Name: lineage tracing of inducible fluorescently-labeled stem cells in the adult mouse brain
Uploaded: 2022-05-20T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Lineage Tracing of Inducible Fluorescently-Labeled Stem Cells in the Adult Mouse Brain at JoVE.com

Forfatterne ønsker at takke Dr. Diana Carlone (Boston Children's Hospital, Harvard Medical School) og Dr. Matthew Lynes (Joslin Diabetes Center; Maine Medical Center Research Institute) til vejledning ved hjælp af mTert-rtTA dyr.

Alle metoder, der er beskrevet her, er blevet godkendt af Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) ved Ohio State University.
1. Oprettelse af en afstamning, der sporer Tet-On muselinje, avlsstrategier og genotypning for eksperimentelle kohortemus
BEMÆRK: Her skitserer vi oprettelsen af et Tet-On-musesystem med Rosa-mTmG som det fluorescerende reportergen, der gennemgår Cre-rekombination, men forskellige andre Cre-rekombinationsdrevne rep...

     

En metode til oprettelse, udnyttelse og analyse af en tredobbelt transgen afstamning, der sporer muselinjemærkning af stamceller i den voksne musehjerne in vivo, er beskrevet. Når det kombineres med immunostaining eller hjernerensning, kan identifikation og karakterisering af sporede fluorescerende celler på tværs af hjernen opnås. Denne teknik giver mulighed for at forstå plast / regenerativ / remodelingspotentialet for mærkede stamceller, når de aktiverer, migrerer, differentierer eller formerer sig. M...

