 semanas de idade é de aproximadamente 0,1 ± 0,05 g, e cerca de 300 μL de plasma podem ser coletados do camundongo. Seguindo as etapas do protocolo, 0,3 mg e 3 μg de VE podem ser coletados, respectivamente. Conforme analisado por MET e NTA, as características morfológicas típicas dos EVs são vesículas redondas de mem...

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Isolation and Analysis of Traceable and Functionalized Extracellular Vesicles from the Plasma and Solid Tissues

O presente protocolo descreve um método para extração de vesículas extracelulares do sangue periférico e tecidos sólidos com posterior perfilamento de antígenos de superfície e cargas proteicas.

Isolamento e Análise de Vesículas Extracelulares Rastreáveis e Funcionalizadas do Plasma e Tecidos Sólidos

Circulating and tissue-resident extracellular vesicles (EVs) represent promising targets as novel theranostic biomarkers, and they emerge as important ...

Este protocolo fornece uma maneira viável de isolar e coletar as vesículas extracelulares corretas da maioria dos tecidos sanguíneos e sólidos, especialmente analisar sua fonte e o conteúdo de proteínas, o que ajuda em experimentos funcionais posteriores. Além do alto rendimento e da baixa contaminação, a principal vantagem deste protocolo é a análise de antígenos de superfície e cargas proteicas de EVs, o que é útil para estudos fisiológicos e patológicos. Facilita o diagnóstico de cânceres de doenças, como doenças inflamatórias e osteoporose através da detecção de marcadores de superfície de células parentais de vesículas extracelulares com citômetro de fluxo.A quantidade de vesícula extracelular tecidual é crítica para os experimentos seguintes. Certifique-se de que a concentração de vesícula extracelular não é alta. Tenha paciência para realizar a diluição.Para começar, prepare as amostras de osso maxilar isolando o osso maxilar com pinça oftálmica e tesoura e lave-as com PBS para se livrar dos tecidos moles com pinça. Em seguida, coloque o osso maxilar em tubos de centrífuga de 1,5 mililitro e corte o osso em pequenos pedaços de um milímetro de diâmetro com tesoura. Adicione uma certa quantidade de Liberase para cobrir o tecido e incube por 30 minutos a 37 graus Celsius.Em seguida, centrifugar a amostra a 800 G por 10 minutos a quatro graus Celsius e transferir cuidadosamente o sobrenadante com uma pipeta para um tubo de centrífuga novo e limpo de 1,5 mililitro. Depois de centrifugar as amostras de plasma e osso preparadas por 15 minutos a 2, 500 G e quatro graus Celsius para remover grandes restos celulares e plaquetas remanescentes, transfira cuidadosamente os sobrenadantes para tubos de centrífuga novos e limpos de 1,5 mililitro e centrífuga a 16.800 G por 30 minutos a quatro graus Celsius. Em seguida, descarte o sobrenadante e ressuspenda os pellets em cada tubo com um mililitro de PBS.Após centrifugar e descartar o sobrenadante como demonstrado anteriormente, ressuspenda os pellets em cada tubo com 50 microlitros de PBS e armazene essas amostras a quatro graus Celsius por menos de 24 horas ou, de preferência, use-as imediatamente para as análises. Ressuspenda amostras com 500 microlitros de PBS e transfira 50 microlitros para um novo e limpo tubo centrífugo de 1,5 mililitro como um controle em branco rotulado como tubo A e outros 50 microlitros para outro tubo de centrífuga limpo de 1,5 mililitro como um tubo de coloração simples para FITC, rotulado como tubo B.Adicione 0,5 microlitros de corante de membrana ao tubo primário para coloração de membrana enquanto incuba por cinco minutos à temperatura ambiente. Após centrifugar o tubo primário por 30 minutos a 16,800 G e descartar o sobrenadante, ressuspender os pellets com 200 microlitros de PBS.Divida cada amostra de 50 microlitros em quatro tubos de centrífuga de 1,5 mililitro para tubos de coloração simples para PE marcados como tubo C, coloração de marcador de superfície marcada como tubo D e controles secundários somente de anticorpos rotulados como tubo E.Adicione o anticorpo primário do receptor associado aos osteoclastos e amostras de vesícula extracelular óssea, bem como amostras de anticorpos CD-18 e vesículas extracelulares plasmáticas ao tubo B e ao tubo D separadamente, incubando por uma hora a quatro graus Celsius. Centrifugar os tubos e descartar o sobrenadante conforme demonstrado anteriormente e ressuspender os pellets com 500 microlitros de PBS. Novamente, centrifugar por 30 minutos a 16, 800 G e quatro graus Celsius para remover os anticorpos primários extras.Após o descarte do sobrenadante, ressuspenda os pellets com 50 