Name: lineage tracing of inducible fluorescently-labeled stem cells in the adult mouse brain
Uploaded: 2022-05-20T14:00:00
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作者要感谢戴安娜·卡隆博士（哈佛医学院波士顿儿童医院）和马修·林恩斯博士（乔斯林糖尿病中心;缅因州医学中心研究所）用于利用mt-rtTA动物进行指导。

这里描述的所有方法都已获得俄亥俄州立大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准。
1. 创建系谱系追踪Tet-On小鼠系，育种策略和实验队列小鼠的基因分型
注意：在这里，我们概述了使用Rosa-mTmG作为经历Cre重组的荧光报告基因的Tet-On小鼠系统的创建，但是其他各种Cre-重组驱动的报告基因系也可以与Tet-On系统一起使用。
<ol><li>将一只雌?...

     

描述了一种在体内创建、利用和分析在成年小鼠脑内标记干细胞的三重转基因谱系追踪小鼠系的方法。当与免疫染色或脑清除相结合时，可以完成整个大脑中追踪荧光细胞的鉴定和表征。该技术提供了了解标记干细胞在激活，迁移，分化或增殖时的可塑性/再生/重塑潜力的能力。虽然以前通过胸腺嘧啶-H3和BrdU的标签保留获得的数据得出结论，V-SVZ，嗅球和齿状回的晶下区域是...

