Name: isolation and analysis of traceable and functionalized extracellular vesicles from the plasma and solid tissues
Uploaded: 2022-10-17T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Analysis of Traceable and Functionalized Extracellular Vesicles from the Plasma and Solid Tissues at JoVE.com

Detta arbete stöddes av bidrag från National Natural Science Foundation of China (32000974, 81870796, 82170988 och 81930025) och China Postdoctoral Science Foundation (2019M663986 och BX20190380). Vi är tacksamma för hjälp från National Experimental Teaching Demonstration Center for Basic Medicine (AMFU).

Djurförsöken utfördes i enlighet med riktlinjerna för institutionell djurvård och användningskommitté vid fjärde militära medicinska universitetet och ARRIVE-riktlinjerna. För den aktuella studien användes 8 veckor gamla C57Bl/6-möss (ingen preferens för varken honor eller hanar). Stegen för att isolera EV i plasma och vävnad illustreras i figur 1. Plasman tas som en representant för att beskriva EV-isoleringsproceduren från kroppsvätskor. Maxillärbenet tas som en represen...

<ol>
	<li>Abels, E. R., Breakefield, X. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introduction+to+extracellular+vesicles:+biogenesis,+RNA+cargo+selection,+content,+release,+and+uptake.">Introduction to extracellular vesicles: biogenesis, RNA cargo selection, content, release, and uptake.</a> Cellular and Molecular Neurobiology. 36 (3), 301-312 (2016).</li><li>Mathieu, M., Martin-Jaular, L., Lavieu, G., Th&#233;ry, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specificities+of+secretion+and+uptake+of+exosomes+and+other+extracellular+vesicles+for+cell-to-cell+communication.">Specificities of secretion and uptake of exosomes and other extracellular vesicles for cell-to-cell communication.</a> Nature Cell Biology. 21 (1), 9-17 (2019).</li><li>Van Niel, G., D'Angelo, G., Raposo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shedding+light+on+the+cell+biology+of+extracellular+vesicles.">Shedding light on the cell biology of extracellular vesicles.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (4), 213-228 (2018).</li><li>Witwer, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardization+of+sample+collection,+isolation+and+analysis+methods+in+extracellular+vesicle+research.">Standardization of sample collection, isolation and analysis methods in extracellular vesicle research.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 2 (1), 20360 (2013).</li><li>Keshtkar, S., Azarpira, N., Ghahremani, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cell-derived+extracellular+vesicles:+novel+frontiers+in+regenerative+medicine.">Mesenchymal stem cell-derived extracellular vesicles: novel frontiers in regenerative medicine.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 9 (1), 63 (2018).</li><li>Thietart, S., Rautou, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles+as+biomarkers+in+liver+diseases:+A+clinician's+point+of+view.">Extracellular vesicles as biomarkers in liver diseases: A clinician's point of view.</a> Journal of Hepatology. 73 (6), 1507-1525 (2020).</li><li>Xia, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Damaged+brain+accelerates+bone+healing+by+releasing+small+extracellular+vesicles+that+target+osteoprogenitors.">Damaged brain accelerates bone healing by releasing small extracellular vesicles that target osteoprogenitors.</a> Nature Communications. 12 (1), 6043 (2021).</li><li>In’t Veld, S. G. J. G., Wurdinger, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor-educated+pletelets.">Tumor-educated pletelets.</a> Blood. 133 (22), 2359-2364 (2019).</li><li>Schwager, S. C., Reinhart-King, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanobiology+of+microvesicle+release,+uptake,+and+microvesicle-mediated+activation.">Mechanobiology of microvesicle release, uptake, and microvesicle-mediated activation.</a> Current Topics in Membranes. 86, 255-278 (2020).</li><li>Brahmer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=endothelial+cells+and+leukocytes+contribute+to+the+exercise-triggered+release+of+extracellular+vesicles+into+the+circulation.">endothelial cells and leukocytes contribute to the exercise-triggered release of extracellular vesicles into the circulation.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 8 (1), 1615820 (2019).</li><li>Yang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood+collection+through+subclavian+vein+puncture+in+mice.">Blood collection through subclavian vein puncture in mice.</a> Journal of Visualized Experiments. (147), e59556 (2019).</li><li>Han, L., Lam, E. W., Sun, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles+in+the+tumor+microenvironment:+old+stories,+but+new+tales.">Extracellular vesicles in the tumor microenvironment: old stories, but new tales.</a> Molecular Cancer. 18 (1), 59 (2019).</li><li>Gelibter, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+storage+on+extracellular+vesicles:+A+systematic+study.">The impact of storage on extracellular vesicles: A systematic study.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 11 (2), 12162 (2022).</li><li>Forsyth, C. B., Mathews, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphocytes+utilize+CD11b/CD18+for+adhesion+to+Candida+albicans.">Lymphocytes utilize CD11b/CD18 for adhesion to Candida albicans.</a> Cellular Immunology. 170 (1), 91-100 (1996).</li><li>Kodama, J., Kaito, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoclast+multinucleation:+review+of+current+literature.">Osteoclast multinucleation: review of current literature.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (16), 5685 (2020).</li><li>Welsh, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MIFlowCyt-EV:+a+framework+for+standardized+reporting+of+extracellular+vesicle+flow+cytometry+experiments.">MIFlowCyt-EV: a framework for standardized reporting of extracellular vesicle flow cytometry experiments.