Name: lineage tracing of inducible fluorescently-labeled stem cells in the adult mouse brain
Uploaded: 2022-05-20T14:00:00
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Gli autori desiderano ringraziare la dottoressa Diana Carlone (Boston Children's Hospital, Harvard Medical School) e il dottor Matthew Lynes (Joslin Diabetes Center; Maine Medical Center Research Institute) per la guida utilizzando animali mTert-rtTA.

Tutti i metodi qui descritti sono stati approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) della Ohio State University.
1. Creazione di un lignaggio che traccia la linea di topi Tet-On, strategie di allevamento e genotipizzazione per topi di coorte sperimentali
NOTA: Qui, delineiamo la creazione di un sistema di topi Tet-On con Rosa-mTmG come gene reporter fluorescente che subisce la ricombinazione Cre, tuttavia varie altre linee repor...

     

Viene descritto un metodo per la creazione, l'utilizzo e l'analisi di un triplo lignaggio transgenico che traccia la linea di topo che segna le cellule staminali all'interno del cervello di topo adulto in vivo. Se combinato con l'immunocolorazione o la pulizia del cervello, l'identificazione e la caratterizzazione delle cellule fluorescenti tracciate attraverso il cervello possono essere realizzate. Questa tecnica offre la capacità di comprendere il potenziale plastico / rigenerativo / rimodellante delle cellul...

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	<tbody>
		<tr>
			<td>Antibody diluent</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>S080983-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antigen Retrieval Solution</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>S2367</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-GFP antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A2311</td>
			<td>Use at 1:500-1:000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A18-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B6.Cg-Tg(tet0-cre)1Jaw/J</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>JAX:006234</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B6.129(Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo/J</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>JAX:007676</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blocking Solution (IHC)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>20773</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blunt needle</td>
			<td>BSTEAN</td>
			<td>X0012SYHIV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coronal brain block</td>
			<td>Braintree</td>
			<td>BS-2000C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover slip</td>
			<td>Corning</td>
			<td>2850-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat</td>
			<td>Leica</td>
			<td>CM1900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D564</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dibenzyl ether</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>33630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichloromethane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>270997</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey Serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9663</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Doxycycline Hyclate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9891</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0718</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin Sodium Salt from Porcine Mucosa</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histochoice Molecular Biology Tissue Fixative</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>H120</td>
			<td>This product has since been discontinued, but can be replaced with Glyo-Fixx (Thermo Scientific, 6764265)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen Peroxide Solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>516813</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IHC Select TBS Rinse Buffer</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>20845</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine</td>
			<td>Westward</td>
			<td>0143-95095-10</td>
			<td>This product requires a DEA license for storage and use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A452-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Slides</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milipore Block</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>20773</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting medium</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>5013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optimal Cutting Temperature Solution</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS Solution (10X)</td>
			<td>Teknova</td>
			<td>P0496</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sagittal brain block</td>
			<td>Braintree</td>
			<td>RBM-2000S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saline</td>
			<td>Braun</td>
			<td>S8004-5264</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sudan (Typogen) Black</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>199664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetrahydrofuran</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>186562</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue cartridge</td>
			<td>Simport</td>
			<td>M512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>655205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>AnaSed</td>
			<td>sc-362950Rx</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

lineage tracing of inducible fluorescently-labeled stem cells in the adult mouse brain

