Name: lineage tracing of inducible fluorescently-labeled stem cells in the adult mouse brain
Uploaded: 2022-05-20T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Lineage Tracing of Inducible Fluorescently-Labeled Stem Cells in the Adult Mouse Brain at JoVE.com

De auteurs willen Dr. Diana Carlone (Boston Children's Hospital, Harvard Medical School) en Dr. Matthew Lynes (Joslin Diabetes Center; Maine Medical Center Research Institute) voor begeleiding met behulp van mTert-rtTA-dieren.

Alle hier beschreven methoden zijn goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) van de Ohio State University.
1. Creatie van een afstamming die tet-on muislijn, fokstrategieën en genotypering voor experimentele cohortmuizen traceert
OPMERKING: Hier schetsen we de creatie van een Tet-On muissysteem met Rosa-mTmG als het fluorescerende reportergen dat Cre-recombinatie ondergaat, maar verschillende andere Cre-recombinatiegestu...

     

Een methode voor het creëren, gebruiken en analyseren van een triple transgene afstamming traceert muizenlijn die stamcellen markeert in het volwassen muizenbrein in vivo wordt beschreven. In combinatie met immunostaining of hersenreiniging kan de identificatie en karakterisering van getraceerde fluorescerende cellen in de hersenen worden bereikt. Deze techniek biedt de mogelijkheid om het plastische / regeneratieve / remodelleringspotentieel van gelabelde stamcellen te begrijpen terwijl ze activeren, migreren,...