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 9 (1), 1713526 (2020).</li><li>Durcin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterisation+of+adipocyte-derived+extracellular+vesicle+subtypes+identifies+distinct+protein+and+lipid+signatures+for+large+and+small+extracellular+vesicles.">Characterisation of adipocyte-derived extracellular vesicle subtypes identifies distinct protein and lipid signatures for large and small extracellular vesicles.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1305677 (2017).</li><li>Kowal, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+comparison+defines+novel+markers+to+characterize+heterogeneous+populations+of+extracellular+vesicle+subtypes.">Proteomic comparison defines novel markers to characterize heterogeneous populations of extracellular vesicle subtypes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (8), 968-977 (2016).</li><li>Noren Hooten, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+extracellular+vesicle+protein+cargo+with+race+and+clinical+markers+of+mortality.">Association of extracellular vesicle protein cargo with race and clinical markers of mortality.</a> Scientific Reports. 9 (1), 17582 (2019).</li><li>Sidhom, K., Obi, P. O., Saleem, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+exosomal+isolation+methods:+is+size+exclusion+chromatography+the+best+option.">A review of exosomal isolation methods: is size exclusion chromatography the best option.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (18), 6466 (2020).</li><li>Pietrowska, M., Wlosowicz, A., Gawin, M., Widlak, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MS-based+proteomic+analysis+of+serum+and+plasma:+problem+of+high+abundant+components+and+lights+and+shadows+of+albumin+removal.">MS-based proteomic analysis of serum and plasma: problem of high abundant components and lights and shadows of albumin removal.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 1073, 57-76 (2019).</li><li>Coumans, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methodological+guidelines+to+study+extracellular+vesicles.">Methodological guidelines to study extracellular vesicles.</a> Circulation Research. 120 (10), 1632-1648 (2017).</li><li>Th&#233;ry, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimal+information+for+studies+of+extracellular+vesicles+2018+(MISEV2018):+a+position+statement+of+the+International+Society+for+Extracellular+Vesicles+and+update+of+the+MISEV2014+guidelines.">Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).</li><li>Witwer, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardization+of+sample+collection,+isolation+and+analysis+methods+in+extracellular+vesicle+research.">Standardization of sample collection, isolation and analysis methods in extracellular vesicle research.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 2 (1), 20360 (2013).</li><li>Coumans, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methodological+guidelines+to+study+extracellular+vesicles.">Methodological guidelines to study extracellular vesicles.</a> Circulation Research. 120 (10), 1632-1648 (2017).</li><li>G&#246;rgens, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+storage+conditions+stabilizing+extracellular+vesicles+preparations.">Identification of storage conditions stabilizing extracellular vesicles preparations.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 11 (6), 12238 (2020).</li><li>Maroto, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+storage+temperature+on+airway+exosome+integrity+for+diagnostic+and+functional+analyses.">Effects of storage temperature on airway exosome integrity for diagnostic and functional analyses.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1359478 (2017).</li><li>Zheng, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoptotic+vesicles+restore+liver+macrophage+homeostasis+to+counteract+type+2+diabetes.">Apoptotic vesicles restore liver macrophage homeostasis to counteract type 2 diabetes.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 10 (7), 12109 (2021).</li><li>Liu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+apoptotic+bodies+maintain+mesenchymal+stem+cell+homeostasis+and+ameliorate+osteopenia+via+transferring+multiple+cellular+factors.">Circulating apoptotic bodies maintain mesenchymal stem cell homeostasis and ameliorate osteopenia via transferring multiple cellular factors.</a> Cell Research. 28 (9), 918-933 (2018).</li><li>Vander Pol, E., van Gemert, M. J., Sturk, A., Nieuwland, R., van Leeuwen, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+vs.+swarm+detection+of+microparticles+and+exosomes+by+flow+cytometry.">Single vs. swarm detection of microparticles and exosomes by flow cytometry.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 10 (5), 919-930 (2012).</li><li>Dawson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+lipid+rafts+(detergent-resistant+microdomains)+and+comparison+to+extracellular+vesicles+(exosomes).">Isolation of lipid rafts (detergent-resistant microdomains) and comparison to extracellular vesicles (exosomes).</a> Methods in Molecular Biology. 2187, 99-112 (2021).</li><li>Zhang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles:+Natural+liver-accumulating+drug+delivery+vehicles+for+the+treatment+of+liver+diseases.">Extracellular vesicles: Natural liver-accumulating drug delivery vehicles for the treatment of liver diseases.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 10 (2), 12030 (2020).</li><li>Vella, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rigorous+method+to+enrich+for+exosomes+from+brain+tissue.">A rigorous method to enrich for exosomes from brain tissue.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1348885 (2017).</li></ol>