microlitros de PBS, seguido da adição de anticorpos secundários conjugados FITC, respectivamente, no tubo E.Incube todos os tubos por uma hora a quatro graus Celsius no escuro. Diluir uma gota de 0,2, 0,5 e uma suspensão de contas de tamanho micrométrico, respectivamente, em um mililitro de PBS. Em seguida, execute cada tamanho de contas para certificar-se da porta escolhida para vesículas extracelulares e defina o limiar do citômetro de fluxo para procurar a população de contas e vesículas extracelulares usando uma dispersão interna adequada para frente.Defina a condição terminal como calculando 100.000 partículas tingidas por membrana e analise a amostra por meio de um citômetro de fluxo, conforme descrito no manuscrito. Ressuspender os pellets em 50 microlitros de tampão de lise RIPA e incubar por 30 minutos sobre gelo. Para quantificar as concentrações de proteína de todas as amostras na microplaca de 96 poços pelo ensaio de proteína BCA, diluir os dois miligramas por mililitros de BSA com 0,9% de solução salina normal em 0,5 miligramas por mililitros.A 0,5 miligramas por mililitro de BSA e 0,9% de soro fisiológico normal em três poços duplicados com certos volumes. Em seguida, solte dois microlitros das amostras e adicione 18 microlitros de soro fisiológico normal em três poços duplicados separadamente. Depois de preparar uma solução de trabalho misturando o reagente A de BCA com o reagente B, adicione 200 microlitros da solução de trabalho a cada poço e agite suavemente durante 30 segundos.Em seguida, incube a microplaca de 96 poços por 20 a 25 minutos a 37 graus Celsius e meça a densidade óptica em 596 nanômetros com o espectrofotômetro. Em seguida, exporte os dados, desenhe uma curva padrão e calcule a concentração de proteína das amostras. De acordo com os resultados, diluir as amostras para um micrograma por microlitro com 0,9% de soro fisiológico normal e cinco vezes a concentração do tampão de carregamento SDS-PAGE e selar os tubos com filme firmemente e aquecer por cinco minutos a 100 graus Celsius.Coloque as amostras na escada de proteína em um gradiente de concentração de quatro a 20% de gel tris de HEPy. Passe o gel no tampão de corrida a 80 volts até que as proteínas formem uma linha. Em seguida, mude para 120 volts por uma hora até que o corante de carga esteja na parte inferior do gel.Transferir o gel para a membrana de fluoreto de polivinilideno pré-incubada em álcool metílico por 20 segundos usando um sistema de transferência úmida para transferir por uma hora a 200 miliamperes. Prepare o tampão de bloqueio de BSA a 5% adicionando 2,5 gramas de BSA e 50 mililitros de TBST em um tubo de centrífuga de 50 mililitros. Bloquear as membranas neste tampão durante duas horas à temperatura ambiente com agitação.Incubar as membranas com anticorpos primários específicos diluídos com TBST em concentração adequada durante a noite a quatro graus Celsius. Lavar as membranas no tampão de lavagem quatro vezes e incubar as membranas com anticorpos secundários adequados durante uma hora à temperatura ambiente com agitação. Depois de lavar as membranas no tampão de lavagem quatro vezes, obtenha imagens das membranas usando o kit de quimioluminescência em um sistema de imagem em gel.A microscopia eletrônica de transmissão e a análise de rastreamento de nanopartículas revelaram que as características morfológicas típicas das vesículas extracelulares foram redondas e em forma de taça com um diâmetro variando de 500 a 300 nanômetros. A análise por citometria de fluxo mostra as porcentagens de marcadores de membrana específicos expressos em vesículas extracelulares que implicam sua origem a partir de células parentais. A análise de Western blot mostra a expressão de PGD e PKM2, respectivamente, como representante do conteúdo proteico e das vesículas extracelulares plasmáticas e extracelulares ósseas, indicando o estado metabólico.A expressão negativa de Golgin-84 em vesículas extracelulares foi detectada com a presença de mitofilina, alfa-actinina-4, flotillina-1, caveolina-1 e beta-actina, juntamente com o marcador de vesículas CD9, enquanto a expressão de CD81 é baixa ou ausente com a ausência de existência de APO-A-1 nas vesículas extracelulares plasmáticas. Pesquisadores, portanto, tendo em mente que a etapa 2.2, a preparação e a digestão das amostras de tecido devem ser feitas suficientemente. Caso contrário, o número de vesículas extracelulares extraídas dos tecidos é limitado.O marcador marcado coloração fluorescente das vesículas extracelulares pode ser injetado na boca para tratar a fase que está ligada à função potencial.