谱系跟踪鼠标行的值 体内干细胞的分析可能很困难，因为许多检查这些细胞的测定只集中在动物死亡时表征这些细胞，这代表了时间上的最终快照。为了更好地了解祖细胞、中间/过渡细胞类型和成熟细胞随时间推移的增殖、分化和迁移过程，需要一种纵向分析方法。这可以通过谱系追踪研究来实现，其中干细胞/祖细胞被不可磨灭地标记，并且可以在之后的任何时间长度内跟踪1。
在成年哺乳动物大脑中，首先通过胸腺嘧啶-H 3 2，3，4或5-溴-2'-脱氧尿苷（BrdU）5，6，7，8的标记保留来分析从干细胞和祖细胞产生成人出生的神经元的神经发生过程.在这些研究中，增殖细胞用胸腺嘧啶类似物标记，胸腺嘧啶类似物在复制和细胞分裂/增殖期间被掺入细胞的DNA中。因此，标记的细胞以及它们的后代包含这种类似物，然后在死后识别出来。然而，虽然胸苷-H3和BrdU允许在干细胞知之甚少的大脑区域中标记增殖细胞及其后代，但这些研究受到这些工具的缺点的阻碍。胸苷-H3诱导细胞周期停滞，细胞凋亡和剂量依赖性DNA合成抑制9，而BrdU根据给药途径10标记不同水平的细胞，并在修复或凋亡期间以及细胞分裂11期间被细胞吸收。最近已经使用了更有效的标记方法，例如用5-乙炔基-2'-脱氧尿苷（EdU）标记，但许多与BrdU相同的问题仍然存在12。这些方法也有局限性，因为它们标记了任何增殖细胞，而不仅仅是干细胞，因此对结果的解释可能会混淆。在神经源性谱系中，所有干细胞和祖细胞都保留有丝分裂能力，只有终末/成熟神经元不增殖。对于星形胶质细胞和小胶质细胞，但不是少突胶质细胞，增殖无限期地维持13，14，15。
因此，在研究干细胞及其后代时，转基因小鼠习惯于仅对表达感兴趣蛋白质的细胞进行谱系追踪，例如我们在这里使用的确认鉴定成体干细胞的细胞。虽然很难通过小鼠转基因方法产生，但谱系追踪小鼠品系允许追踪大脑中特定标记的细胞，并且不仅仅依赖于增殖。在Tet-On转基因小鼠系统中，施用四环素或多西环素（一种四环素衍生物）诱导使用反向四环素反式激活剂（rtTA）工程的细胞中的Cre-重组酶表达，该细胞由感兴趣的启动子转录。然后，Tet诱导的Cre驱动的重组将激活目标细胞中不可磨灭的荧光或发光蛋白的表达，这取决于所使用的Rosa报告小鼠。这些不可磨灭标记的细胞在分裂，分化或迁移后继续表达该报告基因，允许随着时间的推移或在不同干预之后跟踪这些细胞及其后代16。转基因谱系示踪方法的优点包括：1）追踪到RTTA标记的特定细胞谱系或祖细胞/干细胞的特异性，2）尽管细胞更新或分化，荧光或发光蛋白的不可磨灭表达，3）低毒性，4）在动物生命周期的任何一点有条件活化，以及5）易于使用常见测定， 包括免疫染色/免疫荧光16.
在小鼠中时间诱导报告工具的其他方法包括使用Cre-ERT2小鼠，其可以与ROSA-GFP，ROSA-mTmG或其他荧光报告基因转基因配对。在这些动物中，细胞特异性调节元件，例如感兴趣的启动子或增强子区域，驱动Cre重组酶的产生，其只能通过施用他莫昔 芬来激活 。虽然Cre-ERT2小鼠品系允许在特定细胞系中诱导Cre，但有大量知识详细介绍了他莫昔芬对成人神经发生的影响17，18。此外，还有许多ROSA驱动的荧光报告基因可以代替GFP或mTmG，包括YFP或CFP，这将允许在其他荧光波长上进行交替荧光标记。这些荧光报告基因可与检测开启或 Cre-ERT2 系统一起使用。
端粒酶逆转录酶（TERT）是全酶端粒酶的限速组分，其在细胞分裂期间缩短端粒19，20后起作用延长端粒。TERT已被确定为肠道21，22，骨髓21，肝脏23，脂肪24，子宫内膜25，26和骨1中成体组织干细胞的标志物。TERT在这些成体干细胞中的表达是仅用于端粒酶延伸活性还是执行非规范的TERT作用27仍然是未知的。TERT表达的静止成体干细胞（qASCs）已被鉴定出来，并与转基因谱系追踪小鼠一起在全身进行追踪，以研究这些干细胞的多能性和自我更新能力，以及它们激活，增殖，分化和迁移的潜力1，22，23，28。特-rtTA转基因的产生以前已经进行过1。在本文中，我们将描述使用谱系追踪TERT小鼠系来研究TERT + qASCs，我们已经将其确定为成年小鼠大脑中的新型ASC群体。
转基因谱系追踪小鼠系的产生 要使用Tet-On系统生成谱系追踪小鼠谱系，必须通过小鼠交配在单个动物内组合三种转基因。第一种是rtTA，在目的基因的启动子的控制下表达（我们的是TERT-rtTA）。因此，在表达该目的基因的细胞中，rtTA将被表达。第二个是oTet-Cre基因，它含有四环素响应元件（TRE），该元件允许在rtTA融合转录本和四环素或多西环素存在的情况下转录Cre重组酶。四环素或多西环素 可以通过饮用水或 chow29给予动物。最后，必须有一个基因将被Cre重组酶裂解激活。在这份手稿中，我们将描述的标记基因是Rosa26-mTmG基因，直到Cre重组之前，它将无处不在地转录mTomato（所有细胞中的膜红色荧光）。然而，如果一个细胞表达rtTA转录本并含有四环素或多西环素，则在mTomato和mGFP位点之间重组一组lox P位点的Cre重组将改变R26位点并导致细胞产生膜EGFP（mGFP或膜绿色荧光）而不是膜番茄。这种mGFP信号的不可磨灭性将允许在细胞增殖，迁移和分化时进行 体内 标记和追踪。在迹线之后，可以通过免疫荧光在标准冷冻切片或更厚的光学清除大脑中分析细胞的 GFP表达 。
在本文中，我们将描述特定小鼠线的使用，即为了创建这种三重转基因小鼠品系，我们首先将oTet-cre动物（杰克逊实验室菌株#006234）与罗莎-mTmG动物（杰克逊实验室菌株#007676）交配，以产生oTet-Cre：：Rosa-mTmG双转基因小鼠。用补充表1和2中指示的引物和PCR模板对这些动物进行基因分型。将小鼠（由大卫·布雷奥特1创建）与oTet-cre：：罗莎-m-mG动物交配以产生图1B说明了鼠线的作用机制。
多西环素诱导和脉搏追逐设计 在计划实验时，重要的是要考虑将影响谱系追踪实验结果的几个因素，包括多西环素诱导时动物的年龄，多西环素给药的长度（“脉冲”期），多西环素去除后组织收集前的时间长度（“追逐”期），以及这些过程中任何干预的时间。这些研究设计考虑因素对于在实验结束时了解标记细胞及其后代至关重要。该过程的第一步是确定动物感兴趣的年龄和多西环素给药的长度。更长的脉冲周期将允许更多的细胞表达rtTA连接的启动子表达，并且更多的感兴趣的细胞被不可磨灭地标记。表现出目的基因瞬时表达的细胞类型可能需要比连续表达目的基因的细胞更长的脉冲周期。然而，如果研究的目标是了解感兴趣的细胞或急性干预的短期影响，则脉搏周期不能太长，因为一旦标记了细胞，它将在脉冲周期的剩余时间内通过任意数量的变化进行追踪。在我们的一些研究中，没有追逐期的2天脉冲被用来更接近地模仿TERT的直接报告者。这是因为Rosa-mTmG基因重组的最短时间为2天31。
脉搏追逐实验的下一个重要时期是去除多西环素和灌注动物之间的长度，也称为“追逐”。无论给药途径如何，多西环素在小鼠中的半衰期约为170分钟，从而得出结论，多西环素诱导可能在去除后数小时不再发生32。然而，重要的是要注意，多西环素在老年小鼠中的代谢较慢，这可能导致比年轻动物更长的有效“脉冲”期33。