När man studerar elfordonens egenskaper, öde och funktion är det viktigt att isolera elbilar med hög avkastning och låg förorening. Olika metoder finns för att extrahera EV, såsom densitetsgradientcentrifugering (DGC), storleksuteslutningskromatografi (SEC) och immunocapture analyser 4,20. Här användes en av de vanligaste metoderna, differentialcentrifugering; Fördelarna med detta är att det inte är tidskrävande, det genererar ett högt utbyte av EV...

Extracellulära vesiklar (EV) har föreslagits för att definiera cellfrisatta lipid-dubbelskikt-slutna extracellulära strukturer1, som spelar viktiga roller i olika fysiologiska och patologiska händelser2. EV som frigörs av friska celler kan grovt delas in i två huvudkategorier, nämligen exosomer (eller små EV) bildade genom en intracellulär endocytisk handelsväg3 och mikrovesiklar (eller stora EV) som utvecklas genom den yttre spirande plasmamembranet i cellen4. Medan många studier fokuserar på funktionen hos EV som samlats in från odlade celler in vitro5, är EV som härrör från cirkulationen eller vävnaderna mer komplexa och heterogena, vilket har fördelen att återspegla organismens verkliga tillstånd in vivo6. Dessutom kan nästan alla typer av vävnader producera EV in vivo , och dessa EV kan fungera som budbärare i vävnaden eller överföras av olika kroppsvätskor, särskilt perifert blod, för att underlätta systemisk kommunikation7. EV i cirkulationen och vävnaderna är också mål för sjukdomsdiagnos och behandling8.
Medan exosomer har studerats intensivt under de senaste åren har mikrovesiklar också viktiga biologiska funktioner, som lätt kan extraheras utan ultracentrifugering, vilket främjar grundforskning och klinisk forskning9. En kritisk fråga när det gäller elfordon isolerade från cirkulationen och vävnaderna är att de härrör från olika celltyper10. Eftersom mikrovesiklar blåses från plasmamembranet och presenteras av ett överflöd av cellytemolekyler9, är det möjligt att använda modercellmembranmarkörer för att identifiera det cellulära ursprunget för dessa EV. Specifikt kan flödescytometri (FC) -tekniken tillämpas för att detektera membranmarkörer. Dessutom kan forskare isolera elfordonen och göra ytterligare analyser baserat på de funktionella lasterna.
Detta protokoll tillhandahåller en grundlig procedur för att extrahera och karakterisera EV från in vivo-prover. EV: erna isoleras via differentiell centrifugering, och karakteriseringen av EV inkluderar morfologisk identifiering via nanopartikelspårningsanalys (NTA) och transmissionselektronmikroskopi (TEM), ursprungsanalys via FC och proteinlastanalys via western blot. Blodplasma och maxillärben hos möss används som representanter. Forskare kan hänvisa till detta protokoll för elbilar från andra källor och göra motsvarande ändringar.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>4% paraformaldehyde&#160;</td>
			<td>Biosharp</td>
			<td>143174</td>
			<td>Transmission electron microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa fluor 488 anti-goat secondary antibody</td>
			<td>Yeason</td>
			<td>34306ES60</td>
			<td>Flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa fluor 488 anti-rabbit secondary antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11008</td>
			<td>Flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD18 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab131044</td>
			<td>Flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD81 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab109201</td>
			<td>Western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD9 antibody</td>
			<td>Huabio</td>
			<td>ET1601-9</td>
			<td>Western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mitofilin antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab110329</td>
			<td>Western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APOA1 Rabbit pAb</td>
			<td>Abclone</td>
			<td>A14211</td>
			<td>Western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA protein assay kit</td>
			<td>TIANGEN</td>
			<td>PA115</td>
			<td>Western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BLUeye Prestained Protein Ladder</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>94964-500UL</td>
			<td>Western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>MP Biomedical</td>
			<td>218072801</td>
			<td>Western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caveolin-1 antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-53564</td>
			<td>Western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellMask Orange plasma membrane stain</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C10045</td>
			<td>Flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemiluminescence</td>
			<td>Amersham Biosciences</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved operating scissor</td>