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation and Analysis of Hematopoietic Stem Cells from the Placenta

Isolamento e Análise de Células-Tronco Hematopoéticas da Placenta

Hematopoietic stem cells (HSCs) have the ability to self-renew and generate all cell types of the blood lineages throughout the lifetime of an individual. ...

Biologia

Solid Phase Synthesis of a Functionalized Bis-Peptide Using "Safety Catch" Methodology

Síntese em Fase Sólida de um funcionalizada Bis Peptide-Usando o &quot;Safety Catch&quot; Metodologia

In 1962, R.B. Merrifield published the first procedure using solid-phase peptide synthesis as a novel route to efficiently synthesize peptides. This ...

Techniques for the Analysis of Extracellular Vesicles Using Flow Cytometry

Técnicas de Análise de vesículas extracelulares utilizando citometria de fluxo

Extracellular Vesicles (EVs) are small, membrane-derived vesicles found in bodily fluids that are highly involved in cell-cell communication and help ...

Enrichment of Extracellular Matrix Proteins from Tissues and Digestion into Peptides for Mass Spectrometry Analysis

Enriquecimento de Proteínas da Matriz Extracelular a partir de tecidos e digestão em péptidos para Análise de Espectrometria de Massa

The extracellular matrix (ECM) is a complex meshwork of cross-linked proteins that provides biophysical and biochemical cues that are major regulators of ...

Analysis of Cell Suspensions Isolated from Solid Tissues by Spectral Flow Cytometry

Análise de suspensões celulares isoladas de tecidos sólidos por citometria de fluxo espectral

Flow cytometry has been used for the past 40 years to define and analyze the phenotype of lymphoid and other hematopoietic cells. Initially restricted to ...

Flow Cytometric Analysis of Extracellular Vesicles from Cell-conditioned Media

Fluxo Cytometric análise das vesículas extracelulares de célula-condicionado Media

Flow cytometry (FC) is the method of choice for semi-quantitative measurement of cell-surface antigen markers. Recently, this technique has been used for ...

Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

Purificação e Análise de Catadores Elegans Extracelulares

The secretion of small membrane-bound vesicles into the external environment is a fundamental physiological process of all cells. These extracellular ...

Nanoparticle Tracking Analysis for the Quantification and Size Determination of Extracellular Vesicles

Análise de rastreamento de nanopartículas para a quantificação e determinação de tamanho de vesículos extracelulares

The physiological and pathophysiological roles of extracellular vesicles (EVs) have become increasingly recognized, making the EV field a quickly evolving ...

Scalable Isolation and Purification of Extracellular Vesicles from Escherichia coli and Other Bacteria

Scalable Isolation and Purification of Extracellular Vesicles from Escherichia coli and Other Bacteria

Isolamento escalável e purificação de vesículas extracelulares de Escherichia coli e outras bactérias

Diverse bacterial species secrete ~20-300 nm extracellular vesicles (EVs), comprised of lipids, proteins, nucleic acids, glycans, and other molecules ...