Name: lineage tracing of inducible fluorescently-labeled stem cells in the adult mouse brain
Uploaded: 2022-05-20T14:00:00
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डायना कार्लोन (बोस्टन चिल्ड्रन हॉस्पिटल, हार्वर्ड मेडिकल स्कूल) और डॉ मैथ्यू लिन्स (जोसलिन डायबिटीज सेंटर; मेन मेडिकल सेंटर रिसर्च इंस्टीट्यूट) एमटीईआरटी-आरटीटीए जानवरों का उपयोग करके मार्गदर्शन के लिए।

यहां वर्णित सभी तरीकों को ओहियो स्टेट यूनिवर्सिटी की संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (आईएसीयूसी) द्वारा अनुमोदित किया गया है।
1. प्रयोगात्मक पलटन चूहों के लिए टेट-ऑन माउस लाइन, प्रजनन र?...

     

विवो में वयस्क माउस मस्तिष्क के भीतर स्टेम कोशिकाओं को चिह्नित करने वाली ट्रिपल ट्रांसजेनिक वंश ट्रेसिंग माउस लाइन के निर्माण, उपयोग और विश्लेषण के लिए एक विधि का वर्णन किया गया है। जब इम्यूनोस्ट?...

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	<tbody>
		<tr>
			<td>Antibody diluent</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>S080983-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antigen Retrieval Solution</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>S2367</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-GFP antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A2311</td>
			<td>Use at 1:500-1:000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A18-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B6.Cg-Tg(tet0-cre)1Jaw/J</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>JAX:006234</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B6.129(Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo/J</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>JAX:007676</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blocking Solution (IHC)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>20773</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blunt needle</td>
			<td>BSTEAN</td>
			<td>X0012SYHIV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coronal brain block</td>
			<td>Braintree</td>
			<td>BS-2000C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover slip</td>
			<td>Corning</td>
			<td>2850-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat</td>
			<td>Leica</td>
			<td>CM1900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D564</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dibenzyl ether</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>33630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichloromethane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>270997</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey Serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9663</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Doxycycline Hyclate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9891</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0718</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin Sodium Salt from Porcine Mucosa</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histochoice Molecular Biology Tissue Fixative</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>H120</td>
			<td>This product has since been discontinued, but can be replaced with Glyo-Fixx (Thermo Scientific, 6764265)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen Peroxide Solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>516813</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IHC Select TBS Rinse Buffer</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>20845</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine</td>
			<td>Westward</td>
			<td>0143-95095-10</td>
			<td>This product requires a DEA license for storage and use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A452-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Slides</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milipore Block</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>20773</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting medium</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>5013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optimal Cutting Temperature Solution</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS Solution (10X)</td>
			<td>Teknova</td>
			<td>P0496</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sagittal brain block</td>
			<td>Braintree</td>
			<td>RBM-2000S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saline</td>
			<td>Braun</td>
			<td>S8004-5264</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sudan (Typogen) Black</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>199664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetrahydrofuran</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>186562</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue cartridge</td>
			<td>Simport</td>
			<td>M512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>655205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>AnaSed</td>
			<td>sc-362950Rx</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

lineage tracing of inducible fluorescently-labeled stem cells in the adult mouse brain