在追逐期间，标记的细胞将继续被标记，即使在增殖，分化或迁移之后也是如此。这些细胞的后代也将被标记。该研究的目标将塑造脉冲追逐范式的长度。如果研究的目的是了解组织在很长一段时间内与目标细胞的再生，则可能需要很长的追逐期。最后，必须决定任何干预或治疗的时间。在脉冲期间施用将影响表达目的基因的细胞以及在此期间产生的任何后代，而在追逐期间施用可能主要影响目标细胞的后代，尽管这将取决于标记细胞分裂或分化的速度。 图2A概述了我们利用的脉冲追逐实验设计示例。
同样重要的是要注意由于表达泄漏而产生背景GFP信号的可能性。在没有多西环素的情况下，rtTA和Otet序列之间的固有结合电位以及在没有rtTA的情况下Otet转基因的残余活性（在34中回顾）导致泄漏表达。渗漏表达代表了Tet系统的一个弱点，尽管泄漏通常是系统可接受的缺点，但泄漏表达可能导致毒性和死亡的情况，例如Otet-DTA动物中的白喉毒素（DTA）可以限制这些系统的使用35。
用于显微镜检查的薄片的脑处理、切片和免疫荧光 为了在谱系追踪实验后分析小鼠的大脑，必须首先 通过 经心灌注来灌注小鼠，以去除可能导致大脑中高自发荧光的血液和脑脊液。动物可能灌注两种常用的固定剂：组织回旋组织固定剂，乙二醛固定剂（GF）或4%多聚甲醛（PFA）。乙二醛固定剂允许相对温和的固定过程，交联比PFA少。这降低了组织僵硬，减少了抗原检索的需求，并允许在免疫染色过程中较少浓缩的抗体溶液。然而，如果它们含有甲醇，这可能有助于增加自发荧光36。另一方面，PFA通常允许更健壮的固定，虽然在免疫染色过程中需要抗原检索，但有些抗体只能与PFA固定的组织一起工作，并且需要灌注4%PFA用于后面描述的光学清除技术。
灌注后是注固后的步骤，其中大脑浸入灌注过夜期间使用的相同类型的固定剂中。这允许任何在灌注过程中可能尚未完全固定的大脑区域继续修复。接下来，大脑将在磷酸盐缓冲盐水（PBS）中的蔗糖中孵育，以在冷冻步骤之前除去尽可能多的水，以防止组织内结冰（“冷冻保存”）。然后，可以将大脑切成任意数量的矢状、冠状或横向组织切片进行处理。为了提高精度和可重复性，需要以一种确保动物之间一致的切割方式使用校准的脑块。可以影响大脑如何分割的最重要因素是感兴趣的大脑区域。例如，虽然矢状切口可能允许在一个组织切片中分析更多的脑区域，但这种切口将不允许分析心室下区（V-SVZ）的神经/胶质区域，因为外侧心室的外侧和内侧在该维度上无法识别，并且在冠状平面上可以更好地观察到。这可能是成人神经发生研究中要做出的重要区分，因为外侧心室的侧侧包含神经源性V-SVZ，而侧脑室的内侧壁是更强的胶质生态位37。
将组织分成冠状，矢状或横截面后，使用最佳冷却温度（OCT）包埋溶液将其冷冻成块。在这里，大脑被冻结在这种嵌入材料中，使用干冰和乙醇的混合物。如果需要薄片分析，则块将在低温恒温器上切片，并且根据所需的下游分析，可以作为薄片（<20μm）粘附在带正电的载玻片上。也可以使用未带电的载玻片，但使用未带电的载玻片可能导致组织从载玻片38中脱陷。如果需要中等厚度的自由漂浮组织切片（>20μm），组织将被收集为自由浮动切片。如果需要厚切片（0.5-4 mm），则需要使用振动切片机切割非冷冻脑切片。重要的是要注意载玻片上各部分之间的储存差异，这些切片需要在-20至-80°C下冷冻，而自由漂浮的部分则需要在4°C下储存。
脑清除和全山免疫荧光共聚焦显微镜检查 如果需要对小鼠大脑中的谱系追踪细胞进行更广泛但不太详细的分析，则可以使用iDISCO脑清除39 对较厚的脑组织片段进行全面分析，然后进行免疫染色和平铺z-stack共聚焦显微镜或光片显微镜检查。在这里，小鼠大脑的大部分将被光学清除（脱脂过程39），这更好地允许在1毫米的组织切片上进行荧光信号成像。该过程的缺点是高自发荧光，并且由于与更传统的方法（薄冷冻切片或自由浮动切片）相比所需的工作距离增加，因此获得高分辨率细胞形态图像和详细共染色分析的能力降低。出于这个原因，我们建议大脑清除来分析整个大脑区域的大规模谱系追踪结果，而不是试图表征或分析单个细胞。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Antibody diluent</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>S080983-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antigen Retrieval Solution</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>S2367</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-GFP antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A2311</td>
			<td>Use at 1:500-1:000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A18-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B6.Cg-Tg(tet0-cre)1Jaw/J</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>JAX:006234</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B6.129(Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo/J</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>JAX:007676</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blocking Solution (IHC)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>20773</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blunt needle</td>
			<td>BSTEAN</td>
			<td>X0012SYHIV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coronal brain block</td>
			<td>Braintree</td>