			<td>JZ Surgical Instrument</td>
			<td>J21040</td>
			<td>EV isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electronic balance</td>
			<td>Zhi Ke</td>
			<td>ZK-DST</td>
			<td>EV isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epoch spectrophotometer</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3810X</td>
			<td>EV isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flotillin-1 antibody</td>
			<td>PTM BIO</td>
			<td>PTM-5369</td>
			<td>Western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel imaging system</td>
			<td>Tanon</td>
			<td>4600</td>
			<td>Western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Golgin84</td>
			<td>Novus</td>
			<td>nbp1-83352</td>
			<td>Western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grids - Formvar/Carbon Coated - Copper 200 mesh</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>24915</td>
			<td>Transmission electron microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin Solution</td>
			<td>StemCell&#160;</td>
			<td>7980</td>
			<td>EV isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liberase Research Grade</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>5401127001</td>
			<td>EV isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscopic tweezer</td>
			<td>JZ Surgical Instrument</td>
			<td>JD1020</td>
			<td>EV isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NovoCyte flow cytometer</td>
			<td>ACEA</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Omni-PAGE Hepes-Tris Gels Hepes 4~20%, 10 wells</td>
			<td>Epizyme</td>
			<td>LK206</td>
			<td>Western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OSCAR(D-19) antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>SC-34235</td>
			<td>Flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (2x)</td>
			<td>ZHHC</td>
			<td>PW013</td>
			<td>Western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pentobarbital sodium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>57-33-0</td>
			<td>Anesthetization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L)</td>
			<td>Jacson</td>
			<td>115-035-003</td>
			<td>Western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)</td>
			<td>Jacson</td>
			<td>111-035-003</td>
			<td>Western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphotungstic acid</td>
			<td>RHAWN</td>
			<td>12501-23-4</td>
			<td>Transmission electron microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PKM2(d78a4) xp rabbit&#160; mab&#160;</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>4053t</td>
			<td>Western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene (PE) film</td>
			<td>Xiang yi</td>
			<td>200150055</td>
			<td>Transmission electron microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyvinylidene fluoride membranes&#160;</td>
			<td>Roche</td>
			<td>3010040001</td>
			<td>Western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitors</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4693132001</td>
			<td>Western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant anti-PGD antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab129199</td>
			<td>Western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RIPA lysis buffer</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>P0013</td>
			<td>Western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS-PAGE loading buffer (5x)</td>
			<td>Cwbio</td>
			<td>CW0027S</td>
			<td>Western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Size beads</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>F13839</td>
			<td>Flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tabletop High-Speed Micro Centrifuges</td>
			<td>Hitachi</td>
			<td>CT15E</td>
			<td>EV isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transmission electron microscope</td>
			<td>HITACHI</td>
			<td>H-7650</td>
			<td>Transmission electron microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>19472</td>
			<td>Western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex Mixer Genie</td>
			<td>Scientific Industries</td>
			<td>SI0425</td>
			<td>EV isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZetaView BASIC NTA - Nanoparticle Tracking Video Microscope PMX-120</td>
			<td>Particle Metrix</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Nanoparticle tracking analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-Actinin-4 Rabbit mAb</td>
			<td>Abclone</td>
			<td>A3379</td>
			<td>Western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-actin</td>
			<td>Cwbio</td>
			<td>CW0096M</td>
			<td>Western blot</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and analysis of traceable and functionalized extracellular vesicles from the plasma and solid tissues