Una linea di topo di tracciamento della trascrittasi inversa della telomerasi (Tert) è stata sviluppata per studiare il comportamento e il destino delle cellule staminali dei tessuti adulti, incrociando il sistema "Tet-On" oTet-Cre mouse con un nuovo transgene transattivatore inverso della tetraciclina (rtTA) collegato al promotore Tert, che abbiamo dimostrato segna una nuova popolazione di cellule staminali cerebrali adulte. Qui, la somministrazione del derivato tetraciclina doxiciclina a topi mTert-rtTA::oTet-Cre segnerà in modo indelebile una popolazione di cellule che esprimono un frammento di 4,4 kb della regione promotore del gene Tert. Quando combinato il reporter Rosa-mTmG, i topi mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmG esprimeranno tdTomato di membrana (mTomato) fino a quando il trattamento con doxiciclina indurrà la sostituzione dell'espressione di mTomato con EGFP di membrana (mGFP) nelle cellule che esprimono anche Tert. Pertanto, quando questi topi di tracciamento del lignaggio triplo transgenico ricevono doxiciclina (il periodo di "impulso" durante il quale vengono marcate le cellule che esprimono TERT), queste cellule diventeranno cellule mGFP+ indelebilmente marcate, che possono essere monitorate per qualsiasi periodo di tempo desiderabile dopo la rimozione della doxiciclina (il periodo di "inseguimento"), anche se l'espressione di Tert viene successivamente persa. I cervelli vengono quindi fissati per perfusione ed elaborati per l'immunofluorescenza e altre applicazioni a valle al fine di interpretare i cambiamenti nell'attivazione delle cellule staminali, nella proliferazione, nell'impegno del lignaggio, nella migrazione a varie nicchie cerebrali e nella differenziazione verso tipi di cellule mature. Utilizzando questo sistema, qualsiasi topo rtTA può essere accoppiato a oTet-Cre e un reporter Rosa per condurre esperimenti di tracciamento del lignaggio "pulse-chase" inducibili dalla doxiciclina utilizzando marcatori di cellule staminali.

Mentre il segnale fluorescente risultante da un sistema Tet-On con un reporter fluorescente varierà a seconda del promotore di interesse e dei fluorofori utilizzati, descriveremo come i risultati sono stati analizzati con gli animali mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmG. L'analisi del cervello adulto dopo un inseguimento del polso ha portato a cellule che esprimono GFP di membrana in varie nicchie anatomiche. La differenza di intensità fluorescente tra i vari tipi di cellule deve essere notata. Una variabile per quanto rigu...

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Lineage Tracing of Inducible Fluorescently-Labeled Stem Cells in the Adult Mouse Brain

La capacità di marcare in modo permanente le cellule staminali e la loro progenie con un fluoroforo utilizzando una linea di topo di tracciamento del lignaggio transgenico inducibile consente l'analisi spaziale e temporale dell'attivazione, proliferazione, migrazione e / o differenziazione in vivo. Il tracciamento del lignaggio può rivelare nuove informazioni sull'impegno del lignaggio, sulla risposta agli interventi e sulla multipotenza.

Tracciamento del lignaggio delle cellule staminali fluorescenti inducibili nel cervello del topo adulto

A telomerase reverse transcriptase (Tert) lineage-tracing mouse line was developed to investigate the behavior and fate of adult tissue stem cells, by ...

