Name: isolation and analysis of traceable and functionalized extracellular vesicles from the plasma and solid tissues
Uploaded: 2022-10-17T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Analysis of Traceable and Functionalized Extracellular Vesicles from the Plasma and Solid Tissues at JoVE.com

Bu çalışma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (32000974, 81870796, 82170988 ve 81930025) ve Çin Doktora Sonrası Bilim Vakfı (2019M663986 ve BX20190380) tarafından desteklenmiştir. Temel Tıp Ulusal Deneysel Öğretim Gösteri Merkezi'nin (AMFU) yardımı için minnettarız.

Hayvan deneyleri, Dördüncü Askeri Tıp Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi Kılavuzları ve ARRIVE kılavuzlarına uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Bu çalışma için 8 haftalık C57Bl / 6 fareleri (dişi veya erkek tercihi olmadan) kullanılmıştır. Plazma ve doku EV'lerinin izole edilmesinde yer alan adımlar Şekil 1'de gösterilmiştir. Plazma, vücut sıvılarından EV izolasyon prosedürünü tanımlamak için bir temsilci olarak alınır. Maksille...

<ol>
	<li>Abels, E. R., Breakefield, X. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introduction+to+extracellular+vesicles:+biogenesis,+RNA+cargo+selection,+content,+release,+and+uptake.">Introduction to extracellular vesicles: biogenesis, RNA cargo selection, content, release, and uptake.</a> Cellular and Molecular Neurobiology. 36 (3), 301-312 (2016).</li><li>Mathieu, M., Martin-Jaular, L., Lavieu, G., Th&#233;ry, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specificities+of+secretion+and+uptake+of+exosomes+and+other+extracellular+vesicles+for+cell-to-cell+communication.">Specificities of secretion and uptake of exosomes and other extracellular vesicles for cell-to-cell communication.</a> Nature Cell Biology. 21 (1), 9-17 (2019).</li><li>Van Niel, G., D'Angelo, G., Raposo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shedding+light+on+the+cell+biology+of+extracellular+vesicles.">Shedding light on the cell biology of extracellular vesicles.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (4), 213-228 (2018).</li><li>Witwer, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardization+of+sample+collection,+isolation+and+analysis+methods+in+extracellular+vesicle+research.">Standardization of sample collection, isolation and analysis methods in extracellular vesicle research.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 2 (1), 20360 (2013).</li><li>Keshtkar, S., Azarpira, N., Ghahremani, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cell-derived+extracellular+vesicles:+novel+frontiers+in+regenerative+medicine.">Mesenchymal stem cell-derived extracellular vesicles: novel frontiers in regenerative medicine.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 9 (1), 63 (2018).</li><li>Thietart, S., Rautou, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles+as+biomarkers+in+liver+diseases:+A+clinician's+point+of+view.">Extracellular vesicles as biomarkers in liver diseases: A clinician's point of view.</a> Journal of Hepatology. 73 (6), 1507-1525 (2020).</li><li>Xia, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Damaged+brain+accelerates+bone+healing+by+releasing+small+extracellular+vesicles+that+target+osteoprogenitors.">Damaged brain accelerates bone healing by releasing small extracellular vesicles that target osteoprogenitors.</a> Nature Communications. 12 (1), 6043 (2021).</li><li>In’t Veld, S. G. J. G., Wurdinger, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor-educated+pletelets.">Tumor-educated pletelets.</a> Blood. 133 (22), 2359-2364 (2019).</li><li>Schwager, S. C., Reinhart-King, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanobiology+of+microvesicle+release,+uptake,+and+microvesicle-mediated+activation.">Mechanobiology of microvesicle release, uptake, and microvesicle-mediated activation.</a> Current Topics in Membranes. 86, 255-278 (2020).</li><li>Brahmer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=endothelial+cells+and+leukocytes+contribute+to+the+exercise-triggered+release+of+extracellular+vesicles+into+the+circulation.">endothelial cells and leukocytes contribute to the exercise-triggered release of extracellular vesicles into the circulation.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 8 (1), 1615820 (2019).</li><li>Yang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood+collection+through+subclavian+vein+puncture+in+mice.">Blood collection through subclavian vein puncture in mice.</a> Journal of Visualized Experiments. (147), e59556 (2019).</li><li>Han, L., Lam, E. W., Sun, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles+in+the+tumor+microenvironment:+old+stories,+but+new+tales.">Extracellular vesicles in the tumor microenvironment: old stories, but new tales.</a> Molecular Cancer. 18 (1), 59 (2019).</li><li>Gelibter, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+storage+on+extracellular+vesicles:+A+systematic+study.">The impact of storage on extracellular vesicles: A systematic study.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 11 (2), 12162 (2022).</li><li>Forsyth, C. B., Mathews, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphocytes+utilize+CD11b/CD18+for+adhesion+to+Candida+albicans.">Lymphocytes utilize CD11b/CD18 for adhesion to Candida albicans.</a> Cellular Immunology. 170 (1), 91-100 (1996).</li><li>Kodama, J., Kaito, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoclast+multinucleation:+review+of+current+literature.">Osteoclast multinucleation: review of current literature.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (16), 5685 (2020).</li><li>Welsh, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MIFlowCyt-EV:+a+framework+for+standardized+reporting+of+extracellular+vesicle+flow+cytometry+experiments.">MIFlowCyt-EV: a framework for standardized reporting of extracellular vesicle flow cytometry experiments.