Cirkulerande och vävnadsresidenta extracellulära vesiklar (EV) representerar lovande mål som nya teranostiska biomarkörer, och de framträder som viktiga aktörer i upprätthållandet av organismhomeostas och utvecklingen av ett brett spektrum av sjukdomar. Medan den aktuella forskningen fokuserar på karakterisering av endogena exosomer med endosomalt ursprung, har mikrovesiklar som blåser från plasmamembranet fått ökad uppmärksamhet vid hälsa och sjukdom, som presenteras av ett överflöd av ytmolekyler som rekapitulerar membransignaturen hos moderceller. Här presenteras en reproducerbar procedur baserad på differentiell centrifugering för att extrahera och karakterisera EV från plasma och fasta vävnader, såsom benet. Protokollet beskriver vidare efterföljande profilering av ytantigener och proteinlaster av EV, som därmed är spårbara för sina härledningar och identifierade med komponenter relaterade till potentiell funktion. Denna metod kommer att vara användbar för korrelativ, funktionell och mekanistisk analys av EV i biologiska, fysiologiska och patologiska studier.

Enligt det experimentella arbetsflödet kan EV extraheras från perifert blod och fasta vävnader (figur 1). Maxillärbenet hos en mus i åldern 8 veckor är ungefär 0,1 ± 0,05 g och cirka 300 μL plasma kan samlas in från musen. Efter protokollstegen kan 0,3 mg respektive 3 μg EV samlas in. Som analyserats av TEM och NTA är de typiska morfologiska egenskaperna hos EV runda koppformade membranvesiklar med en diameter som sträcker sig från 50-300 nm (figur 2</stron...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Analysis of Traceable and Functionalized Extracellular Vesicles from the Plasma and Solid Tissues at JoVE.com

Isolation and Analysis of Traceable and Functionalized Extracellular Vesicles from the Plasma and Solid Tissues

Detta protokoll beskriver en metod för att extrahera extracellulära vesiklar från perifert blod och fast vävnad med efterföljande profilering av ytantigener och proteinlaster.