Værdien af en muselinje til sporing af afstamning Analyse af stamceller in vivo kan være vanskelig, da mange assays, der undersøger sådanne celler, kun fokuserer på at karakterisere disse celler på dyrets dødstidspunkt, hvilket repræsenterer et terminalt øjebliksbillede i tiden. For bedre at forstå processerne for spredning, differentiering og migration af stamfader, mellemliggende / overgangscelletyper og modne celler over tid kræves en langsgående analysemetode. Dette kan opnås med afstamningssporingsundersøgelser, hvor stamceller/stamceller markeres uudsletteligt og kan følges i længere tid efter1.
I den voksne pattedyrshjerne blev neurogeneseprocessen, hvorved voksne fødte neuroner skabes af stamceller og stamceller, først analyseret via etiketretention med thymidin-H3 2,3,4 eller 5-brom-2'-deoxyuridin (BrdU)5,6,7,8 . I disse undersøgelser blev proliferative celler markeret med thyminanalogen, som blev inkorporeret i cellernes DNA under replikation og celledeling / proliferation. Den markerede celle såvel som deres afkom indeholdt derfor denne analog, som derefter blev identificeret post mortem. Men mens thymidin-H3 og BrdU tillod mærkning af proliferative celler og deres afkom i hjerneområder, hvor stamceller var dårligt forstået, blev disse undersøgelser forhindret af ulemperne ved disse værktøjer. Thymidin-H3 inducerer cellecyklusstop, apoptose og dosisafhængig DNA-syntesehæmning9, mens BrdU markerer celler på forskellige niveauer afhængigt af indgivelsesvejen10 og optages af celler under reparation eller apoptose såvel som under celledeling11. Mere effektive mærkningsmetoder er blevet anvendt for nylig, såsom mærkning med 5-ethynyl-2'-deoxyuridin (EdU), men mange af de samme problemer som BrdU forbliver stadig12. Disse tilgange er også begrænsende, idet de markerer enhver proliferativ celle, ikke kun stamceller, og dermed kan fortolkning af resultater forveksles. I den neurogene afstamning bevarer alle stamceller og stamceller mitotisk kapacitet, og kun terminale / modne neuroner er ikke proliferative. For astrocytter og microglia, men ikke oligodendrocytter, opretholdes proliferation på ubestemt tid 13,14,15.
Transgene mus, der bruges til at afstamning spore kun celler, der udtrykker et protein af interesse, såsom en bekræftet til at identificere voksne stamceller, som vi bruger her, er derfor blevet mere almindelige, når man undersøger stamceller og deres afkom. Selvom det er vanskeligt at generere gennem musetransgene tilgange, giver afstamningssporingsmuslinjer mulighed for sporing af specifikt markerede celler i hjernen og er ikke afhængige af spredning alene. I Tet-On transgene musesystem inducerer administration af tetracyclin eller doxycyclin (et tetracyclinderivat) Cre-recombinaseekspression i celler, der er konstrueret med en omvendt tetracyclintransaktivator (rtTA), som transskriberes af en promotor af interesse. Den Tet-inducerbare Cre-drevne rekombination vil derefter aktivere ekspressionen af et uudsletteligt fluorescerende eller selvlysende protein i cellerne af interesse, afhængigt af den anvendte Rosa-reporter-mus. Disse uudsletteligt markerede celler fortsætter med at udtrykke denne reporter efter opdeling, differentiering eller migration, hvilket muliggør sporing af disse celler og deres afkom over tid eller efter forskellige interventioner16. Fordele ved transgene afstamningsmetoder inkluderer: 1) specificitet af sporing til en bestemt celleslægt eller stamfader / stamcelle markeret med rtTA, 2) uudslettelig ekspression af det fluorescerende eller selvlysende protein på trods af celleomsætning eller differentiering, 3) lav toksicitet, 4) betinget aktivering under ethvert punkt i dyrets livscyklus og 5) brugervenlighed med almindelige assays, herunder immunstaining/immunfluorescens16.
Andre metoder til tidsmæssigt inducerbare reporterværktøjer i mus inkluderer brugen af Cre-ERT2-mus, som kan parres med ROSA-GFP, ROSA-mTmG eller andre fluorescerende reportertransgener. I disse dyr driver et cellespecifikt reguleringselement, såsom en promotor eller forstærkerregion af interesse, produktionen af Cre-rekombinase, som kun kan aktiveres via administration af tamoxifen. Mens Cre-ERT2 muselinjer giver mulighed for induktion af Cre i specifikke cellelinjer, er der et væld af viden, der beskriver virkningerne af tamoxifen på voksen neurogenese17,18. Derudover findes der mange ROSA-drevne fluorescerende reportergener, der kan bruges i stedet for GFP eller mTmG, herunder YFP eller CFP, hvilket ville give mulighed for alternativ fluorescerende mærkning i andre fluorescerende bølgelængder. Disse fluorescerende reportergener kan bruges med Tet-On- eller Cre-ERT2-systemer.
Telomerase revers transkriptase (TERT) er den hastighedsbegrænsende komponent i holoenzym telomerase, som arbejder for at udvide telomerer, efter at de er forkortet under celledeling19,20. TERT er blevet identificeret som en markør for voksne vævsstamceller i tarmen21,22, knoglemarv21, lever23, fedt24, endometrium25,26 og knogle1. Hvorvidt TERT-ekspression i disse voksne stamceller udelukkende er til telomeraseforlængende aktivitet eller til at udføre ikke-kanoniske TERT-roller27, vides stadig ikke. TERT-ekspressive hvilende voksne stamceller (qASC'er) er blevet identificeret og sporet i hele kroppen med transgene afstamningssporingsmus for at studere disse stamcellers multipotens og selvfornyelsesevne samt deres potentiale til at aktivere, proliferere, differentiere og migrere 1,22,23,28. Oprettelsen af Tert-rtTA-transgenet er blevet udført tidligere1. I dette papir vil vi beskrive brugen af en afstamningssporing AF TERT-muselinje til at studere TERT + qASC'er, som vi har identificeret som en ny ASC-population i den voksne musehjerne.
Generering af en transgen afstamningssporingsmuslinje For at generere en afstamningssporingsmuslinje ved hjælp af Tet-On-systemet skal tre transgener kombineres inden for et enkelt dyr gennem museparring. Den første er en rtTA, udtrykt under kontrol af promotoren af genet af interesse (vores er TERT-rtTA). I en celle, der udtrykker dette gen af interesse, vil rtTA derfor blive udtrykt. Det andet er et oTet-Cre-gen, som indeholder et tetracyclinresponselement (TRE), der muliggør transkription af Cre-rekombinase i nærværelse af både et rtTA-fusionstransskript og tetracyclin eller doxycyclin. Tetracyclin eller doxycyclin kan administreres til et dyr via drikkevand eller chow29. Endelig skal der være et gen, der aktiveres af Cre rekombinase spaltning. I dette manuskript er mærkningsgenet, vi vil beskrive, Rosa26-mTmG-genet, som indtil Cre-rekombination allestedsnærværende transskriberer mTomato (membranrød fluorescens i alle celler). Men hvis en celle udtrykker rtTA-transkriptet og indeholder tetracyclin eller doxycyclin, vil Cre-rekombination af et sæt lox P-steder mellem mTomato- og mGFP-stederne ændre R26-stedet og få cellen til at producere membran EGFP (mGFP eller membrangrøn fluorescens) i stedet for membrantomat. Den uudslettelige karakter af dette mGFP-signal giver mulighed for in vivo-mærkning og sporing af celler, når de spredes, migrerer og differentierer. Efter sporet kan celler analyseres for ekspression af GFP via immunfluorescens i standard kryosektioner eller tykkere optisk ryddede hjerner.