			<td>BS-2000C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover slip</td>
			<td>Corning</td>
			<td>2850-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat</td>
			<td>Leica</td>
			<td>CM1900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D564</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dibenzyl ether</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>33630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichloromethane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>270997</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey Serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9663</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Doxycycline Hyclate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9891</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0718</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin Sodium Salt from Porcine Mucosa</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histochoice Molecular Biology Tissue Fixative</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>H120</td>
			<td>This product has since been discontinued, but can be replaced with Glyo-Fixx (Thermo Scientific, 6764265)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen Peroxide Solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>516813</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IHC Select TBS Rinse Buffer</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>20845</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine</td>
			<td>Westward</td>
			<td>0143-95095-10</td>
			<td>This product requires a DEA license for storage and use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A452-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Slides</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milipore Block</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>20773</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting medium</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>5013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optimal Cutting Temperature Solution</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS Solution (10X)</td>
			<td>Teknova</td>
			<td>P0496</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sagittal brain block</td>
			<td>Braintree</td>
			<td>RBM-2000S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saline</td>
			<td>Braun</td>
			<td>S8004-5264</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sudan (Typogen) Black</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>199664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetrahydrofuran</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>186562</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue cartridge</td>
			<td>Simport</td>
			<td>M512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>655205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>AnaSed</td>
			<td>sc-362950Rx</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