Isolering och analys av spårbara och funktionaliserade extracellulära vesiklar från plasma och fasta vävnader

Circulating and tissue-resident extracellular vesicles (EVs) represent promising targets as novel theranostic biomarkers, and they emerge as important ...

Detta protokoll ger ett genomförbart sätt att isolera och samla rätt extracellulära vesiklar från de flesta blod och fasta vävnader, särskilt analysera deras källa och proteininnehållet, vilket hjälper till att ytterligare funktionella experiment. Förutom högt utbyte och låg kontaminering är den största fördelen med detta protokoll analys av ytantigener och proteinlaster av EV, vilket är användbart för fysiologiska och patologiska studier. Det underlättar diagnosen cancer av sjukdomar, såsom inflammatoriska sjukdomar och osteoporos genom detektering av ytmarkörer av föräldraceller av extracellulära vesiklar med en flödescytometer.Mängden extracellulär vesikel i vävnad är avgörande för följande experiment. Se till att koncentrationen av extracellulär vesikel inte är hög. Var tålmodig för att utföra utspädningen.För att börja, förbered maxillära benprover genom att isolera maxillärbenet med oftalmisk pincett och sax och tvätta dem med PBS för att bli av med mjuka vävnader med pincett. Lägg sedan maxillärbenet i 1,5 ml centrifugrör och skär benet i små bitar av en millimeter i diameter med sax. Tillsätt en viss mängd liberas för att täcka vävnaden och inkubera i 30 minuter vid 37 grader Celsius.Centrifugera sedan provet vid 800 G i 10 minuter vid fyra grader Celsius och överför försiktigt supernatanten med en pipett till ett nytt och rent 1,5 ml centrifugrör. Efter centrifugering av de beredda plasma- och benproverna i 15 minuter vid 2 500 G och fyra grader Celsius för att avlägsna stora cellrester och återstående blodplättar, överför försiktigt supernatanterna till nya och rena 1,5 ml centrifugrör och centrifugera vid 16 800 G i 30 minuter vid fyra grader Celsius. Kassera sedan supernatanten och återsuspendera pelletsen i varje rör med en milliliter PBS.Efter centrifugering och kassering av supernatanten enligt tidigare ska pelletsen återsuspenderas i varje rör med 50 mikroliter PBS och dessa prover förvaras vid fyra grader Celsius i mindre än 24 timmar, eller helst användas omedelbart för analyserna. Resuspendera prover med 500 mikroliter PBS och överför 50 mikroliter till ett nytt och rent 1,5 milliliter centrifugrör som en blindkontroll märkt som rör A och ytterligare 50 mikroliter i ett annat rent 1,5 milliliter centrifugrör som ett enkelt färgningsrör för FITC, märkt som rör B.Tillsätt 0,5 mikroliter membranfärg till primärröret för membranfärgning medan du inkuberar i fem minuter vid rumstemperatur. Efter centrifugering av primärröret i 30 minuter vid 16 800 G och kassering av supernatanten, resuspendera pelletsna med 200 mikroliter PBS.Dela varje 50 mikroliterprov i fyra 1,5 ml centrifugrör för enkla färgningsrör för PE märkt som rör C, ytmarkörfärgning märkt som rör D och sekundära antikroppskontroller märkta som rör E.Lägg till den primära antikroppen av osteoklastassocierad receptor och ben extracellulära vesikelprover samt CD-18-antikropp och plasma extracellulära vesikelprover till rör B och rör D separat, inkubera i en timme vid fyra grader Celsius. Centrifugera rören och kassera supernatanten enligt tidigare demonstration och återsuspendera pelletsen med 500 mikroliter PBS. Återigen, centrifugera i 30 minuter vid 16 800 G och fyra grader Celsius för att avlägsna de extra primära antikropparna.Efter kassering av supernatanten suspenderas pelletsen igen med 50 mikroliter PBS, följt av tillsats av FITC-konjugerade sekundära antikroppar i rör E.Inkubera alla rör i en timme vid fyra grader Celsius i mörkret. Späd en droppe 0,2, 0,5 respektive en mikrometer stor pärlsuspension i en milliliter PBS. Kör sedan varje storlek på pärlor