I dette papir vil vi beskrive brugen af den specifikke muselinje, mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmG. For at skabe denne tredobbelte transgene muselinje parrede vi først oTet-Cre-dyr (Jackson Lab-stammen #006234) med Rosa-mTmG-dyr (Jackson Lab-stammen #007676) for at skabe oTet-Cre::Rosa-mTmG dobbelt transgene mus. Disse dyr blev genotypet med primere og PCR-skabeloner angivet i supplerende tabel 1 og 2. mTert-rtTA mus (skabt af David Breault1) blev parret med oTet-Cre::Rosa-mTmG dyr for at skabe mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmG mus (figur 1A)1,30. Virkningsmekanismen for mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmG muselinjen er illustreret i figur 1B.
Doxycyclin induktion og puls-chase design Ved planlægning af forsøg er det vigtigt at overveje flere faktorer, der vil påvirke resultatet af afstamningssporingsforsøg, herunder dyrets alder ved doxycyclin induktion, længden af doxycyclinadministration ("puls" -perioden), længden af tiden efter doxycyclinfjernelse før vævsindsamling ("jagt" -perioden) og tidspunktet for eventuelle interventioner under disse processer. Disse overvejelser om undersøgelsesdesign er afgørende for at forstå de mærkede celler og deres afkom ved afslutningen af eksperimentet. Det første skridt i processen er at identificere dyrets alder og længden af doxycyclinadministrationen. Længere pulsperioder vil gøre det muligt at udtrykke potentialet for flere celler til at udtrykke den rtTA-bundne promotor og flere celler af interesse at blive uudsletteligt markeret. En celletype, der udviser forbigående ekspression af genet af interesse, kan kræve en længere pulsperiode end celler, der kontinuerligt udtrykker genet af interesse. Men hvis målet med undersøgelsen er at forstå kortsigtede virkninger af cellen af interesse eller en akut intervention, kan pulsperioden ikke være for lang, da når en celle er markeret, vil den blive sporet gennem et hvilket som helst antal ændringer i resten af pulsperioden. I nogle af vores undersøgelser blev en 2-dages puls uden jagtperiode brugt til nærmere at efterligne en direkte reporter for TERT. Dette skyldes, at den mindste tid til rekombination af Rosa-mTmG-genet er 2 dage31.
Den næste væsentlige periode i et pulsjagtforsøg er længden mellem fjernelse af doxycyclin og perfusion af dyret, også kendt som 'jagten'. Halveringstiden for doxycyclin hos mus er ca. 170 minutter uanset administrationsvej, hvilket giver mulighed for at konkludere, at doxycyclininduktion sandsynligvis ikke længere forekommer flere timer efter fjernelse32. Det er dog vigtigt at bemærke, at doxycyclinmetabolismen er langsommere hos ældre mus, hvilket kan føre til længere effektive 'pulsperioder' end unge dyr33.
I jagtperioden vil mærkede celler fortsat blive mærket, selv efter spredning, differentiering eller migration. Afkommet af disse celler vil også blive mærket. Målet med undersøgelsen vil forme længden af pulsjagtparadigmet. Hvis målet med undersøgelsen er at forstå regenerering af et væv over en lang periode med cellerne af interesse, kan en lang jagtperiode være påkrævet. Endelig skal tidspunktet for eventuelle interventioner eller behandlinger besluttes. Administration i pulsperioden vil påvirke cellerne, der udtrykker genet af interesse, samt ethvert afkom, der er skabt i løbet af denne tid, mens administration i jagtperioden hovedsagelig kan påvirke afkom af de interesserede celler, selvom dette afhænger af, hvor hurtigt de mærkede celler deler sig eller differentierer. Eksempler på pulsjagt eksperimentelle designs, vi har brugt, er skitseret i figur 2A.
Det er også vigtigt at være opmærksom på muligheden for baggrunds GFP-signal på grund af utæt udtryk. Utæt ekspression forekommer som et resultat af iboende bindingspotentiale mellem rtTA- og Otet-sekvenserne i fravær af doxycyclin og restaktivitet af Otet-transgenet i fravær af rtTA (gennemgået i34). Utæt udtryk repræsenterer en svaghed ved Tet-systemerne, og selvom lækagen ofte er en acceptabel ulempe ved systemet, kan situationer, hvor det utætte udtryk kan føre til toksicitet og dødelighed, såsom med diptheriatoksin (DTA) i Otet-DTA-dyr, begrænse brugen af disse systemer35.
Hjernebehandling, sektionering og immunfluorescens af tynde sektioner til mikroskopi For at analysere hjernen hos mus efter et afstamningssporingsforsøg skal mus først perfunderes via transkardieperfusion for at fjerne blod og CSF, der kan føre til høj autofluorescens i hjernen. Der er to almindeligt anvendte fikseringsmidler, som dyret kan perfunderes med: Histochoice Tissue Fixative, et glyoxal fixativ (GF) eller 4% paraformaldehyd (PFA). Glyoxalfikseringsmidler giver mulighed for en relativt skånsom fikseringsproces med mindre tværbinding end PFA. Dette reducerer vævsstivhed, reducerer behovet for antigenudtagning og giver mulighed for mindre koncentrerede antistofopløsninger under immunstaining. Men hvis de indeholder methanol, kan dette tjene til at øge autofluorescens36. På den anden side vil PFA ofte give mulighed for en mere robust fiksering, og mens antigenudtagning vil være påkrævet under immunstaining, er der antistoffer, der kun fungerer med PFA-fikseret væv, og perfusion med 4% PFA er påkrævet for den optiske clearingteknik, der er beskrevet senere.
Følgende perfusion er et postfikseringstrin, hvor hjerner nedsænkes i den samme type fikseringsmiddel, der anvendes under perfusion natten over. Dette gør det muligt for hjerneområder, der måske ikke er blevet fuldt fikseret under perfusionen, at fortsætte med at rette sig. Dernæst vil hjerner blive inkuberet i saccharose i fosfatbufferet saltvand (PBS) for at fjerne så meget vand som muligt før frysetrinnet for at forhindre isdannelse i vævet ("kryobevarelse"). Hjerner kan derefter skæres i et vilkårligt antal sagittale, koronale eller tværgående vævsafsnit til behandling. For både præcision og reproducerbarhed skal kalibrerede hjerneblokke anvendes på en måde, der sikrer ensartede bregmaskæringer mellem dyr. Den vigtigste faktor, der kan påvirke, hvordan hjerner er opdelt, er hjerneområdet (e) af interesse. For eksempel, mens et sagittalt snit kan give mulighed for at analysere flere hjerneområder i en vævssektion, vil dette snit ikke tillade analyse af neuro / gliogene regioner i den ventrikulære subventrikulære zone (V-SVZ), da de laterale og mediale sider af den laterale ventrikel vil være umulige at skelne i den dimension og observeres bedre i koronalplanet. Dette kan være en vigtig sondring at foretage i undersøgelser af voksen neurogenese, da den laterale side af lateral ventrikel indeholder den neurogene V-SVZ, mens den mediale væg i den laterale ventrikel er en mere gliogen niche37.
