Name: lineage tracing of inducible fluorescently-labeled stem cells in the adult mouse brain
Uploaded: 2022-05-20T14:00:00
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저자들은 다이애나 칼론 박사 (보스턴 아동 병원, 하버드 의과 대학)와 매튜 린스 박사 (조슬린 당뇨병 센터; 메인 메디컬 센터 연구소) mTert-rtTA 동물을 활용한 안내를 위한 연구.

여기에 설명 된 모든 방법은 오하이오 주립 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)의 승인을 받았습니다.
1. 실험 코호트 마우스에 대한 Tet-On 마우스 라인, 번식 전략 및 유전자형 분석을 추적하는 계보 생성
참고: 여기에서는 Cre 재조합을 겪는 형광 리포터 유전자로서 Rosa-mTmG를 사용한 Tet-On 마우스 시스템의 생성에 대해 간략하게 설명하?...

     

생체 내에서 성체 마우스 뇌 내에서 줄기 세포를 마킹하는 삼중 트랜스제닉 계보 추적 마우스 라인의 생성, 활용 및 분석을 위한 방법이 기재되어 있다. 면역 염색 또는 뇌 제거와 결합하면 뇌를 가로 지르는 추적 된 형광 세포의 확인 및 특성화가 달성 될 수 있습니다. 이 기술은 표지 된 줄기 세포가 활성화, 이동, 분화 또는 증식 할 때 플라스틱 / 재생 / 리모델링 잠재력을 이해하는 기능을...

계보 추적 마우스 줄의 값 생체 내에서 줄기 세포의 분석은 이러한 세포를 검사하는 많은 분석이 동물의 죽음시에 이들 세포를 특성화하는 데에만 초점을 맞추기 때문에 어려울 수 있으며, 이는 시간에 따라 말단 스냅 샷을 나타냅니다. 선조, 중간/전이 세포 유형 및 시간이 지남에 따라 성숙한 세포의 증식, 분화 및 이동 과정을 더 잘 이해하려면 종단 분석 접근법이 필요합니다. 이것은 줄기 / 선조 세포가 지울 수 없게 표시되고1 이후 임의의 시간 동안 추적 될 수있는 혈통 추적 연구를 통해 달성 될 수 있습니다.
성인 포유류 뇌에서, 성인 태생 뉴런이 줄기 및 전구 세포로부터 생성되는 신경 생성 과정은 티미 딘-H3 2,3,4 또는 5-브로모-2'-데옥시우리딘(BrdU)5,6,7,8로 표지 보유를 통해 먼저 분석되었다. . 이 연구에서, 증식성 세포는 티민 유사체로 표시되었고, 이는 복제 및 세포 분열/증식 동안 세포의 DNA에 통합되었다. 따라서 표시된 세포와 자손은이 유사체를 포함했으며, 그 후 사후 확인되었습니다. 그러나 티미딘-H3와 BrdU는 줄기 세포가 제대로 이해되지 않은 뇌 영역에서 증식 세포와 그 자손의 표시를 허용했지만, 이러한 연구는 이러한 도구의 단점에 의해 방해 받았다. 티미딘-H3는 세포주기 정지, 아폽토시스 및 용량-의존적 DNA 합성 억제9를 유도하는 반면, BrdU는 투여 경로(10)에 따라 다양한 수준으로 세포를 표시하고, 수복 또는 아폽토시스 동안뿐만 아니라 세포 분열(11) 동안에도 세포에 의해 흡수된다. 최근 5-에티닐-2'-데옥시우리딘(EdU)을 사용한 라벨링과 같이 보다 효율적인 라벨링 방법이 활용되고 있지만, BrdU와 동일한 많은 문제들이 여전히12개로 남아 있다. 이러한 접근법은 또한 줄기 세포뿐만 아니라 모든 증식 세포를 표시한다는 점에서 제한적이며 따라서 결과의 해석은 혼란 스러울 수 있습니다. 신경 인성 혈통에서 모든 줄기와 전구 세포는 유사분열 능력을 유지하며 말단 / 성숙 뉴런 만 증식하지 않습니다. 성상세포 및 미세아교세포의 경우, 올리고덴드로세포는 아니지만, 증식은 무기한 유지된다(13,14,15).