Waarde van een afstammingsmuislijn Analyse van stamcellen in vivo kan moeilijk zijn, omdat veel testen die dergelijke cellen onderzoeken zich alleen richten op het karakteriseren van deze cellen op het moment van overlijden van het dier, wat een terminale momentopname in de tijd vertegenwoordigt. Om de processen van proliferatie, differentiatie en migratie van voorlopercellen, intermediaire / overgangsceltypen en volwassen cellen in de loop van de tijd beter te begrijpen, is een longitudinale analysebenadering vereist. Dit kan worden bereikt met afstammingstraceringsstudies waarbij stam-/voorlopercellen onuitwisbaar worden gemarkeerd en daarna gedurende elke tijd kunnen worden gevolgd1.
In het volwassen zoogdierbrein werd het proces van neurogenese waarbij volwassen neuronen worden gemaakt van stam- en voorlopercellen voor het eerst geanalyseerd via labelretentie met thymidine-H3 2,3,4 of 5-broom-2'-deoxyuridine (BrdU)5,6,7,8 . In deze studies werden proliferatieve cellen gemarkeerd met het thymine-analoog, dat tijdens replicatie en celdeling / proliferatie in het DNA van de cellen werd opgenomen. De gemarkeerde cel, evenals hun nageslacht, bevatte daarom dit analoog, dat vervolgens post-mortem werd geïdentificeerd. Hoewel thymidine-H3 en BrdU het mogelijk maakten om proliferatieve cellen en hun nakomelingen te markeren in hersengebieden waar stamcellen slecht werden begrepen, werden deze studies belemmerd door de nadelen van deze hulpmiddelen. Thymidine-H3 induceert celcyclusstilstand, apoptose en dosisafhankelijke DNA-syntheseremming9, terwijl BrdU cellen op verschillende niveaus markeert, afhankelijk van de toedieningsweg10 en wordt opgenomen door cellen tijdens reparatie of apoptose, evenals tijdens celdeling11. Efficiëntere etiketteringsmethoden zijn onlangs gebruikt, zoals etikettering met 5-ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU), maar veel van dezelfde problemen als BrdU blijven nog steeds12. Deze benaderingen zijn ook beperkend omdat ze elke proliferatieve cel markeren, niet alleen stamcellen, en dus kan de interpretatie van de resultaten worden verward. In de neurogene afstamming behouden alle stam- en voorlopercellen de mitotische capaciteit en alleen terminale / volwassen neuronen zijn niet proliferatief. Voor astrocyten en microglia, maar niet voor oligodendrocyten, wordt de proliferatie voor onbepaalde tijd gehandhaafd 13,14,15.
Transgene muizen die worden gebruikt om alleen cellen te traceren die een eiwit van belang uitdrukken, zoals een eiwit waarvan is bevestigd dat het volwassen stamcellen identificeert zoals we hier gebruiken, zijn daarom gebruikelijker geworden bij het onderzoeken van stamcellen en hun nakomelingen. Hoewel het moeilijk te genereren is via transgene benaderingen van muizen, maken afstammingstracerende muislijnen het mogelijk om specifiek gemarkeerde cellen in de hersenen te traceren en zijn ze niet alleen afhankelijk van proliferatie. In het Tet-On transgene muissysteem induceert toediening van tetracycline of doxycycline (een tetracyclinederivaat) Cre-recombinase-expressie in cellen die zijn ontworpen met een omgekeerde tetracyclinetransactivator (rtTA), die wordt getranscribeerd door een promotor van belang. De Tet-induceerbare Cre-gedreven recombinatie activeert dan de expressie van een onuitwisbaar fluorescerend of luminescerend eiwit in de cellen van belang, afhankelijk van de gebruikte Rosa-reporter muis. Deze onuitwisbaar gemarkeerde cellen blijven deze verslaggever tot expressie brengen na deling, differentiatie of migratie, waardoor deze cellen en hun nakomelingen in de loop van de tijd of na verschillende interventies kunnen worden gevolgd16. Voordelen van transgene benaderingen voor het traceren van afstamming zijn onder meer: 1) specificiteit van tracering naar een bepaalde cellijn of voorloper/stamcel gemarkeerd door de rtTA, 2) onuitwisbare expressie van het fluorescerende of luminescerende eiwit ondanks celvernieuwing of differentiatie, 3) lage toxiciteit, 4) voorwaardelijke activering tijdens elk punt in de levenscyclus van het dier, en 5) gebruiksgemak met gemeenschappelijke testen, inclusief immunostaining/immunofluorescentie16.
Andere methoden van tijdelijk induceerbare reportertools bij muizen zijn het gebruik van Cre-ERT2-muizen, die kunnen worden gecombineerd met ROSA-GFP, ROSA-mTmG of andere fluorescerende reportertransgenen. Bij deze dieren drijft een celspecifiek regulerend element, zoals een promotor of enhancer-gebied van belang, de productie van Cre-recombinase aan, dat alleen kan worden geactiveerd via de toediening van tamoxifen. Hoewel Cre-ERT2-muislijnen de inductie van Cre in specifieke cellijnen mogelijk maken, is er een schat aan kennis over de effecten van tamoxifen op volwassen neurogenese17,18. Bovendien bestaan er veel ROSA-aangedreven fluorescerende reportergenen die kunnen worden gebruikt in plaats van GFP of mTmG, waaronder YFP of CFP, wat alternatieve fluorescerende labeling in andere fluorescerende golflengten mogelijk zou maken. Deze fluorescerende reportergenen kunnen worden gebruikt met Tet-On- of Cre-ERT2-systemen.
Telomerase reverse transcriptase (TERT) is de snelheidsbeperkende component van het holo-enzym telomerase, dat werkt om telomeren uit te breiden nadat ze zijn verkort tijdens celdeling19,20. TERT is geïdentificeerd als een marker van volwassen weefselstamcellen in de darm21,22, beenmerg21, lever23,vetweefsel 24, endometrium25,26 en bot1. Of TERT-expressie in deze volwassen stamcellen uitsluitend voor telomerase-uitbreidende activiteit is of voor het uitvoeren van niet-canonieke TERT-rollen27 is nog onbekend. TERT-expresserende rustige volwassen stamcellen (qASCs) zijn geïdentificeerd en getraceerd door het hele lichaam met transgene afstamming tracerende muizen om de multipotentie en het zelfvernieuwingsvermogen van deze stamcellen te bestuderen, evenals hun potentieel om te activeren, te vermenigvuldigen, te differentiëren en te migreren 1,22,23,28. De creatie van het Tert-rtTA transgen is eerder uitgevoerd1. In dit artikel zullen we het gebruik beschrijven van een afstamming die TERT-muislijn traceert om TERT + qASCs te bestuderen die we hebben geïdentificeerd als een nieuwe ASC-populatie in het volwassen muizenbrein.
Generatie van een transgene afstammingslijntraceringsmuislijn Om een afstammingsspoormuislijn te genereren met behulp van het Tet-On-systeem, moeten drie transgenen worden gecombineerd binnen één dier door middel van muisparing. De eerste is een rtTA, uitgedrukt onder de controle van de promotor van het gen van belang (de onze is TERT-rtTA). In een cel die dit gen van belang tot expressie brengt, zal de rtTA dus tot expressie komen. Het tweede is een oTet-Cre-gen, dat een tetracycline-responselement (TRE) bevat dat de transcriptie van Cre-recombinase mogelijk maakt in aanwezigheid van zowel een rtTA-fusietranscript als tetracycline of doxycycline. Tetracycline of doxycycline kan aan een dier worden toegediend via drinkwater of chow29. Ten slotte moet er een gen zijn dat wordt geactiveerd door Cre-recombinasesplitsing. In dit manuscript is het etiketteringsgen dat we zullen beschrijven het Rosa26-mTmG-gen, dat tot Cre-recombinatie alomtegenwoordig mTomato (membraanrode fluorescentie in alle cellen) zal transcriberen. Als een cel echter het rtTA-transcript tot expressie brengt en tetracycline of doxycycline bevat, zal Cre-recombinatie van een set lox P-sites tussen de mTomato- en mGFP-sites de R26-site veranderen en ervoor zorgen dat de cel membraan-EGFP (mGFP of membraangroene fluorescentie) produceert in plaats van membraantomaat. De onuitwisbare aard van dit mGFP-signaal zal het mogelijk maken om cellen in vivo te labelen en te traceren terwijl ze zich vermenigvuldigen, migreren en differentiëren. Na het spoor kunnen cellen worden geanalyseerd op expressie van GFP via immunofluorescentie in standaard cryosecties of dikkere optisch geklaarde hersenen.