lineage tracing of inducible fluorescently-labeled stem cells in the adult mouse brain

开发了一种端粒酶逆转录酶（Tert）谱系追踪小鼠系，通过将“Tet-On”系统oTet-Cre小鼠与与Tert启动子相关的新型反向四环素转激活剂（rtTA）转基因杂交，研究成体组织干细胞的行为和命运，我们已经证明这是一种新的成体脑干细胞群。在这里，向mTert-rtTA：：oTet-Cre小鼠施用四环素衍生物多西环素将不可磨灭地标记表达Tert基因启动子区域的4.4 kb片段的细胞群。当结合罗莎-mTmG报告基因时，在也表达特特的细胞中，多西环素处理诱导用膜EGFP（mGFP）取代多托马托表达。因此，当这些三重转基因谱系追踪小鼠接受多西环素（标记TERT表达细胞的“脉冲”期）时，这些细胞将变得不可磨灭地标记mGFP +细胞，即使在多西环素去除后（“追逐”期）可以跟踪任何理想的时间量，即使Tert表达随后丢失。然后将大脑灌注固定并处理为免疫荧光和其他下游应用，以解释干细胞活化，增殖，谱系承诺，迁移到各种脑壁以及分化成熟细胞类型的变化。使用该系统，任何rtTA小鼠都可以与oTet-Cre和Rosa报告基因交配，以使用干细胞标记进行多西环素诱导的“脉冲追逐”谱系追踪实验。