Efter at væv er blevet opdelt i koronale, sagittale eller tværgående sektioner, vil de blive frosset i blokke ved hjælp af optimal køletemperatur (OCT) indlejringsopløsning. Her fryses hjerner i dette indlejringsmateriale ved hjælp af en blanding af tøris og ethanol. Hvis der kræves analyse af tynd sektion, skæres blokke på en kryostat, og afhængigt af den krævede downstream-analyse kan de klæbes til positivt ladede glasglas som tynde sektioner (<20 μm). Glasglas, der ikke er opladet, kan også bruges, men brugen af ikke-opladede dias kan resultere i, at væv bliver løsnet fra diasene38. Hvis der kræves fritsvævende vævssektioner med medium tykkelse (>20 μm), opsamles væv som fritsvævende sektioner. Hvis der kræves tykke sektioner (0,5-4 mm), kræves udskæring af ikke-frosne hjernesektioner med en vibratom. Det er vigtigt at bemærke opbevaringsforskellene mellem sektioner på dias, som kræver frysning ved -20 til -80 ° C og fritsvævende sektioner, som vil blive opbevaret ved 4 ° C.
Hjernerensning og hel mount immunofluorescerende konfokal mikroskopi Hvis der ønskes en bredere, men mindre detaljeret analyse af de afstamningssporede celler i musehjernen, er en omfattende analyse af tykkere segmenter af hjernevæv mulig med iDISCO-hjernerensning39 efterfulgt af immunostaining og flisebelagt z-stack konfokal mikroskopi eller lysarkmikroskopi. Her vil store dele af musehjernen blive optisk renset (en delipideringsproces39), hvilket bedre giver mulighed for fluorescerende signalbilleddannelse på tværs af en 1 mm vævssektion. Ulemperne ved denne proces er høj autofluorescens og en nedsat evne til at opnå billeder i høj opløsning af cellemorfologi og detaljeret co-farvningsanalyse på grund af de øgede arbejdsafstande, der kræves sammenlignet med mere traditionelle metoder (tynde kryosektioner eller fritsvævende sektioner). Af denne grund anbefaler vi hjernerensning for at analysere de store afstamningsresultater gennem flere hjerneområder i stedet for at forsøge at karakterisere eller analysere individuelle celler.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Antibody diluent</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>S080983-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antigen Retrieval Solution</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>S2367</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-GFP antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A2311</td>
			<td>Use at 1:500-1:000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A18-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B6.Cg-Tg(tet0-cre)1Jaw/J</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>JAX:006234</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B6.129(Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo/J</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>JAX:007676</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blocking Solution (IHC)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>20773</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blunt needle</td>
			<td>BSTEAN</td>
			<td>X0012SYHIV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coronal brain block</td>
			<td>Braintree</td>
			<td>BS-2000C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover slip</td>
			<td>Corning</td>
			<td>2850-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat</td>
			<td>Leica</td>
			<td>CM1900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D564</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dibenzyl ether</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>33630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichloromethane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>270997</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey Serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9663</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Doxycycline Hyclate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9891</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0718</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin Sodium Salt from Porcine Mucosa</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histochoice Molecular Biology Tissue Fixative</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>H120</td>
			<td>This product has since been discontinued, but can be replaced with Glyo-Fixx (Thermo Scientific, 6764265)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen Peroxide Solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>516813</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IHC Select TBS Rinse Buffer</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>20845</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine</td>
			<td>Westward</td>
			<td>0143-95095-10</td>
			<td>This product requires a DEA license for storage and use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A452-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Slides</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milipore Block</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>20773</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting medium</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>5013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optimal Cutting Temperature Solution</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS Solution (10X)</td>
			<td>Teknova</td>
			<td>P0496</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sagittal brain block</td>
			<td>Braintree</td>
			<td>RBM-2000S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saline</td>
			<td>Braun</td>
			<td>S8004-5264</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sudan (Typogen) Black</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>199664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetrahydrofuran</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>186562</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue cartridge</td>
			<td>Simport</td>
			<td>M512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>655205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>AnaSed</td>
			<td>sc-362950Rx</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