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 9 (1), 1713526 (2020).</li><li>Durcin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterisation+of+adipocyte-derived+extracellular+vesicle+subtypes+identifies+distinct+protein+and+lipid+signatures+for+large+and+small+extracellular+vesicles.">Characterisation of adipocyte-derived extracellular vesicle subtypes identifies distinct protein and lipid signatures for large and small extracellular vesicles.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1305677 (2017).</li><li>Kowal, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+comparison+defines+novel+markers+to+characterize+heterogeneous+populations+of+extracellular+vesicle+subtypes.">Proteomic comparison defines novel markers to characterize heterogeneous populations of extracellular vesicle subtypes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (8), 968-977 (2016).</li><li>Noren Hooten, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+extracellular+vesicle+protein+cargo+with+race+and+clinical+markers+of+mortality.">Association of extracellular vesicle protein cargo with race and clinical markers of mortality.</a> Scientific Reports. 9 (1), 17582 (2019).</li><li>Sidhom, K., Obi, P. O., Saleem, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+exosomal+isolation+methods:+is+size+exclusion+chromatography+the+best+option.">A review of exosomal isolation methods: is size exclusion chromatography the best option.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (18), 6466 (2020).</li><li>Pietrowska, M., Wlosowicz, A., Gawin, M., Widlak, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MS-based+proteomic+analysis+of+serum+and+plasma:+problem+of+high+abundant+components+and+lights+and+shadows+of+albumin+removal.">MS-based proteomic analysis of serum and plasma: problem of high abundant components and lights and shadows of albumin removal.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 1073, 57-76 (2019).</li><li>Coumans, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methodological+guidelines+to+study+extracellular+vesicles.">Methodological guidelines to study extracellular vesicles.</a> Circulation Research. 120 (10), 1632-1648 (2017).</li><li>Th&#233;ry, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimal+information+for+studies+of+extracellular+vesicles+2018+(MISEV2018):+a+position+statement+of+the+International+Society+for+Extracellular+Vesicles+and+update+of+the+MISEV2014+guidelines.">Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).</li><li>Witwer, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardization+of+sample+collection,+isolation+and+analysis+methods+in+extracellular+vesicle+research.">Standardization of sample collection, isolation and analysis methods in extracellular vesicle research.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 2 (1), 20360 (2013).</li><li>Coumans, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methodological+guidelines+to+study+extracellular+vesicles.">Methodological guidelines to study extracellular vesicles.</a> Circulation Research. 120 (10), 1632-1648 (2017).</li><li>G&#246;rgens, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+storage+conditions+stabilizing+extracellular+vesicles+preparations.">Identification of storage conditions stabilizing extracellular vesicles preparations.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 11 (6), 12238 (2020).</li><li>Maroto, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+storage+temperature+on+airway+exosome+integrity+for+diagnostic+and+functional+analyses.">Effects of storage temperature on airway exosome integrity for diagnostic and functional analyses.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1359478 (2017).</li><li>Zheng, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoptotic+vesicles+restore+liver+macrophage+homeostasis+to+counteract+type+2+diabetes.">Apoptotic vesicles restore liver macrophage homeostasis to counteract type 2 diabetes.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 10 (7), 12109 (2021).</li><li>Liu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+apoptotic+bodies+maintain+mesenchymal+stem+cell+homeostasis+and+ameliorate+osteopenia+via+transferring+multiple+cellular+factors.">Circulating apoptotic bodies maintain mesenchymal stem cell homeostasis and ameliorate osteopenia via transferring multiple cellular factors.</a> Cell Research. 28 (9), 918-933 (2018).</li><li>Vander Pol, E., van Gemert, M. J., Sturk, A., Nieuwland, R., van Leeuwen, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+vs.+swarm+detection+of+microparticles+and+exosomes+by+flow+cytometry.">Single vs. swarm detection of microparticles and exosomes by flow cytometry.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 10 (5), 919-930 (2012).</li><li>Dawson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+lipid+rafts+(detergent-resistant+microdomains)+and+comparison+to+extracellular+vesicles+(exosomes).">Isolation of lipid rafts (detergent-resistant microdomains) and comparison to extracellular vesicles (exosomes).</a> Methods in Molecular Biology. 2187, 99-112 (2021).</li><li>Zhang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles:+Natural+liver-accumulating+drug+delivery+vehicles+for+the+treatment+of+liver+diseases.">Extracellular vesicles: Natural liver-accumulating drug delivery vehicles for the treatment of liver diseases.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 10 (2), 12030 (2020).</li><li>Vella, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rigorous+method+to+enrich+for+exosomes+from+brain+tissue.">A rigorous method to enrich for exosomes from brain tissue.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1348885 (2017).</li></ol>

