Name: lineage tracing of inducible fluorescently-labeled stem cells in the adult mouse brain
Uploaded: 2022-05-20T14:00:00
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著者らは、ダイアナ・カルロン博士(ボストン小児病院、ハーバード大学医学部)とマシュー・ラインズ博士(ジョスリン糖尿病センター;メイン州医療センター研究所)の動物を利用した指導のため。

ここに記載されているすべての方法は、オハイオ州立大学の施設動物ケアおよび使用委員会(IACUC)によって承認されています。
1. 実験コホートマウスのテトオン系統追跡系統の作成、育種戦略、ジェノタイピング
注:ここでは、Cre組換えを受ける蛍光レポーター遺伝子としてRosa-mTmGを用いたTet-Onマウスシステムの作成について概説するが、T...

     

インビボで成体マウス脳内のマウス系統マーキング幹細胞をトレースするトリプルトランスジェニック系統の作成、利用、および解析のための方法が記載されている。免疫染色または脳クリアリングと組み合わせると、脳全体のトレースされた蛍光細胞の同定および特性評価を達成することができる。この技術は、標識幹細胞が活性化、遊遊、分化、または増殖する際に、標識幹細胞?...

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	<tbody>
		<tr>
			<td>Antibody diluent</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>S080983-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antigen Retrieval Solution</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>S2367</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-GFP antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A2311</td>
			<td>Use at 1:500-1:000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A18-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B6.Cg-Tg(tet0-cre)1Jaw/J</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>JAX:006234</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B6.129(Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo/J</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>JAX:007676</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blocking Solution (IHC)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>20773</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blunt needle</td>
			<td>BSTEAN</td>
			<td>X0012SYHIV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coronal brain block</td>
			<td>Braintree</td>
			<td>BS-2000C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover slip</td>
			<td>Corning</td>
			<td>2850-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat</td>
			<td>Leica</td>
			<td>CM1900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D564</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dibenzyl ether</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>33630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichloromethane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>270997</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey Serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9663</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Doxycycline Hyclate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9891</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0718</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin Sodium Salt from Porcine Mucosa</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histochoice Molecular Biology Tissue Fixative</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>H120</td>
			<td>This product has since been discontinued, but can be replaced with Glyo-Fixx (Thermo Scientific, 6764265)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen Peroxide Solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>516813</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IHC Select TBS Rinse Buffer</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>20845</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine</td>
			<td>Westward</td>
			<td>0143-95095-10</td>
			<td>This product requires a DEA license for storage and use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A452-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Slides</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milipore Block</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>20773</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting medium</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>5013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optimal Cutting Temperature Solution</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS Solution (10X)</td>
			<td>Teknova</td>
			<td>P0496</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sagittal brain block</td>
			<td>Braintree</td>
			<td>RBM-2000S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saline</td>
			<td>Braun</td>
			<td>S8004-5264</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sudan (Typogen) Black</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>199664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetrahydrofuran</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>186562</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue cartridge</td>
			<td>Simport</td>
			<td>M512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>655205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>AnaSed</td>
			<td>sc-362950Rx</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

lineage tracing of inducible fluorescently-labeled stem cells in the adult mouse brain

「Tet-On」系oTet-CreマウスをTertプロモーターに連結した新規な逆テトラサイクリントランスアクチベーター(rtTA)導入遺伝子と交差させることにより、成体組織幹細胞の挙動と運命を調査するためにテロメラーゼ逆転写酵素(Tert)系統追跡マウス系統が開発され、成体脳幹細胞の新規集団を示すことが実証された。ここで、テトラサイクリン誘導体ドキシサイクリンをmTert-rtTA::oTet-Creマウスに投与すると、遺伝子Tertのプロモーター領域の4.4 kbフラグメントを発現する細胞集団を不滅にマークする。Rosa-mTmGレポーターを併用すると、mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmGマウスは、ドキシサイクリン処理がTertも発現する細胞においてmTomato発現を膜EGFP(mGFP)で置換することを誘導するまで、膜tdTomato(mTomato)を発現する。したがって、これらのトリプルトランスジェニック系統追跡マウスがドキシサイクリン(TERT発現細胞がマークされる「パルス」期間)を受けると、これらの細胞は不滅にマークされたmGFP+細胞となり、その後にTert発現が失われても、ドキシサイクリン除去後(「追跡」期間)の任意の望ましい時間追跡することができる。次に、幹細胞の活性化、増殖、系統のコミットメント、さまざまな脳ニッチへの移行、成熟した細胞型への分化の変化を解釈するために、脳を灌流固定し、免疫蛍光やその他の下流アプリケーション用に処理します。このシステムを使用して、任意のrtTAマウスをoTet-CreおよびRosaレポーターに交配させ、幹細胞のマーカーを使用してドキシサイクリン誘導性「パルスチェイス」系統追跡実験を行うことができる。