lineage tracing of inducible fluorescently-labeled stem cells in the adult mouse brain

En telomerase reverse transkriptase (Tert) afstamningssporingsmuslinje blev udviklet for at undersøge voksne vævsstamcellers adfærd og skæbne ved at krydse 'Tet-On' -systemet oTet-Cre-musen med en ny omvendt tetracyclintransaktivator (rtTA) transgen forbundet med Tert-promotoren, som vi har demonstreret markerer en ny population af voksne hjernestamceller. Her vil administration af tetracyklinderivatet doxycyclin til mTert-rtTA::oTet-Cre mus uudsletteligt markere en population af celler, der udtrykker et 4,4 kb fragment af promotorområdet af genet Tert. Når rosa-mTmG-reporteren kombineres, vil mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmG-mus udtrykke membran tdTomato (mTomato), indtil doxycyclinbehandling inducerer udskiftning af mTomato-ekspression med membran EGFP (mGFP) i celler, der også udtrykker Tert. Derfor, når disse triple-transgene afstamningssporingsmus modtager doxycyclin ("puls" -perioden, hvor TERT-ekspressive celler er markeret), vil disse celler blive uudsletteligt markerede mGFP + -celler, som kan spores i enhver ønskelig tid efter fjernelse af doxycyclin ("jagtperioden"), selvom Tert-ekspression efterfølgende går tabt. Hjerner er derefter perfusionsfikseret og behandlet til immunfluorescens og andre downstream-applikationer for at fortolke ændringer i stamcelleaktivering, proliferation, afstamningsforpligtelse, migration til forskellige hjernenicher og differentiering til modne celletyper. Ved hjælp af dette system kan enhver rtTA-mus parres med oTet-Cre og en Rosa-reporter til at udføre doxycyclin-inducerbare "pulsjagt" afstamningssporingseksperimenter ved hjælp af markører af stamceller.