Contrassegnare le cellule staminali e la loro progenie con una linea di topo di tracciamento del lignaggio transgenico inducibile consente l'analisi spaziale e temporale dell'attivazione, proliferazione, migrazione e / o differenziazione delle cellule staminali adulte nel cervello in vivo. Il tracciamento del lignaggio può rivelare nuove informazioni sull'impegno del lignaggio, sulla risposta agli interventi e sulla multipotenza. I vantaggi degli approcci di tracciamento del lignaggio transgenico includono la specificità di tracciare un particolare lignaggio cellulare, l'espressione indelebile della proteina fluorescente indipendentemente dal turnover o dalla differenziazione cellulare, la bassa tossicità della doxicilina, l'attivazione condizionata e la facilità d'uso con saggi comuni a valle su tessuti traccia di lignaggio, tra cui immunocolorazione e immunofluorescenza.A causa dell'ampia implicazione della plasticità e della cellula nel cervello adulto, la caratterizzazione e l'analisi delle cellule staminali adulte aiuteranno a informare lo studio delle malattie neurodegenerative, degli impatti metabolici sulla plasticità cerebrale, dell'invecchiamento e di altre condizioni correlate. Per iniziare, scivola caldo a temperatura ambiente e post-fissato con acetone ghiacciato per 15 minuti. Lavare i vetrini per cinque minuti in un tampone di risciacquo 1X, agitando a 60 rotazioni al minuto a temperatura ambiente tra un passaggio e l'altro.Permeabilizzare per stare in piedi di antigeni nucleari con 0,3% Triton X-100 per 10 minuti a temperatura ambiente. Permeabilizzare per la posizione di antigeni citoplasmatici con 0,3% Tween-20 per 10 minuti a temperatura ambiente. Eseguire il recupero dell'antigene mediante vetrini a microonde in 50-100 millilitri di 1x soluzione di recupero dell'antigene DAKO in basso per 10 minuti, due volte.Quindi, risciacquare con tampone per cinque minuti a temperatura ambiente. incubare vetrini in 0,3% Typogen Black in etanolo al 70% per 20 minuti a temperatura ambiente e quindi lavare con tampone di risciacquo. Disegna la barriera idrofobica intorno al tessuto.Bloccare per 20 minuti a 37 gradi Celsius con reagente bloccante. E incubare con anticorpo primario diluito in diluente anticorpale durante la notte a quattro gradi Celsius. Lavare le diapositive per 10 minuti a temperatura ambiente.Il giorno successivo, incubare sezioni in anticorpi secondari Alexa Fluor per 10 minuti a temperatura ambiente. Quindi lavare le diapositive due volte nel tampone di risciacquo per 10 minuti. Coprire le sezioni cerebrali in 100 microlitri da uno a 500 anticorpi anti-GFP coniugati ad AlexaFluor 488 e incubare durante la notte a quattro gradi Celsius per aumentare il Fluor4 endogeno, segnando le cellule tracciate.Il giorno successivo, lavare con tampone di risciacquo due volte. E poi lavare in acqua corrente DI per cinque minuti. Contromacchia con 100 nanogrammi per millilitro 4'6-diamidino-2-fenilindolo per cinque minuti.Quindi lavare in acqua corrente DI per cinque minuti. Aggiungere una goccia di mezzo di montaggio fluorescente sicuro sopra ogni sezione di tessuto e sigillare con un coperchio di 22 millimetri per 22 millimetri. L'imaging è consigliato il giorno del montaggio per garantire un segnale ottimale.Per iniziare la fissazione e il sezionamento dopo la perfusione transcardica post-fix cervelli in 4% PFA durante la notte a quattro gradi Celsius. E poi di nuovo per un'ora a temperatura ambiente. Lavare il cervello in 1x PBS per un'ora due volte a temperatura ambiente.Tagliare il cervello in sezioni spesse un millimetro usando il blocco cerebrale sagittale e metterlo in cinque tubi micro centrifughi da millilitri contenenti 1x PBS. Per il pretrattamento con metanolo, iniziare lavando con 1x PBS per un'ora due volte a temperatura ambiente. Lavare al 50% di metanolo per un'ora a temperatura ambiente.Lavare in metanolo all'80% per un'ora a temperatura ambiente. Lavare al 100% metanolo per un'ora, due volte, a temperatura ambiente. Campioni di candeggina con perossido di idrogeno al 5% in 20% di dimetilsolfossido e metanolo a quattro gradi Celsius durante la notte.Dopo lo sbiancamento, lavare i campioni in metanolo per un'ora due volte a temperatura ambiente. Lavare al 20% di dimetilsolfossido e metanolo per un'ora due volte a temperatura ambiente. Lavare in metanolo all'80% per un'ora a temperatura ambiente.Lavare al 50% di metanolo per un'ora a temperatura