टर्ट प्रमोटर से जुड़े एक उपन्यास रिवर्स टेट्रासाइक्लिन ट्रांसएक्टिवेटर (आरटीटीए) ट्रांसजीन के साथ 'टेट-ऑन' सिस्टम ओटेट-क्रे माउस को पार करके वयस्क ऊतक स्टेम कोशिकाओं के व्यवहार और भाग्य की जांच करने के लिए एक टेलोमेरेज़ रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस (टर्ट) वंश-अनुरेखण माउस लाइन विकसित की गई थी, जिसे हमने वयस्क मस्तिष्क स्टेम कोशिकाओं की एक उपन्यास आबादी के निशान का प्रदर्शन किया है। यहां, टेट्रासाइक्लिन व्युत्पन्न डॉक्सीसाइक्लिन का प्रशासन एमटीईआरटी-आरटीटीए :: ओटेट-क्रे चूहों को अमिट रूप से कोशिकाओं की आबादी को चिह्नित करेगा जो जीन टर्ट के प्रमोटर क्षेत्र के 4.4 केबी टुकड़े को व्यक्त करते हैं। जब रोजा-एमटीएमजी रिपोर्टर को जोड़ा जाता है, तो एमटीर्ट-आरटीटीए :: ओटेट-क्रे :: रोजा-एमटीएमजी चूहे झिल्ली टीडीटोमैटो (एमटोमैटो) व्यक्त करेंगे जब तक कि डॉक्सीसाइक्लिन उपचार कोशिकाओं में झिल्ली ईजीएफपी (एमजीएफपी) के साथ एमटीमैटो अभिव्यक्ति के प्रतिस्थापन को प्रेरित नहीं करता है जो टर्ट को भी व्यक्त करते हैं। इसलिए, जब इन ट्रिपल-ट्रांसजेनिक वंश अनुरेखण चूहों को डॉक्सीसाइक्लिन ("पल्स" अवधि जिसके दौरान टीईआरटी व्यक्त कोशिकाओं को चिह्नित किया जाता है) प्राप्त होता है, तो ये कोशिकाएं अमिट रूप से चिह्नित एमजीएफपी + कोशिकाएं बन जाएंगी, जिन्हें डॉक्सीसाइक्लिन हटाने ("पीछा" अवधि) के बाद किसी भी वांछनीय समय के लिए ट्रैक किया जा सकता है, भले ही टर्ट अभिव्यक्ति बाद में खो गई हो। मस्तिष्क को तब छिड़काव-तय किया जाता है और इम्यूनोफ्लोरेसेंस और अन्य डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों के लिए संसाधित किया जाता है ताकि स्टेम सेल सक्रियण, प्रसार, वंश प्रतिबद्धता, विभिन्न मस्तिष्क निचे में प्रवास, और परिपक्व सेल प्रकारों के लिए भेदभाव में परिवर्तन की व्याख्या की जा सके। इस प्रणाली का उपयोग करके, स्टेम कोशिकाओं के मार्करों का उपयोग करके डॉक्सीसाइक्लिन-प्रेरक "पल्स-चेस" वंश अनुरेखण प्रयोगों का संचालन करने के लिए किसी भी आरटीटीए माउस को ओटेट-क्रे और रोजा रिपोर्टर से जोड़ा जा सकता है।

जबकि फ्लोरोसेंट रिपोर्टर के साथ टेट-ऑन सिस्टम से उत्पन्न फ्लोरोसेंट सिग्नल ब्याज के प्रमोटर और फ्लोरोफोर (ओं) के आधार पर अलग-अलग होगा, हम वर्णन करेंगे कि एमटर्ट-आरटीटीए :: ओटेट-क्रे :: रोजा-एमटीएमजी जानवर...

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Lineage Tracing of Inducible Fluorescently-Labeled Stem Cells in the Adult Mouse Brain

एक प्रेरक ट्रांसजेनिक वंश अनुरेखण माउस लाइन का उपयोग करके फ्लोरोफोर के साथ स्टेम कोशिकाओं और उनकी संतानों को स्थायी रूप से चिह्नित करने की क्षमता विवो में सक्रियण, प्रसार, प्रवास और / या भेदभाव के स्थानिक और अस्थायी विश्लेषण की अनुमति देती है। वंश अनुरेखण वंश प्रतिबद्धता, हस्तक्षेप (ओं) की प्रतिक्रिया और मल्टीपोटेंसी के बारे में उपन्यास जानकारी प्रकट कर सकता है।

वयस्क माउस मस्तिष्क में प्रेरक फ्लोरोसेंटली-लेबल स्टेम सेल की वंशावली अनुरेखण

A telomerase reverse transcriptase (Tert) lineage-tracing mouse line was developed to investigate the behavior and fate of adult tissue stem cells, by ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay

अलगाव और वयस्क माउस तंत्रिका स्टेम सेल के विस्तार Neurosphere परख का उपयोग

Isolation and expansion of the putative neural stem cells (NSCs) from the adult murine brain was first described by Reynolds and Weiss in 1992 employing a ...