Mens det fluorescerende signal, der er resultatet af et Tet-On-system med en fluorescerende reporter, vil variere afhængigt af den pågældende promotor og den eller de anvendte fluoroforer, vil vi beskrive, hvordan resultaterne blev analyseret med mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmG-dyr. Analyse af voksne hjerner efter en pulsjagt resulterede i membran GFP-ekspressive celler gennem forskellige anatomiske nicher. Forskellen i fluorescerende intensitet mellem forskellige celletyper skal bemærkes. En variabel med hensyn til ...

Watch this Scientific Journal Video about Lineage Tracing of Inducible Fluorescently-Labeled Stem Cells in the Adult Mouse Brain at JoVE.com

Lineage Tracing of Inducible Fluorescently-Labeled Stem Cells in the Adult Mouse Brain

Evnen til permanent at markere stamceller og deres afkom med en fluorofor ved hjælp af en inducerbar transgen afstamningssporingsmuslinje giver mulighed for rumlig og tidsmæssig analyse af aktivering, proliferation, migration og / eller differentiering in vivo. Afstamning kan afsløre nye oplysninger om afstamningsforpligtelse, reaktion på intervention (er) og multipotency.

Afstamning af inducerbare fluorescerende mærkede stamceller i den voksne musehjerne

A telomerase reverse transcriptase (Tert) lineage-tracing mouse line was developed to investigate the behavior and fate of adult tissue stem cells, by ...