EV'lerin özelliklerini, kaderini ve işlevini incelerken, EV'leri yüksek verim ve düşük kontaminasyonla izole etmek çok önemlidir. EV'leri çıkarmak için yoğunluk gradyanı santrifüjleme (DGC), boyut dışlama kromatografisi (SEC) ve immünoyakalama testleri 4,20 gibi çeşitli yöntemler mevcuttur. Burada en sık kullanılan yöntemlerden biri olan diferansiyel santrifüjleme kullanılmıştır; Bunun avantajları, zaman alıcı olmaması, sınırlı ...

Hücre dışı veziküllerin (EV'ler), çeşitli fizyolojik ve patolojik olaylarda önemli rol oynayan hücre dışı yapılarıtanımlamak için hücre dışı veziküller (EV'ler) önerilmiştir2. Sağlıklı hücreler tarafından salınan EV'ler genel olarak iki ana kategoriye ayrılabilir: hücre içi endositik trafik yolu3 yoluyla oluşan eksozomlar (veya küçük EV'ler) ve hücre4'ün plazma zarının dışa doğru tomurcuklanmasıyla gelişen mikro-parçacıklar (veya büyük EV'ler). Birçok çalışma, in vitro5 kültürlü hücrelerden toplanan EV'lerin işlevine odaklanırken, dolaşımdan veya dokulardan türetilen EV'ler, organizmanın gerçek durumunu in vivo6'da yansıtma avantajına sahip olan daha karmaşık ve heterojendir. Ayrıca, hemen hemen her türlü doku in vivo EV'ler üretebilir ve bu EV'ler doku içinde haberci olarak hareket edebilir veya sistemik iletişimi kolaylaştırmak için çeşitli vücut sıvıları, özellikle periferik kan tarafından aktarılabilir7. Dolaşımdaki EV'ler ve dokular da hastalık tanı ve tedavisi için hedeflerdir8.
Eksozomlar son yıllarda yoğun bir şekilde çalışılırken, mikro-parçacıklar ayrıca ultrasantrifüjleme olmadan kolayca ekstrakte edilebilen önemli biyolojik fonksiyonlara sahiptir, böylece temel ve klinik araştırmaları teşvik eder9. Özellikle, dolaşımdan ve dokulardan izole edilen EV'lerle ilgili kritik bir konu, farklı hücre tiplerinden türetilmiş olmalarıdır10. Mikro-parçacıklar plazma zarından kesildiğinden ve bol miktarda hücre yüzey molekülü9 ile öne çıktığından, bu EV'lerin hücresel kökenini tanımlamak için ana hücre zarı belirteçlerinin kullanılması mümkündür. Spesifik olarak, membran belirteçlerini tespit etmek için akış sitometrisi (FC) tekniği uygulanabilir. Dahası, araştırmacılar EV'leri izole edebilir ve fonksiyonel kargolara dayanarak daha fazla analiz yapabilirler.
Mevcut protokol, EV'leri in vivo örneklerden çıkarmak ve karakterize etmek için kapsamlı bir prosedür sunmaktadır. EV'ler diferansiyel santrifüjleme yoluyla izole edilir ve EV'lerin karakterizasyonu, nanopartikül izleme analizi (NTA) ve iletim elektron mikroskobu (TEM) yoluyla morfolojik tanımlamayı, FC yoluyla orijin analizini ve batı lekesi yoluyla protein kargo analizini içerir. Farelerin kan plazması ve maksiller kemiği temsilci olarak kullanılır. Araştırmacılar, diğer kaynaklardan EV'ler için bu protokole başvurabilir ve ilgili değişiklikleri yapabilirler.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>4% paraformaldehyde&#160;</td>
			<td>Biosharp</td>
			<td>143174</td>
			<td>Transmission electron microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa fluor 488 anti-goat secondary antibody</td>
			<td>Yeason</td>
			<td>34306ES60</td>
			<td>Flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa fluor 488 anti-rabbit secondary antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11008</td>
			<td>Flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD18 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab131044</td>
			<td>Flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD81 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab109201</td>
			<td>Western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD9 antibody</td>
			<td>Huabio</td>
			<td>ET1601-9</td>
			<td>Western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mitofilin antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab110329</td>
			<td>Western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APOA1 Rabbit pAb</td>
			<td>Abclone</td>
			<td>A14211</td>
			<td>Western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA protein assay kit</td>
			<td>TIANGEN</td>
			<td>PA115</td>
			<td>Western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BLUeye Prestained Protein Ladder</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>94964-500UL</td>
			<td>Western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>MP Biomedical</td>
			<td>218072801</td>
			<td>Western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caveolin-1 antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-53564</td>
			<td>Western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellMask Orange plasma membrane stain</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C10045</td>
			<td>Flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemiluminescence</td>
			<td>Amersham Biosciences</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved operating scissor</td>