우리가 여기에서 사용하는 성체 줄기 세포를 확인하기 위해 확인 된 것과 같이 관심있는 단백질을 발현하는 세포 만 혈통화하는 데 사용되는 형질전환 마우스는 줄기 세포와 그 자손을 조사 할 때 더 일반적이되었습니다. 마우스 트랜스제닉 접근법을 통해 생성하기가 어렵지만, 혈통-추적 마우스 라인은 뇌에서 특이적으로 표시된 세포의 추적을 허용하고, 증식에만 의존하지 않는다. Tet-On 트랜스제닉 마우스 시스템에서, 테트라사이클린 또는 독시사이클린(테트라사이클린 유도체)의 투여는 관심 있는 프로모터에 의해 전사되는 역테트라사이클린 트랜스활성화제(rtTA)로 조작된 세포에서 Cre-재조합효소 발현을 유도한다. 테트-유도성 Cre-구동 재조합은 이어서 채용된 로사-리포터 마우스에 따라 관심있는 세포에서 지울 수 없는 형광 또는 발광 단백질의 발현을 활성화시킬 것이다. 이러한 불가분하게 표시된 세포는 분열, 분화 또는 이동 후에도 이 리포터를 계속 발현하여, 시간이 지남에 따라 또는 상이한 개입 후에 이들 세포 및 그들의 자손의 추적을 허용한다(16). 형질전환 계보 추적 접근법의 장점은 1) rtTA로 표시된 특정 세포 계보 또는 전구/줄기 세포에 대한 추적의 특이성, 2) 세포 회전율 또는 분화에도 불구하고 형광 또는 발광 단백질의 지울 수 없는 발현, 3) 낮은 독성, 4) 동물의 수명주기의 어느 시점에서든 조건부 활성화, 5) 일반적인 분석으로 사용의 용이성, 면역염색/면역형광 포함16.
마우스에서 시간적으로 유도성 리포터 도구의 다른 방법에는 ROSA-GFP, ROSA-mTmG 또는 다른 형광 리포터 전이유전자와 짝을 이룰 수 있는 Cre-ERT2 마우스의 사용이 포함된다. 이들 동물에서, 관심 있는 프로모터 또는 인핸서 영역과 같은 세포 특이적 조절 요소는 타목시펜의 투여를 통해서만 활성화될 수 있는 Cre 재조합효소의 생산을 유도한다. Cre-ERT2 마우스 라인은 특정 세포주에서 Cre의 유도를 허용하지만, 성인 신경 발생에 대한 타목시펜의 효과를 자세히 설명하는 풍부한 지식이 있습니다17,18. 추가적으로, YFP 또는 CFP를 포함하여 GFP 또는 mTmG 대신에 활용될 수 있는 많은 ROSA 구동 형광 리포터 유전자가 존재하며, 이는 다른 형광 파장에서 대체 형광 표지를 허용할 것이다. 이들 형광 리포터 유전자는 Tet-On 또는 Cre-ERT2 시스템과 함께 사용될 수 있다.
텔로머라아제 역전사효소(TERT)는 홀로엔자임 텔로머라제의 속도 제한 성분으로, 세포 분열19,20 동안 텔로미어가 단축된 후 텔로미어를 연장시키는 작용을 한다. TERT는 장 21,22, 골수 21, 간 23, 지방24, 자궁내막 25,26, 및 골1에서 성체 조직 줄기 세포의 마커로서 확인되었다. 이들 성체 줄기세포에서의 TERT 발현이 텔로머라아제-연장 활성을 전적으로 위한 것인지 또는 비-정준 TERT 역할(27)을 수행하는지에 대한 것인지는 아직 알려지지 않았다. TERT 발현 정지 성체 줄기 세포 (qASCs)는 이러한 줄기 세포의 다능성 및 자기 재생 능력뿐만 아니라 활성화, 증식, 분화 및 이동 가능성을 연구하기 위해 트랜스제닉 혈통 추적 마우스로 몸 전체에서 확인되고 추적되었습니다 1,22,23,28. Tert-rtTA 전이유전자의 생성은 이전에1 수행되었다. 이 논문에서는 성인 마우스 뇌에서 새로운 ASC 집단으로 확인 한 TERT + qASC를 연구하기 위해 혈통 추적 TERT 마우스 라인을 사용하는 방법에 대해 설명합니다.