蛍光レポーターを備えたTet-Onシステムから生じる蛍光シグナルは、目的のプロモーターおよび使用される蛍光色素によって異なるが、我々は、mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmG動物を用いて所見をどのように分析したかを説明する。パルスチェイス後の成体脳の分析は、様々な解剖学的ニッチ全体にわたって膜GFP発現細胞をもたらした。様々な細胞型間の蛍光強度の違いに注意しなければならない。蛍...

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Lineage Tracing of Inducible Fluorescently-Labeled Stem Cells in the Adult Mouse Brain

誘導性トランスジェニック系統トレースマウス系統を用いて幹細胞およびその子孫を蛍光色素で恒久的にマーキングする能力は、 インビボでの活性化、増殖、遊走、および/または分化の空間的および時間的分析を可能にする。系統追跡は、系統のコミットメント、介入に対する応答、および多能性に関する新しい情報を明らかにすることができる。

成体マウス脳における誘導性蛍光標識幹細胞の系統追跡

A telomerase reverse transcriptase (Tert) lineage-tracing mouse line was developed to investigate the behavior and fate of adult tissue stem cells, by ...

幹細胞およびその子孫を誘導性トランスジェニック系統追跡マウス系統でマーキングすることにより、in vivoにおける脳内の成体幹細胞の活性化、増殖、遊走、および/または分化の空間的および時間的分析が可能になる。系統追跡は、系統のコミットメント、介入に対する応答、および多効力に関する新しい情報を明らかにすることができる。トランスジェニック系統追跡アプローチの利点には、特定の細胞系譜をトレースする特異性、細胞の代謝回転または分化に関係なく蛍光タンパク質の消去不能な発現、ドキシシリンの低毒性、条件付き活性化、および免疫染色および免疫蛍光を含む系統痕跡組織上の一般的な下流アッセイでの使いやすさが含まれる。成体脳における可塑性と細胞の広範な意味合いのために、成体幹細胞の特性評価と分析は、神経変性疾患の研究、脳の可塑性に対する代謝的影響、老化、およびその他の関連状態の情報を提供するのに役立ちます。開始するには、室温まで温め、氷冷アセトンで15分間固定後処理します。スライドを1Xすすぎ緩衝液中で5分間洗浄し、各工程の間に室温で毎分60回転で振とうする。核抗原を0.3%Triton X-100で室温で10分間静置するために透過処理する。0.3%Tween-20で細胞質抗原を室温で10分間静置するために透過させる。50~100ミリリットルの1x DAKO抗原検索液中のスライドを10分間、2回、低温で電子レンジで電子レンジで包み込み、抗原検索を行います。次に、緩衝液で室温で5分間リンスする。スライドを0.3%Typogen Black中の70%エタノール中で室温で20分間インキュベートし、その後すすぎ緩衝液で洗浄する。組織の周りに疎水性バリアを描きます。ブロッキング試薬で摂氏37度で20分間ブロックします。抗体希釈液で希釈した一次抗体と共に摂氏4度で一晩インキュベートした。スライドを室温で10分間洗浄する。翌日、切片をAlexa Fluor二次抗体中で室温で10分間インキュベートする。次いで、すすぎ緩衝液中でスライドを10分間2回洗浄する。AlexaFluor 488にコンジュゲートした1~500個の抗GFP抗体を100マイクロリットルで脳切片を覆い、摂氏4度で一晩インキュベートして内因性Fluor4を増強し、トレースされた細胞をマークします。翌日、すすぎ緩衝液で2回洗浄する。そして、流したDI水で5分間洗い流します。1ミリリットルあたり100ナノグラムの4'6-ジアミジノ-2-フェニルインドールを5分間カウンターシミで染色する。その後、流したDI水で5分間洗浄する。各組織セクションの上に蛍光安全マウント媒体を1滴加え、22ミリメートル×22ミリメートルのカバースリップでシールします。最適な信号を確保するために、取り付け当日にイメージングをお勧めします。心経灌流後の固定および切片化を開始するには、摂氏4度で一晩4%PFAで脳を固定する。そして再び室温で1時間。1x PBSで脳を室温で1時間2回洗浄する。