			<td>JZ Surgical Instrument</td>
			<td>J21040</td>
			<td>EV isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electronic balance</td>
			<td>Zhi Ke</td>
			<td>ZK-DST</td>
			<td>EV isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epoch spectrophotometer</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3810X</td>
			<td>EV isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flotillin-1 antibody</td>
			<td>PTM BIO</td>
			<td>PTM-5369</td>
			<td>Western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel imaging system</td>
			<td>Tanon</td>
			<td>4600</td>
			<td>Western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Golgin84</td>
			<td>Novus</td>
			<td>nbp1-83352</td>
			<td>Western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grids - Formvar/Carbon Coated - Copper 200 mesh</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>24915</td>
			<td>Transmission electron microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin Solution</td>
			<td>StemCell&#160;</td>
			<td>7980</td>
			<td>EV isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liberase Research Grade</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>5401127001</td>
			<td>EV isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscopic tweezer</td>
			<td>JZ Surgical Instrument</td>
			<td>JD1020</td>
			<td>EV isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NovoCyte flow cytometer</td>
			<td>ACEA</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Omni-PAGE Hepes-Tris Gels Hepes 4~20%, 10 wells</td>
			<td>Epizyme</td>
			<td>LK206</td>
			<td>Western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OSCAR(D-19) antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>SC-34235</td>
			<td>Flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (2x)</td>
			<td>ZHHC</td>
			<td>PW013</td>
			<td>Western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pentobarbital sodium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>57-33-0</td>
			<td>Anesthetization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L)</td>
			<td>Jacson</td>
			<td>115-035-003</td>
			<td>Western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)</td>
			<td>Jacson</td>
			<td>111-035-003</td>
			<td>Western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphotungstic acid</td>
			<td>RHAWN</td>
			<td>12501-23-4</td>
			<td>Transmission electron microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PKM2(d78a4) xp rabbit&#160; mab&#160;</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>4053t</td>
			<td>Western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene (PE) film</td>
			<td>Xiang yi</td>
			<td>200150055</td>
			<td>Transmission electron microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyvinylidene fluoride membranes&#160;</td>
			<td>Roche</td>
			<td>3010040001</td>
			<td>Western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitors</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4693132001</td>
			<td>Western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant anti-PGD antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab129199</td>
			<td>Western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RIPA lysis buffer</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>P0013</td>
			<td>Western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS-PAGE loading buffer (5x)</td>
			<td>Cwbio</td>
			<td>CW0027S</td>
			<td>Western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Size beads</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>F13839</td>
			<td>Flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tabletop High-Speed Micro Centrifuges</td>
			<td>Hitachi</td>
			<td>CT15E</td>
			<td>EV isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transmission electron microscope</td>
			<td>HITACHI</td>
			<td>H-7650</td>
			<td>Transmission electron microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>19472</td>
			<td>Western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex Mixer Genie</td>
			<td>Scientific Industries</td>
			<td>SI0425</td>
			<td>EV isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZetaView BASIC NTA - Nanoparticle Tracking Video Microscope PMX-120</td>
			<td>Particle Metrix</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Nanoparticle tracking analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-Actinin-4 Rabbit mAb</td>
			<td>Abclone</td>
			<td>A3379</td>
			<td>Western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-actin</td>
			<td>Cwbio</td>
			<td>CW0096M</td>
			<td>Western blot</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and analysis of traceable and functionalized extracellular vesicles from the plasma and solid tissues