In dit artikel beschrijven we het gebruik van de specifieke muislijn, mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmG. Om deze drievoudige transgene muislijn te creëren, hebben we eerst oTet-Cre-dieren (The Jackson Lab-stam #006234) gekoppeld aan Rosa-mTmG-dieren (The Jackson Lab-stam #007676) om oTet-Cre::Rosa-mTmG dubbele transgene muizen te creëren. Deze dieren werden gegenotypeerd met primers en PCR-sjablonen die zijn aangegeven in de aanvullende tabellen 1 en 2. mTert-rtTA muizen (gemaakt door David Breault1) werden gepaard met oTet-Cre::Rosa-mTmG dieren om mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmG muizen te creëren (Figuur 1A)1,30. Het werkingsmechanisme van de muislijn mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmG wordt geïllustreerd in figuur 1B.
Doxycycline inductie en pulse-chase ontwerp Bij het plannen van experimenten is het belangrijk om rekening te houden met verschillende factoren die van invloed zijn op de uitkomst van experimenten met het traceren van afstamming, waaronder de leeftijd van het dier bij doxycycline-inductie, de lengte van de toediening van doxycycline (de "puls" -periode), de tijdsduur na verwijdering van doxycycline vóór weefselverzameling (de "chase" -periode) en de timing van eventuele interventies tijdens deze processen. Deze overwegingen voor de onderzoeksopzet zijn essentieel voor het begrijpen van de gelabelde cellen en hun nakomelingen aan het einde van het experiment. De eerste stap in het proces is het identificeren van de leeftijd van interesse van het dier en de lengte van de toediening van doxycycline. Langere pulsperioden zullen het mogelijk maken dat meer cellen de rtTA-gekoppelde promotor tot expressie brengen en dat meer cellen van belang onuitwisbaar worden gemarkeerd. Een celtype dat voorbijgaande expressie van het gen van belang vertoont, kan een langere pulsperiode vereisen dan cellen die continu het gen van belang tot expressie brengen. Als het doel van de studie echter is om kortetermijneffecten van de cel van belang of een acute interventie te begrijpen, kan de pulsperiode niet te lang zijn, omdat zodra een cel is gemarkeerd, deze gedurende de rest van de pulsperiode door een willekeurig aantal veranderingen zal worden getraceerd. In sommige van onze studies werd een 2-daagse puls zonder achtervolgingsperiode gebruikt om een directe verslaggever voor TERT beter na te bootsen. Dit komt omdat de minimale tijdsduur voor recombinatie van het Rosa-mTmG-gen 2 dagen31 is.
De volgende essentiële periode in een pulsachtervolgingsexperiment is de lengte tussen verwijdering van doxycycline en perfusie van het dier, ook bekend als de 'achtervolging'. De halfwaardetijd van doxycycline bij muizen is ongeveer 170 minuten, ongeacht de toedieningsweg, waardoor de conclusie mogelijk is dat doxycycline-inductie waarschijnlijk enkele uren na verwijdering niet meer optreedt32. Het is echter belangrijk op te merken dat het doxycyclinemetabolisme langzamer is bij oudere muizen, wat kan leiden tot langere effectieve 'pols'-perioden dan jonge dieren33.
Tijdens de achtervolgingsperiode zullen gelabelde cellen blijven worden gelabeld, zelfs na proliferatie, differentiatie of migratie. Het nageslacht van deze cellen zal ook worden gelabeld. Het doel van de studie zal de lengte van het pulse-chase paradigma bepalen. Als het doel van de studie is om de regeneratie van een weefsel over een lange periode met de cellen van belang te begrijpen, kan een lange achtervolgingsperiode nodig zijn. Ten slotte moet de timing van eventuele interventies of behandelingen worden bepaald. Toediening tijdens de pulsperiode zal van invloed zijn op de cellen die het gen van belang tot expressie brengen, evenals op elk nageslacht dat in deze periode is gecreëerd, terwijl toediening tijdens de achtervolgingsperiode meestal het nageslacht van de cellen van belang kan beïnvloeden, hoewel dit zal afhangen van hoe snel de gelabelde cellen delen of differentiëren. Voorbeelden van experimentele ontwerpen die we hebben gebruikt, zijn te zien in figuur 2A.
Het is ook belangrijk om op de hoogte te zijn van de mogelijkheid van een GFP-signaal op de achtergrond als gevolg van lekkende expressie. Lekkende expressie treedt op als gevolg van inherente bindingspotentiaal tussen rtTA- en otetsequenties in afwezigheid van doxycycline, en restactiviteit van het otettransgen bij afwezigheid van rtta (herzien in34). Lekkende expressie vertegenwoordigt een zwakte van de Tet-systemen, en hoewel het lek vaak een acceptabel nadeel van het systeem is, kunnen situaties waarin de lekkende expressie kan leiden tot toxiciteit en mortaliteit, zoals bij diptheria-toxine (DTA) bij Otet-DTA-dieren, het gebruik van deze systemen beperken35.
Hersenverwerking, sectie en immunofluorescentie van dunne secties voor microscopie Om de hersenen van muizen te analyseren na een afstammingstraceringsexperiment, moeten muizen eerst worden doordrenkt via transcardiale perfusie om bloed en liquor te verwijderen die kunnen leiden tot hoge autofluorescentie in de hersenen. Er zijn twee veelgebruikte fixatieven waarmee het dier kan worden doordrenkt: Histochoice Tissue Fixative, een glyoxal fixatief (GF) of 4% paraformaldehyde (PFA). Glyoxal-fixatieven zorgen voor een relatief zacht fixatieproces met minder cross-linking dan PFA. Dit vermindert weefselstijfheid, vermindert de behoefte aan het ophalen van antigeen en zorgt voor minder geconcentreerde antilichaamoplossingen tijdens immunostaining. Als ze echter methanol bevatten, kan dit dienen om de autofluorescentie te verhogen36. Aan de andere kant zal PFA vaak een robuustere fixatie mogelijk maken, en hoewel antigeen ophalen vereist zal zijn tijdens immunostaining, zijn er antilichamen die alleen werken met PFA-gefixeerde weefsels, en perfusie met 4% PFA is vereist voor de optische clearingtechniek die later wordt beschreven.