虽然由具有荧光报告基因的Tet-On系统产生的荧光信号将根据感兴趣的启动子和所使用的荧光团而变化，但我们将描述如何使用mTert-rtTA：：oTet-Cre：：Rosa-mTmG动物分析结果。在脉搏追逐后对成人大脑的分析导致膜GFP表达细胞遍布各种解剖学壁龛。必须注意各种细胞类型之间荧光强度的差异。关于荧光强度的一个变量是细胞膜的大小。例如，脉络丛中的脉络膜上皮细胞（CPECs）具有厚厚的细胞膜和强?...

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Lineage Tracing of Inducible Fluorescently-Labeled Stem Cells in the Adult Mouse Brain

使用诱导的转基因谱系追踪小鼠系，用荧光团永久标记干细胞及其后代的能力允许对 体内的活化，增殖，迁移和/或分化进行空间和时间分析。谱系追踪可以揭示有关谱系承诺、对干预的反应和多能性的新信息。

成年小鼠大脑中诱导荧光标记干细胞的谱系示踪

A telomerase reverse transcriptase (Tert) lineage-tracing mouse line was developed to investigate the behavior and fate of adult tissue stem cells, by ...

用可诱导的转基因谱系追踪小鼠系标记干细胞及其后代，可以对体内大脑中成体干细胞的活化、增殖、迁移和/或分化进行空间和时间分析。谱系追踪可以揭示有关谱系承诺、对干预措施的反应和多效性的新信息。转基因谱系示踪方法的优点包括追踪特定细胞谱系的特异性，无论细胞更新或分化如何，荧光蛋白的不可磨灭表达，多西环素的低毒性，条件激活以及易于与谱系痕量组织（包括免疫染色和免疫荧光）的常见下游测定一起使用。由于可塑性和细胞在成人大脑中的广泛影响，成体干细胞的表征和分析将有助于研究神经退行性疾病，代谢对大脑可塑性的影响，衰老和其他相关条件。首先，将温玻片加热至室温，并用冰冷的丙酮后固定15分钟。在1X冲洗缓冲液中洗涤载玻片五分钟，每步之间在室温下以每分钟60转的速度摇动。在室温下用0.3%Triton X-100透化核抗原10分钟。在室温下用0.3%吐温-20透化细胞质抗原静置10分钟。在 50 至 100 毫升的 1x DAKO 抗原检索溶液中，通过微波载玻片进行抗原检索，低速 10 分钟，两次。接下来，用缓冲液在室温下冲洗五分钟。将载玻片在室温下在0.3%酪氨酸黑中与70%乙醇孵育20分钟，然后用冲洗缓冲液洗涤。在组织周围绘制疏水屏障。用封闭试剂在37摄氏度下封闭20分钟。并与稀释的一抗一抗在抗体稀释液中在4摄氏度下孵育过夜。在室温下清洗载玻片10分钟。第二天，在室温下将Alexa Fluor二抗切片孵育10分钟。然后在冲洗缓冲液中洗涤载玻片两次，持续 10 分钟。将100微升与AlexaFluor 488偶联的1至500个抗GFP抗体覆盖脑切片，并在4摄氏度下孵育过夜以增强内源性Fluor4，标记迹线细胞。第二天，用冲洗缓冲液清洗两次。然后在流动的DI水中洗涤五分钟。用每毫升100纳克4'6-二氨基-2-苯基吲哚复染五分钟。然后在流动的去离子水中洗涤五分钟。在每个组织切片的顶部添加一滴荧光安全安装介质，并用22毫米×22毫米的盖玻片密封。建议在安装当天进行成像，以确保获得最佳信号。在经心灌注后开始固定和切片，在4%PFA中在4摄氏度下过夜。然后在室温下再呆一个小时。在室温下用1x PBS清洗大脑一小时两次。使用矢状脑块将大脑切成一毫米厚的部分，并放入含有1x PBS的五毫升微离心管中。对于甲醇预处理，首先在室温下用1x PBS洗涤一小时两次。在室温下用50%甲醇洗涤一小时。在室温下用80%甲醇洗涤一小时。在室温下用100%甲醇洗涤一小时，两次。用5%过氧化氢在20%二甲基亚砜和甲醇中在4摄氏度下漂白过夜。漂白后，在甲醇中洗涤样品两次，室温下洗涤两次。在室温下用20%二甲基亚砜和甲醇洗涤两次，每次。在室温下用80%甲醇洗涤一小时。在室温下用50%甲醇洗涤一小时。在室温下在PBS中洗涤两次，每次一小时。在PBS 0.2%曲拉子X-100中洗涤一小时，在室温下洗涤两次。对于清除大脑的免疫染色，首先将样品在1x PBS，0.2%Triton X-100，20%DMSO，0.3摩尔甘氨酸中，在37摄氏度的眼眶振荡器中孵育过夜。在轨道振荡器上阻断1x PBS，0.2%曲拉通X-100，10%DMSO，6%山羊血清，在37摄氏度下停留三天。将样品从猪粘膜中洗涤1x PBS，0.2%吐温-20，每毫升肝素钠盐10微克，在37摄氏度下洗涤两次，每次一小时。接下来，在1x PBS，0.2%吐温-20，每毫升肝素10微克，5%DMSO，3%山羊血清中含有1至500浓度的兔抗GFP AlexaFluor 488在轨道振荡器上孵育两天。在1x PBS，0.2%吐温-20中用每毫升肝素10微克在37摄氏度下在轨道振荡器上洗涤样品一小时三次，然后每天一次，持续两天。将样品在一毫升50%四氢呋喃和水中孵育过夜。将样品在一毫升80%THF四氢呋喃和水中孵育一小时。将样品在100%四氢呋喃中孵育两次，持续一小时。用无菌擦拭干燥样品，并在二氯甲烷中孵育，直到它们沉入小瓶底部。不要孵育超过60分钟。将样品在一毫升二苄基醚中孵育至澄清。将样品在室温下储存在二苄基醚中，直到准备好成像。为了对免疫染色的脑切片进行成像，通过共聚焦显微镜分析载玻片，其中可以确认多种抗体的共同表达。我们使用徕卡恒星五显微镜和HyD S混合探测器。要对清除的大脑进行成像，请使用具有自动载物台和自动平铺功能的倒置共聚焦显微镜。首先将一个清除的大脑切片平放在玻璃底皿上，淹没在二苄醚中。在谱系追踪的大脑中，在脉搏追逐期之后，观察到不同大脑区域和各种细胞类型的荧光强度的显着差异。脉络丛中的脉络膜上皮细胞具有厚厚的细胞膜和强烈的绿色荧光信号，表明它们来自Tert阳性细胞，很容易与周围细胞区分开来。脉络丛基质中的其他较小细胞类型具有较弱的GFP信号。在小脑中，伯格曼胶质细胞表达的GFP水平高于篮细胞，并且单个篮细胞之间也存在GFP表达的变化。对于工厂感觉神经元轴突，嗅球肾小球内腺小球内也表达高水平的GFP嗅觉神经元轴突，填充嗅球肾小球层的嗅球表达高水平的番茄膜，或红色荧光与大多数其他大脑区域相比，即使相同的神经元为GFP阳性，表明一些细胞在谱系追踪过程中似乎更慢地失去mTomato信号。相反，在脉络丛中GFP阳性细胞表达的m托马托低。在大多数其他大脑区域，番茄信号在大多数细胞类型中以低水平表达，内皮细胞是唯一一些荧光信号足够亮的细胞，可以从脑组织的红色荧光背景中脱颖而出。要记住的最重要的事情是，清除后的大脑中的荧光信号比大多数其他免疫测定的衰减速度更快。请记住，请尽快在七天内对样品进行成像。接下来，可以使用软件程序进行脑切片或透明大脑的成像，使用GFP信号对标记物进行着色以及我们对萤光的量化。