矢状脳ブロックを使用して脳を厚さ1ミリメートルのセクションに切断し、1x PBSを含む5ミリリットルのマイクロ遠心管に入れます。メタノール前処理の場合は、室温で1時間2回、1x PBSで洗浄することから始めます。50%メタノール中で室温で1時間洗浄する。80%メタノールで室温で1時間洗浄する。100%メタノール中で室温で1時間、2回洗浄する。5%過酸化水素、20%ジメチルスルホキシド、メタノールを摂氏4度で一晩漂白します。漂白後、試料をメタノール中で1時間、室温で2回洗浄する。20%ジメチルスルホキシドとメタノール中で室温で1時間2回洗浄する。80%メタノールで室温で1時間洗浄する。50%メタノール中で室温で1時間洗浄する。PBSで1時間、室温で2回洗浄する。PBS 0.2%Triton X-100で室温で1時間2回洗浄します。クリアリング脳の免疫染色のために、オービタルシェーカー上で一晩摂氏37度で、1x PBS、0.2%Triton X-100、20%DMSO、0.3モルグリシン中でサンプルをインキュベートすることから始めます。1x PBS、0.2%Triton X-100、10%DMSO、6%ヤギ血清を摂氏37度で3日間、オービタルシェーカーでブロックします。ブタ粘膜からの1x PBS、0.2%Tween-20、1ミリリットルあたり10マイクログラムのヘパリンナトリウム塩でサンプルを摂氏37度で1時間2回洗浄する。次に、1x PBS、0.2%Tween-20、1ミリリットルあたり10マイクログラムのヘパリン、5%DMSO、3%ヤギ血清中で、1〜500濃度のウサギ抗GFP AlexaFluor 488を摂氏37度でオービタルシェーカー上で2日間インキュベートする。1x PBS、0.2%Tween-20、1ミリリットルあたり10マイクログラムのヘパリンでサンプルをオービタルシェーカーで摂氏37度で1時間、その後1日1回、2日間洗浄します。サンプルを1ミリリットルの50%テトラヒドロフランと水で一晩インキュベートします。1ミリリットルの80%THFテトラヒドロフランと水でサンプルを1時間インキュベートします。サンプルを100%テトラヒドロフラン中で1時間2回インキュベートします。滅菌ワイプでサンプルを乾燥させ、バイアルの底に沈むまでジクロロメタン中でインキュベートします。60分以上インキュベートしないでください。透明になるまで1ミリリットルのジベンジルエーテル中でサンプルをインキュベートする。サンプルを画像化する準備ができるまで室温でジベンジルエーテルに保存します。免疫染色された脳切片を画像化するには、複数の抗体の共発現が確認できる共焦点顕微鏡でスライドを分析します。私たちは、HyD Sハイブリッド検出器を備えたライカステラリス5顕微鏡を使用しています。クリアされた脳を画像化するには、自動ステージと自動タイリング機能を備えた倒立共焦点顕微鏡を使用します。まず、透明な脳のセクションをガラス底の皿に平らに置き、ジベンジルエーテルに浸します。異なる脳領域および様々な細胞型にわたる蛍光強度の顕著な差は、系統トレースされた脳におけるパルス追跡期間の後に観察された。脈絡叢内の脈絡膜上皮細胞は、厚い細胞膜と、周囲の細胞と容易に区別できるテルト陽性細胞に由来することを示す強い緑色蛍光シグナルを有していた。脈絡叢間質の他のより小さな細胞型は、より弱いGFPシグナルを有していた。小脳では、バーグマングリア細胞はバスケット細胞よりも高いレベルのGFPを発現し、GFP発現の変動も個々のバスケット細胞間で存在した。工場感覚ニューロンについては、嗅球の糸球体層内の軸索も高レベルのGFPを発現し、嗅球の糸球体層を満たす嗅覚ニューロン軸索は高レベルの膜トマトを発現し、または赤色蛍光は、同じニューロンがGFP陽性である場合でも他のほとんどの脳領域と比較すると、系統追跡中にいくつかの細胞がmTomatoシグナルをよりゆっくりと失うように見えたことを示す。対照的に、脈絡叢ではGFP陽性細胞は発現量が少なくmTomatoであった。他のほとんどの脳領域では、トマトシグナルはほとんどの細胞型で低レベルで発現し、内皮細胞は、蛍光シグナルが脳組織の赤色蛍光の背景からはっきりと目立つほど明るい唯一の細胞の一部です。覚えておくべき最も重要なことは、クリアされた脳内の蛍光シグナルは、他のほとんどの免疫アッセイよりも速く退色することです。サンプルは、できるだけ早く7日以内にイメージしてください。以下、脳スライスまたはクリアブレインのイメージング、GFPシグナルによるマーカーの色付け、およびFluorenceの定量化は、ソフトウェアプログラムを使用して行うことができます。