Het volgen van perfusie is een post-fixatiestap, waarbij de hersenen worden ondergedompeld in hetzelfde type fixatief dat tijdens de perfusie 's nachts wordt gebruikt. Hierdoor kunnen alle hersengebieden die mogelijk niet volledig zijn gefixeerd tijdens de perfusie, blijven fixeren. Vervolgens worden hersenen geïncubeerd in sucrose in fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) om zoveel mogelijk water te verwijderen vóór de vriesstap om ijsvorming in het weefsel te voorkomen ("cryo-conservering"). Hersenen kunnen dan worden gesneden in een willekeurig aantal sagittale, coronale of transversale weefselsecties voor verwerking. Voor zowel precisie als reproduceerbaarheid moeten gekalibreerde hersenblokken worden gebruikt op een manier die zorgt voor consistente bregma-snijwonden tussen dieren. De belangrijkste factor die van invloed kan zijn op hoe hersenen worden gesegmenteerd, is het hersengebied (en) van belang. Bijvoorbeeld, terwijl een sagittale snede het mogelijk kan maken om meer hersengebieden in één weefselsectie te analyseren, zal deze snede geen analyse van neuro / gliogene gebieden van de ventriculaire-subventriculaire zone (V-SVZ) mogelijk maken, omdat de laterale en mediale zijden van de laterale ventrikel onmogelijk te onderscheiden zijn in die dimensie en beter worden waargenomen in het coronale vlak. Dit kan een belangrijk onderscheid zijn om te maken in neurogenesestudies bij volwassenen, omdat de laterale kant van de laterale ventrikel de neurogene V-SVZ bevat, terwijl de mediale wand van de laterale ventrikel een meer gliogene niche is37.
Nadat weefsels zijn verdeeld in coronale, sagittale of dwarse secties, worden ze in blokken bevroren met behulp van optimal cooling temperature (OCT) inbeddingsoplossing. Hier worden de hersenen ingevroren in dit inbeddingsmateriaal, met behulp van een mengsel van droogijs en ethanol. Als dunne sectieanalyse vereist is, worden blokken op een cryostaat gesneden en afhankelijk van de vereiste downstream-analyse kunnen ze als dunne secties (<20 μm) worden gehecht aan positief geladen glasglaasjes. Glazen dia's die niet zijn opgeladen, kunnen ook worden gebruikt, maar het gebruik van niet-geladen dia's kan ertoe leiden dat weefsels losraken van de dia's38. Als vrij zwevende weefselsecties van gemiddelde dikte (>20 μm) nodig zijn, worden weefsels verzameld als vrij zwevende secties. Als dikke secties (0,5-4 mm) nodig zijn, is het snijden van niet-bevroren hersensecties met een vibratoom vereist. Het is belangrijk om de opslagverschillen op te merken tussen secties op dia's, die moeten worden ingevroren bij -20 tot -80 ° C en vrij zwevende secties, die bij 4 ° C worden opgeslagen.
Hersenzuivering en immunofluorescente confocale microscopie Als een bredere, maar minder gedetailleerde analyse van de afstammingsgetraceerde cellen in het muizenbrein gewenst is, is een uitgebreide analyse van dikkere segmenten van hersenweefsel mogelijk met iDISCO-hersenreiniging39 gevolgd door immunostaining en betegelde z-stack confocale microscopie of light-sheet microscopie. Hier zullen grote delen van de muizenhersenen optisch worden gewist (een proces van delipidatie39), wat beter fluorescerende signaalbeeldvorming mogelijk maakt over een weefselsectie van 1 mm. De nadelen van dit proces zijn hoge autofluorescentie en een verminderd vermogen om hoge resolutie beelden van celmorfologie en gedetailleerde co-kleuringsanalyse te verkrijgen vanwege de grotere werkafstanden die nodig zijn in vergelijking met meer traditionele methoden (dunne cryosecties of vrij zwevende secties). Om deze reden raden we aan om hersenzuivering te analyseren om de grootschalige afstammingstraceringsresultaten in meerdere hersengebieden te analyseren, in plaats van te proberen individuele cellen te karakteriseren of te analyseren.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Antibody diluent</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>S080983-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antigen Retrieval Solution</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>S2367</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-GFP antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A2311</td>
			<td>Use at 1:500-1:000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A18-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B6.Cg-Tg(tet0-cre)1Jaw/J</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>JAX:006234</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B6.129(Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo/J</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>JAX:007676</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blocking Solution (IHC)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>20773</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blunt needle</td>
			<td>BSTEAN</td>
			<td>X0012SYHIV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coronal brain block</td>
			<td>Braintree</td>
			<td>BS-2000C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover slip</td>
			<td>Corning</td>
			<td>2850-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat</td>
			<td>Leica</td>
			<td>CM1900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D564</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dibenzyl ether</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>33630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichloromethane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>270997</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey Serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9663</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Doxycycline Hyclate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9891</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0718</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin Sodium Salt from Porcine Mucosa</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histochoice Molecular Biology Tissue Fixative</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>H120</td>
			<td>This product has since been discontinued, but can be replaced with Glyo-Fixx (Thermo Scientific, 6764265)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen Peroxide Solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>516813</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IHC Select TBS Rinse Buffer</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>20845</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine</td>
			<td>Westward</td>
			<td>0143-95095-10</td>
			<td>This product requires a DEA license for storage and use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A452-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Slides</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milipore Block</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>20773</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting medium</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>5013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optimal Cutting Temperature Solution</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS Solution (10X)</td>
			<td>Teknova</td>
			<td>P0496</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sagittal brain block</td>
			<td>Braintree</td>
			<td>RBM-2000S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saline</td>
			<td>Braun</td>
			<td>S8004-5264</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sudan (Typogen) Black</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>199664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetrahydrofuran</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>186562</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue cartridge</td>
			<td>Simport</td>
			<td>M512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>655205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>AnaSed</td>
			<td>sc-362950Rx</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