för att se till vilken grind som valts för extracellulära vesiklar och ställ in tröskeln för flödescytometern för att söka efter pärlorna och den extracellulära vesikelpopulationen med hjälp av en lämplig framåtriktad inre spridning.Ställ in terminaltillståndet som beräkning av 100 000 membranfärgade partiklar och analysera provet via en flödescytometer som beskrivs i manuskriptet. Återsuspendera pelletsen i 50 mikroliter RIPA-lysbuffert och inkubera i 30 minuter på is. För att kvantifiera proteinkoncentrationerna för alla prover i 96-brunnsmikroplattan med BCA-proteinanalysen, späd de två milligram per milliliter BSA med 0,9% normal saltlösning till 0,5 milligram per milliliter.Vid 0,5 milligram per milliliter BSA och 0,9% normal saltlösning i tre duplicerade brunnar med vissa volymer. Släpp sedan två mikroliter av proverna och tillsätt 18 mikroliter normal saltlösning i tre duplicerade brunnar separat. Efter beredning av en arbetslösning genom blandning av BCA-reagens A med reagens B, tillsätt 200 mikroliter av arbetslösningen till varje brunn och skaka försiktigt i 30 sekunder.Inkubera sedan mikroplattan med 96 brunnar i 20 till 25 minuter vid 37 grader Celsius och mät den optiska densiteten vid 596 nanometer med spektrofotometern. Exportera sedan data, rita en standardkurva och beräkna proteinkoncentrationen i proverna. Enligt resultaten, späd proverna till ett mikrogram per mikroliter med 0,9% normal saltlösning och fem gånger koncentrationen av SDS-PAGE laddningsbuffert och försegla rören med film tätt och värm i fem minuter vid 100 grader Celsius.Ladda proverna i proteinstegen i en gradientkoncentration av fyra till 20% HEPys trisgel. Kör gelen i löpbufferten vid 80 volt tills proteinerna bildar en linje. Byt sedan till 120 volt i en timme tills laddningsfärgen är längst ner på gelén.Överför gelen till polyvinylidenfluoridmembranet som förinkuberats i metylalkohol i 20 sekunder med hjälp av ett våtöverföringssystem för överföring i en timme vid 200 milliampère. Förbered 5% BSA-blockerande buffert genom att tillsätta 2,5 gram BSA och 50 ml TBST i ett 50 ml centrifugrör. Blockera membranen i denna buffert i två timmar vid rumstemperatur med omrörning.Inkubera membranen med specifika primära antikroppar utspädda med TBST till rätt koncentration över natten vid fyra grader Celsius. Tvätta membranen i tvättbufferten fyra gånger och inkubera membranen med lämpliga sekundära antikroppar i en timme vid rumstemperatur under omrörning. Efter att ha tvättat membranen i tvättbufferten fyra gånger, avbilda membranen med hjälp av kemiluminiscenssatsen i ett gelavbildningssystem.Transmissionselektronmikroskopin och nanopartikelspårningsanalysen avslöjade att de typiska morfologiska egenskaperna hos extracellulära vesiklar var runda och koppformade med en diameter som sträckte sig från 500 till 300 nanometer. Flödescytometrianalys visar procentandelarna av specifika membranmarkörer uttryckta på extracellulära vesiklar som innebär deras ursprung från moderceller. Western blot-analys visar uttrycket av PGD respektive PKM2 som en representant för proteininnehåll och extracellulära vesiklar i plasma och extracellulära vesiklar i ben, vilket indikerar metabolisk status.Negativt uttryck av Golgin-84 i extracellulära vesiklar detekterades med närvaron av mitofilin, alfa-aktinin-4, flotillin-1, caveolin-1 och beta-aktin, tillsammans med vesikelmarkören CD9, medan CD81-uttrycket är lågt eller frånvarande med brist på APO-A-1-existens i plasma extracellulära vesiklar. Forskare, så med tanke på att steg 2.2, beredningen och matsmältningen av vävnadsproverna bör göras tillräckligt. Annars är antalet extracellulära vesiklar extraherade från vävnaderna begränsat.Markören märkt fluorescerande fläck av de extracellulära vesiklarna kan injiceras i munnen för att behandla fasen som är kopplad till potentiell funktion.