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay

ニューロスフェアのアッセイを使用して成体マウス神経幹細胞の単離と拡大

Isolation and expansion of the putative neural stem cells (NSCs) from the adult murine brain was first described by Reynolds and Weiss in 1992 employing a ...

Growing Neural Stem Cells from Conventional and Nonconventional Regions of the Adult Rodent Brain

大人の齧歯類の脳の従来の従来にない地域から神経幹細胞を増殖させる

Recent work demonstrates that central nervous system (CNS) regeneration and tumorigenesis involves populations of stem cells (SCs) resident within the ...

Electrophysiological Recording in the Brain of Intact Adult Zebrafish

無傷アダルトゼブラフィッシュの脳における電気生理学的記録

Previously, electrophysiological studies in adult zebrafish have been limited to slice preparations or to eye cup preparations and electrorentinogram ...

Assessing Cell Cycle Progression of Neural Stem and Progenitor Cells in the Mouse Developing Brain after Genotoxic Stress

神経幹細胞の細胞周期の進行を評価し、マウスでの前駆細胞は、遺伝毒性ストレス後の脳の開発

Neurons of the cerebral cortex are generated during brain development from different types of neural stem and progenitor cells (NSPC), which form a ...

Lineage-reprogramming of Pericyte-derived Cells of the Adult Human Brain into Induced Neurons

誘導された神経細胞への成人の脳の周皮細胞由来細胞の系統の再プログラミング

Direct lineage-reprogramming of non-neuronal cells into induced neurons (iNs) may provide insights into the molecular mechanisms underlying neurogenesis ...

Conditional Genetic Transsynaptic Tracing in the Embryonic Mouse Brain

マウス胎児の脳のトレース条件付き遺伝経シナプス

Anatomical path tracing is of pivotal importance to decipher the relationship between brain and behavior. Unraveling the formation of neural circuits ...

Laser-guided Neuronal Tracing In Brain Explants

脳の外植片にレーザー誘導神経トレース

We present a technique which combines an in vitro tracer injection protocol, which uses a series of electrical and pressure pulses to increase dye uptake ...

Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Mouse Subcallosal Zone

マウス梁下ゾーンから成体神経幹細胞の単離および培養

Adult neural stem cells (aNSCs) can be used for the regeneration of damaged brain tissue. NSCs have the potential for differentiation and proliferation ...

An In Vivo Blood-brain Barrier Permeability Assay in Mice Using Fluorescently Labeled Tracers

An In Vivo Blood-brain Barrier Permeability Assay in Mice Using Fluorescently Labeled Tracers

生体内で血液脳関門透過性アッセイを用いたマウス蛍光トレーサーに分類

Blood-brain barrier (BBB) is a specialized barrier that protects the brain microenvironment from toxins and pathogens in the circulation and maintains ...

Intra-Arterial Delivery of Neural Stem Cells to the Rat and Mouse Brain: Application to Cerebral Ischemia

ラットおよびマウス脳への神経幹細胞の動脈内デリバリー:脳虚血への応用

Neural stem cell (NSC) therapy is an emerging innovative treatment for stroke, traumatic brain injury and neurodegenerative disorders. As compared to ...