lineage tracing of inducible fluorescently-labeled stem cells in the adult mouse brain

Een telomerase reverse transcriptase (Tert) lineage-tracing muislijn werd ontwikkeld om het gedrag en lot van volwassen weefselstamcellen te onderzoeken, door het 'Tet-On'-systeem oTet-Cre-muis te kruisen met een nieuw omgekeerd tetracycline transactivator (rtTA) transgen gekoppeld aan de Tert-promotor, waarvan we hebben aangetoond dat het een nieuwe populatie van volwassen hersenstamcellen markeert. Hier zal toediening van het tetracyclinederivaat doxycycline aan mTert-rtTA::oTet-Cre-muizen onuitwisbaar een populatie cellen markeren die een 4,4 kb-fragment van het promotorgebied van het gen Tert tot expressie brengen. In combinatie met de Rosa-mTmG-reporter zullen mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmG-muizen membraan tdTomato (mTomato) tot expressie brengen totdat doxycyclinebehandeling de vervanging van mTomato-expressie door membraan-EGFP (mGFP) induceert in cellen die ook Tert tot expressie brengen. Daarom, wanneer deze triple-transgene lineage tracing muizen doxycycline ontvangen (de "puls" periode waarin TERT-expressiecellen worden gemarkeerd), zullen deze cellen onuitwisbaar gemarkeerde mGFP + -cellen worden, die gedurende elke gewenste hoeveelheid tijd na doxycycline-verwijdering kunnen worden gevolgd (de "chase" -periode), zelfs als Tert-expressie vervolgens verloren gaat. Hersenen worden vervolgens perfusie-gefixeerd en verwerkt voor immunofluorescentie en andere downstream-toepassingen om veranderingen in stamcelactivering, proliferatie, afstammingsverbintenis, migratie naar verschillende hersenniches en differentiatie naar volwassen celtypen te interpreteren. Met behulp van dit systeem kan elke rtTA-muis worden gekoppeld aan oTet-Cre en een Rosa-verslaggever om doxycycline-induceerbare "pulse-chase" lineage tracing-experimenten uit te voeren met behulp van markers van stamcellen.

