研究肌内脂肪（肌肉减少症和神经肌肉疾病的标志）的一个重要障碍是脂肪细胞的有效保存和随后的可视化，特别是在冷冻组织切片中。该协议保留了脂肪细胞形态和骨骼肌切片对齐，以实现肌肉内脂肪的稳健，严格和可重复的可视化和定量。我们的分析管道提供了一个框架，用于验证新的干预措施，以防止杜氏肌营养不良症等疾病中的脂肪形成 演示该过程将由我实验室的研究技术人员Connor Johnson主持。
首先，用新鲜的酒精擦拭物清洁要注射的腿部以进行消毒。将30至50微升的50%甘油吸入胰岛素注射器中。轻轻梳理胫骨上的头发，露出TA的位置。找到TA后，将针头插入TA远端靠近脚踝处。
将针头完全插入肌肉并缓慢注射甘油，同时逐渐拔出针头，这有助于损伤大部分肌肉。用70%乙醇充分喷洒要切入的小鼠的任何区域，以帮助防止头发远离解剖区域和器械。用剪刀切开靠近骨盆的腿顶周围的皮肤。
轻轻地将腿部皮肤从上到下拉到脚踝。首先，在收获TA之前，使用锋利的尖端镊子除去外结缔组织层。从肌肉底部滑动TA下方的镊子，从远端肌腱开始，轻轻向上拉向膝盖。停在肌肉的末端。
不要推过膝盖下部感觉到的阻力。如果在到达下膝盖之前有明显的阻力，请停止并继续去除剩余的结缔组织层。一旦TA用镊子从腿上部分抬起，用手术刀使用相同的动作切断TA与下膝盖的连接。
用剪刀将脚踝处的肌腱切开，以完全去除TA。只处理肌腱处的肌肉，以避免损伤纤维。在末端切开三分之一的TA，与肌腱相对。将其放入微型离心管中，然后将其放入液氮中快速冷冻。
将另外三分之二的组织浸没在标记的孔中，4%PFA用于组织学。一定要跟踪第一个和最后一个组织何时被放置在固定剂中。在螺母上以四摄氏度放置两到两个半小时。
固定后，从孔中除去PFA。用冷的X PBS冲洗纸巾两到三次，然后用冷的1X PBS清洗两到三次，每次洗涤五分钟。从孔中取出PBS，并在1X PBS中加入足够的30%蔗糖以使组织漂浮。
将螺母放在四摄氏度下过夜。打开显微镜并启动成像软件。将幻灯片固定在舞台上。
使用任何通道来标识要成像的区域。在成像软件中，调整每个通道的增益和曝光时间。拍摄每个通道中整个组织的图像，并合并各个瓷砖以形成整个TA横截面的复合体。
在开始之前，将游离RNase水预热至45摄氏度，并准备新鲜的70%乙醇。向每个含有样品的管中加入1000微升硫氰酸胍。重要的是，使用珠子敲击器批准的管子。
向每个管子添加三个中等珠子，或一个大珠子和一个小珠子。使用磁珠打浆器将组织以50赫兹均匀化两到四分钟。根据组织类型和样本大小，可能需要长达10分钟的时间。
加入200微升氯仿。摇匀样品15秒钟。在室温下孵育两到三分钟。
以12， 000倍离心15分钟G.移液出350微升的透明上清液，并加入到含有350微升70%乙醇的新微量离心管中。注意不要吸入较低的蛋白质和/或DNA层。将多达700微升的这种混合物转移到放置在两毫升收集管中的迷你离心柱中。
按照制造商的说明继续进行RNA分离。根据预期产量，用30至50微升的游离RNase水洗脱。将RNA保存在冰上，并使用分光光度计测量产量。
将RNA储存在零下80摄氏度。按照制造商的说明，使用多达一微克的 RNA 使用 cDNA 合成试剂盒合成 cDNA。运行完成后，加入80微升的RNase游离水。
将样品储存在零下20摄氏度。使用384孔格式，在每孔的底部加入一微升引物。自由干燥底漆可产生更紧密的技术重复。
盖上盖子，直到引物完全蒸发。使用四到八个技术重复设置样品反应。PCR运行完成后，将原始周期阈值归一化为管家基因水平，并通过计算δ-delta Ct来确定折叠变化。.Perilipin和来自未固定TA的阳性脂肪细胞与固定切片相比显着改变了形态，使得它们的鉴定，可视化和随后的定量更加困难且可能不准确。
相反，PFA固定保留了脂肪细胞形态，可以准确检测肌内脂肪。与未受伤的 TA 肌肉相比，甘油损伤在损伤后三天诱导早期脂肪生成标志物的表达，例如 PPAR γ 和 CEBP α。成熟的标志物，如脂联素和佩里利平，最早可以在甘油损伤后五天检测到。
使用遗传谱系示踪，大多数PDGF受体αFAPs表达谱系标记物EYFP。甘油损伤后7天，EYFP阳性FAPs已变成表达脂肪细胞的EYFP阳性周利平，表明FAPs确实是肌内脂肪的细胞来源。该方案也可以调整为可视化致肌室。
使用针对PAX7和MYOD1的抗体，肌肉干细胞和肌母细胞标志物分别可以在甘油损伤后五天轻松检测到，即使在PFA固定肌肉组织切片中也是如此。该方案也可以用于可视化和量化脂肪细胞和其他成人组织。此外，我们的组织保存技术与各种不同的站立技术兼容。