Dolaşımdaki ve dokuda yerleşik hücre dışı veziküller (EV'ler) yeni teranostik biyobelirteçler olarak umut verici hedefleri temsil eder ve organizma homeostazının korunmasında ve geniş bir hastalık spektrumunun ilerlemesinde önemli oyuncular olarak ortaya çıkarlar. Mevcut araştırma, endozomal kökenli endojen eksozomların karakterizasyonuna odaklanırken, plazma zarından dökülen mikro-parçacıklar, ana hücrelerin zar imzasını özetleyen yüzey moleküllerinin bolluğu ile öne çıkan sağlık ve hastalıkta artan bir dikkat kazanmıştır. Burada, EV'leri plazmadan ve kemik gibi katı dokulardan çıkarmak ve karakterize etmek için diferansiyel santrifüjlemeye dayanan tekrarlanabilir bir prosedür sunulmaktadır. Protokol ayrıca, yüzey antijenlerinin ve EV'lerin protein yüklerinin daha sonraki profillemelerini açıklamaktadır, bu nedenle türevleri için izlenebilir ve potansiyel fonksiyonla ilgili bileşenlerle tanımlanmıştır. Bu yöntem, biyolojik, fizyolojik ve patolojik çalışmalarda EV'lerin korelasyonlu, fonksiyonel ve mekanik analizi için yararlı olacaktır.

Deneysel iş akışına göre, EV'ler periferik kan ve katı dokulardan çıkarılabilir (Şekil 1). 8 haftalık bir farenin maksiller kemiği yaklaşık 0.1 ± 0.05 g'dır ve fareden yaklaşık 300 μL plazma toplanabilir. Protokol adımlarını takiben, sırasıyla 0.3 mg ve 3 μg EV toplanabilir. TEM ve NTA ile analiz edildiği gibi, EV'lerin tipik morfolojik özellikleri, çapı 50-300 nm arasında değişen yuvarlak fincan şeklindeki membran vezikülleridir (Şekil...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Analysis of Traceable and Functionalized Extracellular Vesicles from the Plasma and Solid Tissues at JoVE.com

Isolation and Analysis of Traceable and Functionalized Extracellular Vesicles from the Plasma and Solid Tissues

Bu protokol, periferik kan ve katı dokulardan hücre dışı veziküllerin çıkarılması ve daha sonra yüzey antijenlerinin ve protein kargolarının profillenmesi için bir yöntem tanımlamaktadır.

Plazma ve Solid Dokulardan İzlenebilir ve İşlevselleştirilmiş Hücre Dışı Veziküllerin İzlenmesi ve Analizi

Circulating and tissue-resident extracellular vesicles (EVs) represent promising targets as novel theranostic biomarkers, and they emerge as important ...