Hoewel het fluorescerende signaal dat het gevolg is van een Tet-On-systeem met een fluorescerende reporter zal variëren afhankelijk van de promotor van interesse en de gebruikte fluorofoor (en), zullen we beschrijven hoe bevindingen werden geanalyseerd met mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmG-dieren. Analyse van volwassen hersenen na een pulsachtervolging resulteerde in membraan GFP-expresserende cellen in verschillende anatomische niches. Het verschil in fluorescerende intensiteit tussen verschillende celtypen moet worden o...

Watch this Scientific Journal Video about Lineage Tracing of Inducible Fluorescently-Labeled Stem Cells in the Adult Mouse Brain at JoVE.com

Lineage Tracing of Inducible Fluorescently-Labeled Stem Cells in the Adult Mouse Brain

Het vermogen om stamcellen en hun nakomelingen permanent te markeren met een fluorofoor met behulp van een induceerbare transgene lineage tracing muislijn maakt ruimtelijke en temporele analyse van activering, proliferatie, migratie en / of differentiatie in vivo mogelijk. Lineage tracing kan nieuwe informatie onthullen over lineage commitment, reactie op interventie(s) en multipotentie.

Afstamming Tracering van induceerbare fluorescerend gelabelde stamcellen in het volwassen muizenbrein

A telomerase reverse transcriptase (Tert) lineage-tracing mouse line was developed to investigate the behavior and fate of adult tissue stem cells, by ...