Mærkning af stamceller og deres afkom med en inducerbar transgen afstamningssporingsmuslinje giver mulighed for rumlig og tidsmæssig analyse af aktivering, proliferation, migration og / eller differentiering af voksne stamceller i hjernen in vivo. Afstamning kan afsløre nye oplysninger om afstamningsforpligtelse, reaktion på interventioner og multistyrke. Fordele ved transgene afstamningsmetoder inkluderer specificitet ved sporing af en bestemt celleafstamning, uudslettelig ekspression af det fluorescerende protein uanset celleomsætning eller differentiering, lav toksicitet af doxycylin, betinget aktivering og brugervenlighed med almindelige downstream-assays på afstamningssporvæv, herunder immunostaining og immunfluorescens.På grund af den brede implikation af plasticitet og celle i den voksne hjerne vil karakteriseringen og analysen af voksne stamceller hjælpe med at informere om undersøgelsen af neurodegenerative sygdomme, metaboliske virkninger på hjernens plasticitet, aldring og andre relaterede tilstande. Til at begynde med glider varm til stuetemperatur og efterfikseres med iskold acetone i 15 minutter. Vask glider i fem minutter i 1X skyllebuffer, ryst ved 60 rotationer i minuttet ved stuetemperatur mellem hvert trin.Permeabiliseres for stående nukleare antigener med 0,3% Triton X-100 i 10 minutter ved stuetemperatur. Permeabiliseres for stående af cytoplasmatiske antigener med 0,3%Tween-20 i 10 minutter ved stuetemperatur. Udfør antigenhentning ved mikrobølgeovn i 50 til 100 ml 1x DAKO Antigen Retrieval Solution på lavt i 10 minutter, to gange.Skyl derefter med buffer i fem minutter ved stuetemperatur. Inkuber dias i 0,3%Typogen Black i 70% ethanol i 20 minutter ved stuetemperatur og vask derefter med skyllebuffer. Tegn hydrofob barriere omkring væv.Bloker i 20 minutter ved 37 grader Celsius med blokerende reagens. Og inkuberes med primært antistof fortyndet i antistoffortyndingsmiddel natten over ved fire grader Celsius. Vask dias i 10 minutter ved stuetemperatur.Den næste dag inkuberes sektioner i Alexa Fluor sekundære antistoffer i 10 minutter ved stuetemperatur. Vask derefter glider to gange i skyllebuffer i 10 minutter. Dæk hjernesektioner i 100 mikroliter af et til 500 anti-GFP-antistof konjugeret til AlexaFluor 488, og inkuber natten over ved fire grader Celsius for at øge det endogene Fluor4, der markerer de sporede celler.Den næste dag vaskes med skyllebuffer to gange. Og vask derefter i rindende DI-vand i fem minutter. Modtain med 100 nanogram per milliliter 4'6-diamidino-2-phenylindol i fem minutter.Vask derefter i rindende DI-vand i fem minutter. Tilsæt en dråbe fluorescerende sikkert monteringsmedium oven på hver vævssektion og forsegl med en 22 millimeter x 22 millimeter dækslip. Billeddannelse anbefales på monteringsdagen for at sikre optimalt signal.At begynde fiksering og sektionering efter transkardie perfusion post-fix hjerner i 4% PFA natten over ved fire grader Celsius. Og så igen i en time ved stuetemperatur. Hjerner vaskes i 1x PBS i en time to gange ved stuetemperatur.Skær hjernen i en millimeter tykke sektioner ved hjælp af den sagittale hjerneblok og læg den i fem milliliter mikrocentrifugerør indeholdende 1x PBS. Ved methanolforbehandling skal du starte med at vaske med 1x PBS i en time to gange ved stuetemperatur. Vask i 50% methanol i en time ved stuetemperatur.Vask i 80% methanol i en time ved stuetemperatur. Vask i 100% methanol i en time, to gange, ved stuetemperatur. Blegeprøver med 5% hydrogenperoxid i 20% dimethylsulfoxid og methanol ved fire grader Celsius natten over.Efter blegning vaskes prøverne i methanol i en time to gange ved stuetemperatur. I 20% dimethylsulfoxid og methanol vaskes i en time to gange ved stuetemperatur. Vask i 80% methanol i en time ved stuetemperatur.Vask i 50% methanol i en time ved stuetemperatur. Pbs vaskes i en time to gange ved stuetemperatur. Pbs 0,2 %Triton X-100 vaskes i en time to gange ved stuetemperatur.For immunostain af clearing hjerner, begynde med at inkubere prøver i 1x PBS, 0,2% Triton X-100, 20% DMSO, 0,3 molært glycin, ved 37 grader Celsius natten over på en orbital shaker. Blok i 1x PBS, 0,2% Triton X-100, 10% DMSO, 6% gedeserum ved 37 grader Celsius i tre dage på en orbital shaker. Vask prøver i 1x PBS, 0,2%Tween-20, 10 mikrogram pr. milliliter heparinnatriumsalt fra svineslimhinde i en time to gange ved 37 grader Celsius.Derefter inkuberes i 1x PBS, 0,2% Tween-20, 10 mikrogram pr. Milliliter heparin, 5% DMSO, 3% gedeserum indeholdende en til 500 koncentration af kanin anti GFP AlexaFluor 488 ved 37 grader Celsius på en orbital shaker i to dage. Vask prøver i 1x PBS, 0,2% Tween-20 med 10 mikrogram pr. milliliter heparin i en time ved 37 grader Celsius på en orbitalryster tre gange og derefter en gang om dagen i to dage. Inkuber prøver natten over i en milliliter 50% Tetrahydrofuran og vand.Inkuber prøver i en time i en milliliter 80% THF Tetrahydrofuran og vand. Inkuber prøver to gange i en time i 100%Tetrahydrofuran. Tør prøver med en steril klud og inkuberes i dichlormethan, indtil de synker til bunden af hætteglasset.Inkuber ikke i mere end 60 minutter. Inkuber prøver i en milliliter dibenzylether, indtil de er klare. Opbevar prøver i dibenzylether ved stuetemperatur, indtil de er klar til afbildning.For at afbilde immunsplettede hjernesektioner skal du analysere dias via konfokal mikroskopi, hvor co-ekspression af flere antistoffer kan bekræftes. Vi bruger et Leica Stellaris femmikroskop med HyD S hybriddetektorer. For at afbilde ryddede hjerner skal du bruge et omvendt konfokalt mikroskop med et automatiseret trin og automatiseret flisefunktion.Start med at lægge en ryddet hjernesektion fladt mod en glasbundsskål i nedsænket i dibenzylether. En mærkbar forskel i fluorescerende intensitet på tværs af forskellige hjerneområder og forskellige celletyper blev observeret efter en pulsjagtperiode i de afstamningssporede hjerner. Choroid epitelceller i choroid plexus havde en tyk cellemembran og stærkt grønt fluorescerende signal, der indikerer, at de stammer fra Tert-positive celler, som let kunne skelnes fra de omgivende celler.De andre mindre celletyper i choroid plexus stroma havde et svagere GFP-signal. I lillehjernen udtrykte Bergmann-gliaceller højere niveauer af GFP end kurvceller, og variation i GFP-ekspression eksisterede også mellem individuelle kurvceller. For fabrikssensoriske neuronaksoner i det glomerulære lag af den olfaktoriske pære udtrykte også høje niveauer af GFP Olfaktoriske sensoriske neuronaksoner, der fylder det glomerulære lag af den olfaktoriske pære, udtrykte høje niveauer af membrantomat eller rød fluorescens sammenlignet med de fleste andre hjerneområder, selv når de samme neuroner er GFP-positive, hvilket indikerer, at nogle celler syntes at miste mTomato-signal langsommere under afstamningsporing.I modsætning hertil udtrykte i choroid plexus GFP positive celler lav mTomato. I de fleste andre hjerneområder udtrykkes tomatsignaler på lavt niveau på tværs af de fleste celletyper, hvor endotelceller er nogle af de eneste celler, hvis fluorescerende signal var lyst nok til at skille sig tydeligt ud fra hjernevævets røde fluorescerende baggrund. Det vigtigste at huske er, at det fluorescerende signal i rensede hjerner falmer hurtigere end de fleste andre immunassays.Husk at afbilde dine prøver så hurtigt som muligt og inden for syv dage. Efterfølgende kan billeddannelse af hjerneskiver eller klare hjerner, farvelægning af markører med GFP-signalerne og vores kvantificering af fluorens udføres ved hjælp af softwareprogrammer.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay

Isolation and expansion of the putative neural stem cells (NSCs) from the adult murine brain was first described by Reynolds and Weiss in 1992 employing a ...

Growing Neural Stem Cells from Conventional and Nonconventional Regions of the Adult Rodent Brain

Voksende neurale stamceller fra konventionelle og ikke-konventionelle regioner Adult gnaverhjerne

Recent work demonstrates that central nervous system (CNS) regeneration and tumorigenesis involves populations of stem cells (SCs) resident within the ...

Electrophysiological Recording in the Brain of Intact Adult Zebrafish

Elektrofysiologiske optagelse i hjernen af ​​intakte Voksen Zebrafisk

Previously, electrophysiological studies in adult zebrafish have been limited to slice preparations or to eye cup preparations and electrorentinogram ...

Assessing Cell Cycle Progression of Neural Stem and Progenitor Cells in the Mouse Developing Brain after Genotoxic Stress

Vurdering af cellecyklusprogression af neurale stam-og stamcelle i Mouse hjernens udvikling efter Genotoksisk Stress

Neurons of the cerebral cortex are generated during brain development from different types of neural stem and progenitor cells (NSPC), which form a ...

Lineage-reprogramming of Pericyte-derived Cells of the Adult Human Brain into Induced Neurons

Lineage-omprogrammering af pericyt-afledte Celler af Voksen Menneskelige hjerne til Inducerede Neuroner

Direct lineage-reprogramming of non-neuronal cells into induced neurons (iNs) may provide insights into the molecular mechanisms underlying neurogenesis ...

Conditional Genetic Transsynaptic Tracing in the Embryonic Mouse Brain

Betinget Genetisk transsynaptisk sporing i den embryoniske musehjerne

Anatomical path tracing is of pivotal importance to decipher the relationship between brain and behavior. Unraveling the formation of neural circuits ...

Laser-guided Neuronal Tracing In Brain Explants

Laserstyrede Neuronal Tracing i Brain Eksplantater

We present a technique which combines an in vitro tracer injection protocol, which uses a series of electrical and pressure pulses to increase dye uptake ...

Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Mouse Subcallosal Zone

Isolering og dyrkning af Voksen neurale stamceller fra mus Subcallosal Zone

Adult neural stem cells (aNSCs) can be used for the regeneration of damaged brain tissue. NSCs have the potential for differentiation and proliferation ...

An In Vivo Blood-brain Barrier Permeability Assay in Mice Using Fluorescently Labeled Tracers

An In Vivo Blood-brain Barrier Permeability Assay in Mice Using Fluorescently Labeled Tracers

En In Vivo blod - hjerne barrieren permeabilitet Assay i mus ved hjælp af Fluorescently mærket røbestoffer

Blood-brain barrier (BBB) is a specialized barrier that protects the brain microenvironment from toxins and pathogens in the circulation and maintains ...

Intra-Arterial Delivery of Neural Stem Cells to the Rat and Mouse Brain: Application to Cerebral Ischemia

Intra-arteriel levering af neurale stamceller til rotte og mus hjernen: Ansøgning om cerebral iskæmi

Neural stem cell (NSC) therapy is an emerging innovative treatment for stroke, traumatic brain injury and neurodegenerative disorders. As compared to ...