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay

成年鼠神经干细胞的分离和扩大使用神经干含量

Isolation and expansion of the putative neural stem cells (NSCs) from the adult murine brain was first described by Reynolds and Weiss in 1992 employing a ...

科研

神经科学

Growing Neural Stem Cells from Conventional and Nonconventional Regions of the Adult Rodent Brain

从成年鼠脑的常规和非常规地区日益增长的神经干细胞

Recent work demonstrates that central nervous system (CNS) regeneration and tumorigenesis involves populations of stem cells (SCs) resident within the ...

Electrophysiological Recording in the Brain of Intact Adult Zebrafish

在完整的成年斑马鱼大脑电生理记录

Previously, electrophysiological studies in adult zebrafish have been limited to slice preparations or to eye cup preparations and electrorentinogram ...

Assessing Cell Cycle Progression of Neural Stem and Progenitor Cells in the Mouse Developing Brain after Genotoxic Stress

神经干细胞和祖细胞在小鼠脑开发基因毒性应激后的评估细胞周期进程

Neurons of the cerebral cortex are generated during brain development from different types of neural stem and progenitor cells (NSPC), which form a ...

Lineage-reprogramming of Pericyte-derived Cells of the Adult Human Brain into Induced Neurons

谱系重编程的成人大脑的周细胞源性细胞诱导成神经细胞

Direct lineage-reprogramming of non-neuronal cells into induced neurons (iNs) may provide insights into the molecular mechanisms underlying neurogenesis ...

Conditional Genetic Transsynaptic Tracing in the Embryonic Mouse Brain

有条件的遗传跨突触标记在胚胎小鼠脑

Anatomical path tracing is of pivotal importance to decipher the relationship between brain and behavior. Unraveling the formation of neural circuits ...

Laser-guided Neuronal Tracing In Brain Explants

激光制导神经跟踪在脑外植体

We present a technique which combines an in vitro tracer injection protocol, which uses a series of electrical and pressure pulses to increase dye uptake ...

Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Mouse Subcallosal Zone

分离和成人神经干细胞的培养从鼠标Subcallosal区

Adult neural stem cells (aNSCs) can be used for the regeneration of damaged brain tissue. NSCs have the potential for differentiation and proliferation ...

An In Vivo Blood-brain Barrier Permeability Assay in Mice Using Fluorescently Labeled Tracers

An In Vivo Blood-brain Barrier Permeability Assay in Mice Using Fluorescently Labeled Tracers

用荧光标记示踪剂对小鼠血脑屏障通透性的体内检测

Blood-brain barrier (BBB) is a specialized barrier that protects the brain microenvironment from toxins and pathogens in the circulation and maintains ...

Intra-Arterial Delivery of Neural Stem Cells to the Rat and Mouse Brain: Application to Cerebral Ischemia

神经干细胞向大鼠和小鼠大脑的动脉内传递：对脑缺血的应用

Neural stem cell (NSC) therapy is an emerging innovative treatment for stroke, traumatic brain injury and neurodegenerative disorders. As compared to ...