Growing Neural Stem Cells from Conventional and Nonconventional Regions of the Adult Rodent Brain

वयस्क कृंतक मस्तिष्क के पारंपरिक और nonconventional क्षेत्र से तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं से बढ़

Recent work demonstrates that central nervous system (CNS) regeneration and tumorigenesis involves populations of stem cells (SCs) resident within the ...

Electrophysiological Recording in the Brain of Intact Adult Zebrafish

बरकरार वयस्क zebrafish के मस्तिष्क में electrophysiological रिकॉर्डिंग

Previously, electrophysiological studies in adult zebrafish have been limited to slice preparations or to eye cup preparations and electrorentinogram ...

Assessing Cell Cycle Progression of Neural Stem and Progenitor Cells in the Mouse Developing Brain after Genotoxic Stress

Genotoxic तनाव के बाद तंत्रिका स्टेम और माउस विकासशील मस्तिष्क में पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं का आकलन कोशिका चक्र प्रगति

Neurons of the cerebral cortex are generated during brain development from different types of neural stem and progenitor cells (NSPC), which form a ...

Lineage-reprogramming of Pericyte-derived Cells of the Adult Human Brain into Induced Neurons

प्रेरित न्यूरॉन्स में वयस्क मानव मस्तिष्क की pericyte व्युत्पन्न कोशिकाओं के वंश reprogramming

Direct lineage-reprogramming of non-neuronal cells into induced neurons (iNs) may provide insights into the molecular mechanisms underlying neurogenesis ...

Conditional Genetic Transsynaptic Tracing in the Embryonic Mouse Brain

भ्रूण माउस ब्रेन में ट्रेसिंग सशर्त जेनेटिक Transsynaptic

Anatomical path tracing is of pivotal importance to decipher the relationship between brain and behavior. Unraveling the formation of neural circuits ...

Laser-guided Neuronal Tracing In Brain Explants

लेजर निर्देशित Neuronal का पता लगाने में ब्रेन Explants

We present a technique which combines an in vitro tracer injection protocol, which uses a series of electrical and pressure pulses to increase dye uptake ...

Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Mouse Subcallosal Zone

अलगाव और वयस्क तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं की संस्कृति माउस Subcallosal जोन से

Adult neural stem cells (aNSCs) can be used for the regeneration of damaged brain tissue. NSCs have the potential for differentiation and proliferation ...

An In Vivo Blood-brain Barrier Permeability Assay in Mice Using Fluorescently Labeled Tracers

An In Vivo Blood-brain Barrier Permeability Assay in Mice Using Fluorescently Labeled Tracers

एक Vivo में रक्त-चूहों में मस्तिष्क बाधा पारगम्यता परख फ्लोरोसेंट लेबल अनुरेखकों का उपयोग

Blood-brain barrier (BBB) is a specialized barrier that protects the brain microenvironment from toxins and pathogens in the circulation and maintains ...

Intra-Arterial Delivery of Neural Stem Cells to the Rat and Mouse Brain: Application to Cerebral Ischemia

चूहा और माउस मस्तिष्क के लिए तंत्रिका स्टेम सेल की अंतर-धमनी वितरण: सेरेब्रल इस्केमिया के लिए आवेदन

Neural stem cell (NSC) therapy is an emerging innovative treatment for stroke, traumatic brain injury and neurodegenerative disorders. As compared to ...