Bu protokol, çoğu kan ve katı dokudan doğru hücre dışı vezikülleri izole etmek ve toplamak, özellikle kaynaklarını ve protein içeriklerini analiz etmek için uygun bir yol sağlar, bu da daha fazla fonksiyonel deneye yardımcı olur. Yüksek verim ve düşük kontaminasyonun yanı sıra, bu protokolün temel avantajı, fizyolojik ve patolojik çalışmalar için yararlı olan EV'lerin yüzey antijenlerinin ve protein yüklerinin analizidir. Bir akış sitometresi ile hücre dışı veziküllerin ebeveyn hücrelerinin yüzey belirteçlerinin tespiti yoluyla enflamatuar hastalıklar ve osteoporoz gibi hastalıkların kanserlerinin teşhisini kolaylaştırır.Doku hücre dışı vezikül miktarı aşağıdaki deneyler için kritik öneme sahiptir. Hücre dışı vezikül konsantrasyonunun yüksek olmadığından emin olun. Seyreltmeyi gerçekleştirmek için sabırlı olun.Başlamak için, maksiller kemiği oftalmik cımbız ve makasla izole ederek maksiller kemik örneklerini hazırlayın ve cımbızla yumuşak dokulardan kurtulmak için PBS ile yıkayın. Daha sonra maksiller kemiği 1.5 mililitrelik santrifüj tüplerine koyun ve kemiği makasla çapı bir milimetre olan küçük parçalara bölün. Dokuyu örtmek için belirli miktarda Liberaz ekleyin ve 37 santigrat derecede 30 dakika boyunca inkübe edin.Daha sonra, numuneyi 800 G'de dört santigrat derecede 10 dakika boyunca santrifüj edin ve süpernatantı bir pipetle dikkatlice yeni ve temiz bir 1,5 mililitrelik santrifüj tüplerine aktarın. Büyük hücre kalıntılarını ve kalan trombositleri çıkarmak için hazırlanan plazma ve kemik örneklerini 2.500 G ve dört santigrat derecede 15 dakika boyunca santrifüj ettikten sonra, süpernatantları yeni ve temiz 1.5 mililitrelik santrifüj tüplerine dikkatlice aktarın ve dört santigrat derecede 30 dakika boyunca 16.800 G'de santrifüj. Daha sonra, süpernatantı atın ve her tüpteki peletleri bir mililitre PBS ile yeniden askıya alın.Daha önce gösterildiği gibi süpernatantı santrifüj ettikten ve attıktan sonra, yine, her tüpteki peletleri 50 mikrolitre PBS ile yeniden askıya alın ve bu numuneleri 24 saatten daha az bir süre boyunca dört santigrat derecede saklayın veya tercihen analizler için hemen kullanın. Numuneleri 500 mikrolitre PBS ile yeniden askıya alın ve 50 mikrolitreyi, A tüpü olarak etiketlenmiş boş bir kontrol olarak yeni ve temiz bir 1,5 mililitre santrifüj tüpüne ve 50 mikrolitreyi, B tüpü olarak etiketlenmiş FITC için basit bir boyama tüpü olarak başka bir temiz 1,5 mililitre santrifüj tüpüne aktarın. Birincil tüpü 16.800 G'de 30 dakika santrifüj ettikten ve süpernatanı attıktan sonra, peletleri 200 mikrolitre PBS ile yeniden askıya alın.Her 50 mikrolitrelik numuneyi, tüp C olarak etiketlenmiş PE için basit boyama tüpleri, tüp D olarak etiketlenmiş yüzey işaretleyici boyama ve tüp E olarak etiketlenmiş ikincil antikor kontrolleri için dört adet 1,5 mililitrelik santrifüj tüpüne bölün.Osteoklast ilişkili reseptör ve kemik hücre dışı vezikül örneklerinin birincil antikorunu ve ayrıca CD-18 antikoru ve plazma hücre dışı vezikül örneklerini B tüpüne ve tüp D'ye ayrı ayrı ekleyin, dört santigrat derecede bir saat boyunca inkübasyon. Tüpleri santrifüj edin ve daha önce gösterildiği gibi süpernatantı atın ve peletleri 500 mikrolitre PBS ile yeniden askıya alın. Yine, ekstra birincil antikorları çıkarmak için 16, 800 G ve dört santigrat derecede 30 dakika boyunca santrifüj.Süpernatantı attıktan sonra peletleri 50 mikrolitre PBS ile yeniden askıya alın, ardından tüpte sırasıyla FITC konjuge ikincil antikorlar ekleyerek E.Tüm tüpleri karanlıkta dört santigrat derecede bir saat boyunca inkübe edin. Bir damla 0.2, 0.5 ve bir mikrometre boyutunda boncuk süspansiyonunu sırasıyla bir mililitre PBS'ye seyreltin. Daha sonra, hücre dışı veziküller için seçilen kapıdan emin olmak için her bir boncuk boyutunu çalıştırın ve uygun bir ileri saçılma kullanarak