ambiente. Lavare in PBS per un'ora due volte a temperatura ambiente. Lavare in PBS 0,2% Triton X-100 per un'ora due volte a temperatura ambiente.Per l'immunocolorazione dei cervelli di compensazione, iniziare incubando campioni in 1x PBS, 0,2% Triton X-100, 20% DMSO, 0,3 glicina molare, a 37 gradi Celsius durante la notte su uno shaker orbitale. Blocco in 1x PBS, 0,2% Triton X-100, 10% DMSO, 6% siero di capra a 37 gradi Celsius per tre giorni su uno shaker orbitale. Lavare i campioni in 1x PBS, 0,2% Tween-20, 10 microgrammi per millilitro di sale eparina sodica dalla mucosa suina per un'ora due volte a 37 gradi Celsius.Successivamente, incubare in 1x PBS, 0,2% Tween-20, 10 microgrammi per millilitro eparina, 5% DMSO, 3% siero di capra contenente da una a 500 concentrazioni di coniglio anti GFP AlexaFluor 488 a 37 gradi Celsius su uno shaker orbitale per due giorni. Lavare i campioni in 1x PBS, 0,2% Tween-20 con 10 microgrammi per millilitro di eparina per un'ora a 37 gradi Celsius su uno shaker orbitale tre volte e poi una volta al giorno per due giorni. Incubare i campioni durante la notte in un millilitro di 50% tetraidrofurano e acqua.Incubare i campioni per un'ora in un millilitro di 80% THF Tetraidrofurano e acqua. Incubare i campioni due volte per un'ora in 100% tetraidrofurano. Asciugare i campioni con una salvietta sterile e incubare in diclorometano fino a quando non affondano sul fondo del flaconcino.Non incubare per più di 60 minuti. Incubare i campioni in un millilitro di etere dibenzil fino a quando non sono chiari. Conservare i campioni in etere dibenzil a temperatura ambiente fino a quando non sono pronti per l'immagine.Per visualizzare sezioni cerebrali immunocolorate, analizzare i vetrini tramite microscopia confocale, dove può essere confermata la co-espressione di più anticorpi. Utilizziamo un microscopio Leica Stellaris five con rivelatori ibridi HyD S. Per visualizzare i cervelli cancellati, utilizzare un microscopio confocale invertito con uno stadio automatizzato e una funzione di piastrellatura automatizzata.Inizia posando una sezione cerebrale ripulita piatta contro un piatto di fondo di vetro in immersione nell'etere dibenzile. Una notevole differenza di intensità fluorescente tra diverse regioni del cervello e vari tipi di cellule è stata osservata dopo un periodo di inseguimento del polso nel cervello tracciato del lignaggio. Le cellule epiteliali coroidi nel plesso coroideo avevano una spessa membrana cellulare e un forte segnale fluorescente verde che indicava che derivavano da cellule Tert positive che erano facilmente distinguibili dalle cellule circostanti.Gli altri tipi di cellule più piccole nello stroma del plesso coroideo avevano un segnale GFP più debole. Nel cervelletto, le cellule gliali di Bergmann esprimevano livelli più elevati di GFP rispetto alle cellule del cesto, e la variazione nell'espressione della GFP esisteva anche tra le singole cellule del cesto. Per gli assoni dei neuroni sensoriali di fabbrica all'interno dello strato glomerulare del bulbo olfattivo esprimevano anche alti livelli di GFP Assoni neuronali sensoriali olfattivi che riempiono lo strato glomerulare del bulbo olfattivo esprimevano alti livelli di pomodoro a membrana, o fluorescenza rossa rispetto alla maggior parte delle altre regioni del cervello anche quando gli stessi neuroni sono GFP positivi indicando che alcune cellule sembravano perdere il segnale mTomato più lentamente durante il tracciamento del lignaggio.Al contrario, nel plesso coroideo le cellule GFP positive hanno espresso un basso mTomato. Nella maggior parte delle altre regioni del cervello, i segnali del pomodoro espressi a basso livello nella maggior parte dei tipi di cellule con cellule endoteliali che sono alcune delle uniche cellule il cui segnale fluorescente era abbastanza luminoso da distinguersi distintamente dallo sfondo fluorescente rosso del tessuto cerebrale. La cosa più importante da ricordare è che il segnale fluorescente nei cervelli cancellati svanisce più velocemente della maggior parte degli altri test immunologici.Ricordati di fotografare i tuoi campioni il prima possibile ed entro sette giorni. A seguire, l'imaging delle fette di cervello o dei cervelli chiari, la colorazione dei marcatori con i segnali GFP e la nostra quantificazione della fluorenza possono essere intrapresi utilizzando programmi software.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay

Isolamento ed espansione della cellule staminali neurali del mouse utilizzando il saggio neurosfere

Isolation and expansion of the putative neural stem cells (NSCs) from the adult murine brain was first described by Reynolds and Weiss in 1992 employing a ...

Ricerca

Neuroscienze

Growing Neural Stem Cells from Conventional and Nonconventional Regions of the Adult Rodent Brain

Crescere cellule staminali neurali da Regioni convenzionali e non convenzionali del cervello adulto Roditore

Recent work demonstrates that central nervous system (CNS) regeneration and tumorigenesis involves populations of stem cells (SCs) resident within the ...

Electrophysiological Recording in the Brain of Intact Adult Zebrafish

Registrazione elettrofisiologica nel cervello di intatto Zebrafish adulti

Previously, electrophysiological studies in adult zebrafish have been limited to slice preparations or to eye cup preparations and electrorentinogram ...

Assessing Cell Cycle Progression of Neural Stem and Progenitor Cells in the Mouse Developing Brain after Genotoxic Stress

Valutare progressione del ciclo cellulare delle staminali e cellule progenitrici del cervello di sviluppo del mouse dopo stress genotossico

Neurons of the cerebral cortex are generated during brain development from different types of neural stem and progenitor cells (NSPC), which form a ...

Lineage-reprogramming of Pericyte-derived Cells of the Adult Human Brain into Induced Neurons

Lineage-riprogrammazione di cellule pericyte-derivate del cervello umano adulto in neuroni indotti

Direct lineage-reprogramming of non-neuronal cells into induced neurons (iNs) may provide insights into the molecular mechanisms underlying neurogenesis ...

Conditional Genetic Transsynaptic Tracing in the Embryonic Mouse Brain

Condizionale genetica Transsynaptic Tracing nel cervello embrionali di topo

Anatomical path tracing is of pivotal importance to decipher the relationship between brain and behavior. Unraveling the formation of neural circuits ...

Laser-guided Neuronal Tracing In Brain Explants

Neuronal Tracing negli espianti cerebrali a guida laser

We present a technique which combines an in vitro tracer injection protocol, which uses a series of electrical and pressure pulses to increase dye uptake ...

Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Mouse Subcallosal Zone

Isolamento e la coltura di adulti neurali cellule staminali dal Subcallosal Zona mouse

Adult neural stem cells (aNSCs) can be used for the regeneration of damaged brain tissue. NSCs have the potential for differentiation and proliferation ...

An In Vivo Blood-brain Barrier Permeability Assay in Mice Using Fluorescently Labeled Tracers

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In Vivo barriera emato - encefalica permeabilità saggio nei topi utilizzando fluorescente etichettati traccianti

Blood-brain barrier (BBB) is a specialized barrier that protects the brain microenvironment from toxins and pathogens in the circulation and maintains ...

Intra-Arterial Delivery of Neural Stem Cells to the Rat and Mouse Brain: Application to Cerebral Ischemia

Consegna intra-arteriosa di cellule staminali neurali al cervello di ratto e topo: applicazione all'ischemia cerebrale

Neural stem cell (NSC) therapy is an emerging innovative treatment for stroke, traumatic brain injury and neurodegenerative disorders. As compared to ...