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation and Analysis of Hematopoietic Stem Cells from the Placenta

Isolering och analys av hematopoetiska stamceller från moderkakan

Hematopoietic stem cells (HSCs) have the ability to self-renew and generate all cell types of the blood lineages throughout the lifetime of an individual. ...

Solid Phase Synthesis of a Functionalized Bis-Peptide Using "Safety Catch" Methodology

Fastfassyntes av en funktionaliserad Bis-peptid Använda &quot;Safety Catch&quot; Metodik

In 1962, R.B. Merrifield published the first procedure using solid-phase peptide synthesis as a novel route to efficiently synthesize peptides. This ...

Techniques for the Analysis of Extracellular Vesicles Using Flow Cytometry

Tekniker för analys av extracellulärt Blåsor Använda flödescytometri

Extracellular Vesicles (EVs) are small, membrane-derived vesicles found in bodily fluids that are highly involved in cell-cell communication and help ...

Enrichment of Extracellular Matrix Proteins from Tissues and Digestion into Peptides for Mass Spectrometry Analysis

Anrikning av extracellulära matrixproteiner från vävnader och matsmältning i peptider för masspektrometri analys

The extracellular matrix (ECM) is a complex meshwork of cross-linked proteins that provides biophysical and biochemical cues that are major regulators of ...

Analysis of Cell Suspensions Isolated from Solid Tissues by Spectral Flow Cytometry

Analys av cellsuspensioner Isolerade från fasta vävnader från Spectral flödescytometri

Flow cytometry has been used for the past 40 years to define and analyze the phenotype of lymphoid and other hematopoietic cells. Initially restricted to ...

Flow Cytometric Analysis of Extracellular Vesicles from Cell-conditioned Media

Flow flödescytometrisk analys av extracellulära blåsor från Cell-villkorade Media

Flow cytometry (FC) is the method of choice for semi-quantitative measurement of cell-surface antigen markers. Recently, this technique has been used for ...

Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

Rening och analys av Caenorhabditis elegans Extracellulära blåsor

The secretion of small membrane-bound vesicles into the external environment is a fundamental physiological process of all cells. These extracellular ...

Nanoparticle Tracking Analysis for the Quantification and Size Determination of Extracellular Vesicles

Nanopartikelspårningsanalys för kvantifiering och storleksbestämning av extracellulära blåsor

The physiological and pathophysiological roles of extracellular vesicles (EVs) have become increasingly recognized, making the EV field a quickly evolving ...

Scalable Isolation and Purification of Extracellular Vesicles from Escherichia coli and Other Bacteria

Scalable Isolation and Purification of Extracellular Vesicles from Escherichia coli and Other Bacteria

Skalbar isolering och rening av extracellulära vesiklar från Escherichia coli och andra bakterier

Diverse bacterial species secrete ~20-300 nm extracellular vesicles (EVs), comprised of lipids, proteins, nucleic acids, glycans, and other molecules ...