boncukları ve hücre dışı vezikül popülasyonunu aramak için akış sitometresinin eşiğini ayarlayın.Terminal koşulunu 100.000 membran boyalı partikülün hesaplanması olarak ayarlayın ve numuneyi makalede açıklandığı gibi bir akış sitometresi ile analiz edin. Peletleri 50 mikrolitre RIPA-lizis tamponunda tekrar askıya alın ve buz üzerinde 30 dakika inkübe edin. BCA protein testi ile 96 kuyucuklu mikroplakadaki tüm numunelerin protein konsantrasyonlarını ölçmek için, BSA'nın mililitresi başına iki miligramı% 0.9 normal salin ile mililitre başına 0.5 miligrama seyreltin.Mililitre BSA başına 0.5 miligramda ve normal salinin% 0.9'unda, belirli hacimlerde çoğaltılmış üç kuyucuğa. Daha sonra numunelerin iki mikrolitresini bırakın ve ayrı ayrı çoğaltılmış üç kuyucuğa 18 mikrolitre normal salin ekleyin. BCA reaktifi A'yı B reaktifi ile karıştırarak bir çalışma çözeltisi hazırladıktan sonra, her bir oyuğa 200 mikrolitre çalışma çözeltisi ekleyin ve 30 saniye boyunca hafifçe çalkalayın.Daha sonra 96 kuyucuklu mikroplakayı 37 santigrat derecede 20 ila 25 dakika boyunca inkübe edin ve spektrofotometre ile 596 nanometrede optik yoğunluğu ölçün. Ardından, verileri dışa aktarın, standart bir eğri çizin ve numunelerin protein konsantrasyonunu hesaplayın. Sonuçlara göre, numuneleri% 0.9 normal salin ve SDS-PAGE yükleme tamponunun konsantrasyonunun beş katı ile mikrolitre başına bir mikrograma seyreltin ve tüpleri filmle sıkıca kapatın ve 100 santigrat derecede beş dakika ısıtın.Numuneleri protein merdivenine% dört ila% 20 HEPy'nin tris jelinin gradyan konsantrasyonuna yükleyin. Jeli, proteinler bir çizgi oluşturana kadar 80 voltta çalışan tamponda çalıştırın. Ardından, yükleme boyası jelin dibinde olana kadar bir saat boyunca 120 volta geçin.Jeli, 200 miliamperde bir saat boyunca aktarmak için ıslak bir transfer sistemi kullanarak 20 saniye boyunca metil alkolde önceden inkübe edilmiş poliviniliden florür membranına aktarın. 50 mililitrelik bir santrifüj tüpüne 2,5 gram BSA ve 50 mililitre TBST ekleyerek %5 BSA bloke edici tampon hazırlayın. Bu tampondaki membranları oda sıcaklığında iki saat boyunca ajitasyonla bloke edin.Membranları, TBST ile seyreltilmiş spesifik primer antikorlarla inkübe edin, gece boyunca dört santigrat derecede uygun konsantrasyona getirin. Membranları yıkama tamponunda dört kez yıkayın ve çalkalama ile oda sıcaklığında bir saat boyunca uygun ikincil antikorlarla inkübe edin. Membranları yıkama tamponunda dört kez yıkadıktan sonra, bir jel görüntüleme sistemindeki kemilüminesans kitini kullanarak membranları görüntüleyin.İletim elektron mikroskobu ve nanopartikül izleme analizi, hücre dışı veziküllerin tipik morfolojik özelliklerinin 500 ila 300 nanometre arasında değişen bir çapa sahip yuvarlak ve fincan şeklinde olduğunu ortaya koymuştur. Akış sitometrisi analizi, hücre dışı veziküller üzerinde eksprese edilen spesifik membran belirteçlerinin yüzdelerini gösterir ve bu da ana hücrelerden kökenlerini ima eder. Western blot analizi, PGD ve PKM2'nin ekspresyonunu, protein içeriği ve plazma hücre dışı veziküllerin ve kemik hücre dışı veziküllerin bir temsilcisi olarak gösterir ve metabolik durumu gösterir.Hücre dışı veziküllerde Golgin-84'ün negatif ekspresyonu, mitofilin, Alfa-aktinin-4, Flotillin-1, Kaveolin-1 ve Beta-aktin'in vezikül markeri CD9 ile birlikte varlığı ile tespit edilirken, CD81 ekspresyonu, plazma hücre dışı veziküllerinde APO-A-1 varlığı eksikliği ile düşük veya yoktur. Araştırmacılar, bu nedenle adım 2.2'nin doku örneklerinin hazırlanması ve sindiriminin yeterli bir şekilde yapılması gerektiğini akılda tutarak. Aksi takdirde, dokulardan çıkarılan hücre dışı veziküllerin sayısı sınırlıdır.Hücre dışı veziküllerin floresan boyası etiketli belirteç, potansiyel fonksiyona bağlı fazı tedavi etmek için ağıza enjekte edilebilir.