Het markeren van stamcellen en hun nakomelingen met een induceerbare transgene afstammingslijn maakt ruimtelijke en temporele analyse mogelijk van activering, proliferatie, migratie en / of differentiatie van volwassen stamcellen in de hersenen in vivo. Lineage tracing kan nieuwe informatie onthullen over lineage commitment, respons op interventies en multi-potentie. Voordelen van transgene lineage tracing-benaderingen zijn onder meer specificiteit van het traceren van een bepaalde cellijn, onuitwisbare expressie van het fluorescerende eiwit ongeacht celvernieuwing of -differentiatie, lage toxiciteit van doxycyline, voorwaardelijke activering en gebruiksgemak met gemeenschappelijke downstream-testen op afstammingsspoorweefsels, waaronder immunostaining en immunofluorescentie.Vanwege de brede implicatie van plasticiteit en cel in de volwassen hersenen, zal de karakterisering en analyse van volwassen stamcellen helpen informeren over de studie van neurodegeneratieve ziekten, metabole effecten op hersenplasticiteit, veroudering en andere gerelateerde aandoeningen. Om te beginnen, warm glijdt naar kamertemperatuur en post-fix met ijskoude aceton gedurende 15 minuten. Wasglaasjes gedurende vijf minuten in 1X spoelbuffer, schudden met 60 rotaties per minuut bij kamertemperatuur tussen elke stap.Permeabiliseren voor het staan van nucleaire antigenen met 0,3% Triton X-100 gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Permeabiliseren voor het staan van cytoplasmatische antigenen met 0,3% Tween-20 gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Voer antigeen ophalen uit door dia's in de magnetron te doen in 50 tot 100 milliliter 1x DAKO Antigen Retrieval Solution op laag gedurende 10 minuten, tweemaal.Spoel vervolgens met buffer gedurende vijf minuten op kamertemperatuur. incubeer dia's in 0,3% Typogen Black in 70% ethanol gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur en was vervolgens met spoelbuffer. Teken hydrofobe barrière rond weefsel.Blok gedurende 20 minuten bij 37 graden Celsius met blokkerend reagens. En incubeer met primair antilichaam verdund in antilichaam verdund in antilichaam verdunningsmiddel 's nachts bij vier graden Celsius. Was dia's gedurende 10 minuten op kamertemperatuur.De volgende dag incubeer secties in Alexa Fluor secundaire antilichamen gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Was vervolgens glaasjes twee keer in spoelbuffer gedurende 10 minuten. Bedek hersensecties in 100 microliter van één tot 500 anti-GFP-antilichamen geconjugeerd aan AlexaFluor 488 en incubeer 's nachts bij vier graden Celsius om de endogene Fluor4 te stimuleren, waardoor de getraceerde cellen worden gemarkeerd.Was de volgende dag twee keer met spoelbuffer. En was vervolgens vijf minuten in stromend DI-water. Counterstain met 100 nanogram per milliliter 4'6-diamidino-2-fenylindool gedurende vijf minuten.Was vervolgens vijf minuten in stromend DI-water. Voeg een druppel fluorescerend veilig montagemedium toe aan elke weefselsectie en sluit af met een afdekplaat van 22 millimeter bij 22 millimeter. Beeldvorming wordt aanbevolen op de dag van montage om een optimaal signaal te garanderen.Om te beginnen met fixatie en sectie na transcardiale perfusie post-fix hersenen in 4% PFA 's nachts bij vier graden Celsius. En dan weer een uur op kamertemperatuur. Was de hersenen in 1x PBS gedurende een uur tweemaal op kamertemperatuur.Snijd de hersenen in een millimeter dikke secties met behulp van het sagittale hersenblok en plaats in vijf milliliter microcentrifugebuizen met 1x PBS. Voor methanol voorbehandeling, begin met wassen met 1x PBS gedurende een uur tweemaal op kamertemperatuur. Was in 50% methanol gedurende een uur op kamertemperatuur.Was in 80% methanol gedurende een uur op kamertemperatuur. Was in 100% methanol gedurende een uur, twee keer, op kamertemperatuur. Bleekmonsters met 5% waterstofperoxide in 20% dimethylsulfoxide en methanol bij vier graden Celsius 's nachts.Was na het bleken monsters gedurende een uur tweemaal op kamertemperatuur in methanol. Was in 20% dimethylsulfoxide en methanol gedurende een uur tweemaal op kamertemperatuur. Was in 80% methanol gedurende een uur op kamertemperatuur.Was in 50% methanol gedurende een uur op kamertemperatuur. Was tweemaal een uur in PBS op kamertemperatuur. Was tweemaal één uur in PBS 0,2% Triton X-100 bij kamertemperatuur.Voor immunostain van het opruimen van hersenen, begin met het incuberen van monsters in 1x PBS, 0,2% Triton X-100, 20% DMSO, 0,3 molaire glycine, bij 37 graden Celsius 's nachts op een orbitale shaker. Blok in 1x PBS, 0,2% Triton X-100, 10% DMSO, 6% geitenserum bij 37 graden Celsius gedurende drie dagen op een orbitale shaker. Was monsters in 1x PBS, 0,2% Tween-20, 10 microgram per milliliter heparine natriumzout uit varkensslijmvlies gedurende tweemaal één uur bij 37 graden Celsius.Incubeer vervolgens in 1x PBS, 0,2% Tween-20, 10 microgram per milliliter heparine, 5% DMSO, 3% geitenserum met één tot 500 concentratie konijn anti GFP AlexaFluor 488 bij 37 graden Celsius op een orbitale shaker gedurende twee dagen. Was monsters in 1x PBS, 0,2% Tween-20 met 10 microgram per milliliter heparine gedurende één uur bij 37 graden Celsius op een orbitale shaker drie keer en vervolgens eenmaal per dag gedurende twee dagen. Incubeer monsters 's nachts in één milliliter van 50% Tetrahydrofuran en water.Incubeer monsters gedurende een uur in één milliliter van 80% THF Tetrahydrofuran en water. Incubeer monsters twee keer gedurende een uur in 100% Tetrahydrofuran. Droog monsters met een steriel doekje en incubeer in dichloormethaan totdat ze naar de bodem van de injectieflacon zinken.Niet langer dan 60 minuten incuberen. Incubeer monsters in één milliliter dibenzylether tot ze helder zijn. Bewaar monsters in dibenzyllether bij kamertemperatuur totdat ze klaar zijn om te worden afgebeeld.Om immunostained hersensecties in beeld te brengen, analyseert u dia's via confocale microscopie, waar co-expressie van meerdere antilichamen kan worden bevestigd. We gebruiken een Leica Stellaris vijf microscoop met HyD S hybride detectoren. Om gewiste hersenen in beeld te brengen, gebruikt u een omgekeerde confocale microscoop met een geautomatiseerd stadium en een geautomatiseerde tegelfunctie.Begin met het plat leggen van een opgeruimd hersengedeelte tegen een glazen bodemschaal in onderdompeling in dibenzylether. Een merkbaar verschil in fluorescerende intensiteit tussen verschillende hersengebieden en verschillende celtypen werd waargenomen na een pulsachtervolgingsperiode in de afstammingsgetraceerde hersenen. Choroïde epitheelcellen in de plexus choroïde hadden een dik celmembraan en een sterk groen fluorescerend signaal dat aangeeft dat ze afkomstig waren van Tert-positieve cellen die gemakkelijk te onderscheiden waren van de omliggende cellen.De andere kleinere celtypen in het choroïde plexus stroma hadden een zwakker GFP-signaal. In het cerebellum brachten Bergmann-gliacellen hogere niveaus van GFP tot expressie dan mandcellen, en variatie in GFP-expressie bestond ook tussen individuele mandcellen. Voor fabriekssensorische neuron-axonen binnen de glomerulaire laag van de olfactorische bol werden ook hoge niveaus van GFP Olfactorische sensorische neuron-axonen tot expressie gebracht die de glomerulaire laag van de olfactorische bol vullen, hoge niveaus van membraantomaat, of rode fluorescentie in vergelijking met de meeste andere hersengebieden, zelfs wanneer dezelfde neuronen GFP-positief zijn, wat aangeeft dat sommige cellen het mTomato-signaal langzamer leken te verliezen tijdens het traceren van afstamming.In de plexus choroid plexus daarentegen brachten positieve cellen een lage mTomato tot expressie. In de meeste andere hersengebieden kwamen tomatensignalen op laag niveau tot expressie in de meeste celtypen, waarbij endotheelcellen enkele van de enige cellen waren waarvan het fluorescerende signaal helder genoeg was om duidelijk te onderscheiden van de rode fluorescerende achtergrond van het hersenweefsel. Het belangrijkste om te onthouden is dat het fluorescerende signaal in gewiste hersenen sneller vervaagt dan de meeste andere immunotests.Vergeet niet om uw monsters zo snel mogelijk en binnen zeven dagen in beeld te brengen. Vervolgens kunnen beeldvorming van de hersensegmenten of heldere hersenen, inkleuring van markers met de GFP-signalen en onze kwantificering van fluorence worden uitgevoerd met behulp van softwareprogramma's.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay

Isolatie en uitbreiding van de volwassen muis neurale stamcellen Met behulp van de Neurosphere Assay

Isolation and expansion of the putative neural stem cells (NSCs) from the adult murine brain was first described by Reynolds and Weiss in 1992 employing a ...

Growing Neural Stem Cells from Conventional and Nonconventional Regions of the Adult Rodent Brain

Groeiende neurale stamcellen uit Conventionele en Niet-conventionele Regio&#39;s van de Adult knaagdierhersenen

Recent work demonstrates that central nervous system (CNS) regeneration and tumorigenesis involves populations of stem cells (SCs) resident within the ...

Electrophysiological Recording in the Brain of Intact Adult Zebrafish

Elektrofysiologische opname in de hersenen van Intact Adult zebravis

Previously, electrophysiological studies in adult zebrafish have been limited to slice preparations or to eye cup preparations and electrorentinogram ...

Assessing Cell Cycle Progression of Neural Stem and Progenitor Cells in the Mouse Developing Brain after Genotoxic Stress

Het beoordelen van de celcyclus van neurale stamcellen en stamcellen in de Mouse ontwikkeling van de hersenen na genotoxische stress

Neurons of the cerebral cortex are generated during brain development from different types of neural stem and progenitor cells (NSPC), which form a ...

Lineage-reprogramming of Pericyte-derived Cells of the Adult Human Brain into Induced Neurons

Lineage-herprogrammering van pericyte-afgeleide cellen van het volwassen menselijke hersenen in Induced Neuronen

Direct lineage-reprogramming of non-neuronal cells into induced neurons (iNs) may provide insights into the molecular mechanisms underlying neurogenesis ...

Conditional Genetic Transsynaptic Tracing in the Embryonic Mouse Brain

Voorwaardelijke Genetische transsynaptische Tracing in de embryonale hersenen van muizen

Anatomical path tracing is of pivotal importance to decipher the relationship between brain and behavior. Unraveling the formation of neural circuits ...

Laser-guided Neuronal Tracing In Brain Explants

Lasergestuurde Neuronal Tracing In Brain Explantaten

We present a technique which combines an in vitro tracer injection protocol, which uses a series of electrical and pressure pulses to increase dye uptake ...

Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Mouse Subcallosal Zone

Isolatie en cultuur van de volwassen neurale stamcellen van de muis Subcallosal Zone

Adult neural stem cells (aNSCs) can be used for the regeneration of damaged brain tissue. NSCs have the potential for differentiation and proliferation ...

An In Vivo Blood-brain Barrier Permeability Assay in Mice Using Fluorescently Labeled Tracers

An In Vivo Blood-brain Barrier Permeability Assay in Mice Using Fluorescently Labeled Tracers

Een In Vivo bloed - hersenbarrière permeabiliteit Assay in muizen met behulp van Fluorescently label Tracers

Blood-brain barrier (BBB) is a specialized barrier that protects the brain microenvironment from toxins and pathogens in the circulation and maintains ...

Intra-Arterial Delivery of Neural Stem Cells to the Rat and Mouse Brain: Application to Cerebral Ischemia

Intra-arteriële levering van neurale stamcellen aan de Rat en Mouse Brain: Toepassing op cerebrale ischemie

Neural stem cell (NSC) therapy is an emerging innovative treatment for stroke, traumatic brain injury and neurodegenerative disorders. As compared to ...