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation and Analysis of Hematopoietic Stem Cells from the Placenta

Plasenta Hematopoetik Kök Hücre İzolasyonu ve Analizi

Hematopoietic stem cells (HSCs) have the ability to self-renew and generate all cell types of the blood lineages throughout the lifetime of an individual. ...

Solid Phase Synthesis of a Functionalized Bis-Peptide Using "Safety Catch" Methodology

Bir Fonksiyonlu Bis-Peptid Katı Faz Sentezi Metodolojisi &quot;Güvenlik&quot; Catch Kullanımı

In 1962, R.B. Merrifield published the first procedure using solid-phase peptide synthesis as a novel route to efficiently synthesize peptides. This ...

Techniques for the Analysis of Extracellular Vesicles Using Flow Cytometry

Akım Sitometri Kullanımı Ekstrasellüler Veziküller Analizi Teknikleri

Extracellular Vesicles (EVs) are small, membrane-derived vesicles found in bodily fluids that are highly involved in cell-cell communication and help ...

Enrichment of Extracellular Matrix Proteins from Tissues and Digestion into Peptides for Mass Spectrometry Analysis

Kütle Spektrometresi Analizi için Peptitler içine Dokular ve Sindirim gelen Ekstrasellüler Matriks Proteinleri zenginleştirilmesi

The extracellular matrix (ECM) is a complex meshwork of cross-linked proteins that provides biophysical and biochemical cues that are major regulators of ...

Analysis of Cell Suspensions Isolated from Solid Tissues by Spectral Flow Cytometry

Spektral Sitometrisi ile Katı Dokular İzole Hücre Cezalar Analizi

Flow cytometry has been used for the past 40 years to define and analyze the phenotype of lymphoid and other hematopoietic cells. Initially restricted to ...

Flow Cytometric Analysis of Extracellular Vesicles from Cell-conditioned Media

Hücre şartına ortamdan hücre dışı veziküller sitometrik analizinde akışı

Flow cytometry (FC) is the method of choice for semi-quantitative measurement of cell-surface antigen markers. Recently, this technique has been used for ...

Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

Arınma ve Caenorhabditis elegans Ekstrasellüler Veziküllerin Analizi

The secretion of small membrane-bound vesicles into the external environment is a fundamental physiological process of all cells. These extracellular ...

Nanoparticle Tracking Analysis for the Quantification and Size Determination of Extracellular Vesicles

Hücre Dışı Veziklinlerin Nicelleştirilmesi ve Boyut Tayini için Nanopartikül Takip Analizi

The physiological and pathophysiological roles of extracellular vesicles (EVs) have become increasingly recognized, making the EV field a quickly evolving ...

Scalable Isolation and Purification of Extracellular Vesicles from Escherichia coli and Other Bacteria

Scalable Isolation and Purification of Extracellular Vesicles from Escherichia coli and Other Bacteria

Ölçeklenebilir İzolasyon ve Escherichia coli ve Diğer Bakterilerden Hücre Dışı Veziküllerin Saflaştırılması

Diverse bacterial species secrete ~20-300 nm extracellular vesicles (EVs), comprised of lipids, proteins, nucleic acids, glycans, and other molecules ...