트랜스제닉 혈통 추적 마우스 라인의 생성 Tet-On 시스템을 사용하여 계보 추적 마우스 라인을 생성하려면 마우스 짝짓기를 통해 단일 동물 내에서 세 개의 전이유전자를 결합해야 합니다. 첫 번째는 관심 유전자의 프로모터의 제어하에 발현되는 rtTA입니다 (우리는 TERT-rtTA입니다). 이 관심 유전자를 발현하는 세포에서, rtTA는 따라서 발현될 것이다. 두 번째는 rtTA 융합 전사체와 테트라사이클린 또는 독시사이클린 둘 다의 존재하에서 Cre 재조합효소의 전사를 허용하는 테트라사이클린 반응 요소(TRE)를 함유하는 oTet-Cre 유전자이다. 테트라사이클린 또는 독시사이클린은 식수 또는 차우29를 통해 동물에게 투여될 수 있다. 마지막으로, Cre 재조합효소 절단에 의해 활성화될 유전자가 있어야 한다. 이 원고에서 우리가 설명 할 표지 유전자는 Rosa26-mTmG 유전자이며, Cre 재조합이 유비쿼터스 할 때까지 mTomato (모든 세포에서 막 적색 형광)를 전사합니다. 그러나, 세포가 rtTA 전사체를 발현하고 테트라사이클린 또는 독시사이클린을 함유하는 경우, mTomato와 mGFP 부위 사이의 일련의 lox P 부위의 Cre 재조합은 R26 부위를 변화시키고 세포가 막 토마토 대신에 막 EGFP(mGFP, 또는 막 녹색 형광)를 생성하게 할 것이다. 이 mGFP 신호의 지울 수없는 특성은 세포가 증식, 이동 및 분화 할 때 세포의 생체 내 표지 및 추적을 허용합니다. 추적에 따라, 세포는 표준 냉동 절편 또는 더 두꺼운 광학적으로 제거된 뇌에서 면역형광을 통해 GFP의 발현에 대해 분석될 수 있다.
이 백서에서는 특정 마우스 라인인 mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmG의 사용에 대해 설명합니다. 이 삼중 트랜스제닉 마우스 라인을 만들기 위해, 우리는 먼저 oTet-Cre 동물(잭슨 랩 균주 #006234)을 Rosa-mTmG 동물(잭슨 랩 균주 #007676)과 교배시켜 oTet-Cre::Rosa-mTmG 이중 트랜스제닉 마우스를 만들었습니다. 이들 동물은 보충표 1 및 2에 표시된 프라이머 및 PCR 주형으로 유전자형화되었다. mTert-rtTA 마우스(David Breault 1에 의해 생성됨)를 oTet-Cre::Rosa-mTmG 동물과 교배시켜 mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmG 마우스(도 1A)1,30를 생성하였다. mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmG 마우스 라인의 작용 메카니즘은 도 1B에 예시되어 있다.
독시사이클린 유도 및 펄스 체이스 설계 실험을 계획 할 때 독시사이클린 유도시 동물의 나이, 독시사이클린 투여 기간 ( "맥박"기간), 독시사이클린 제거 후 조직 수집 전 시간 ( "추적"기간) 및 이러한 과정 중 개입의시기를 포함하여 계보 추적 실험의 결과에 영향을 줄 수있는 몇 가지 요소를 고려하는 것이 중요합니다. 이러한 연구 설계 고려 사항은 실험이 끝날 때 표지 된 세포와 그 자손을 이해하는 데 필수적입니다. 이 과정의 첫 번째 단계는 동물의 관심 연령과 독시사이클린 투여 기간을 확인하는 것입니다. 더 긴 펄스 기간은 더 많은 세포가 발현되는 rtTA 결합 프로모터를 발현할 가능성이 있고 더 많은 관심있는 세포가 불가분의 표시될 가능성을 허용할 것이다. 관심 유전자의 일시적인 발현을 나타내는 세포 유형은 관심 유전자를 지속적으로 발현하는 세포보다 더 긴 맥박 기간을 필요로 할 수 있다. 그러나 연구의 목표가 관심있는 세포의 단기 효과 또는 급성 개입을 이해하는 것이라면 일단 세포가 표시되면 맥박 기간의 나머지 기간 동안 여러 가지 변화를 통해 추적되므로 맥박 기간이 너무 길어질 수 없습니다. 우리의 연구 중 일부에서, 추격 기간이없는 2 일간의 맥박은 TERT의 직접 기자를보다 밀접하게 모방하는 데 사용되었습니다. 이는 Rosa-mTmG 유전자의 재조합을 위한 최소 시간이 2일31일이기 때문이다.
맥박 체이스 실험의 다음 필수 기간은 독시사이클린의 제거와 동물의 관류 사이의 길이이며, 이는 '추격전'으로도 알려져 있습니다. 마우스에서 독시사이클린의 반감기는 투여 경로에 관계없이 약 170분이며, 이는 독시사이클린 유도가 제거32 후 몇 시간 후에 더 이상 발생하지 않을 가능성이 높다는 결론을 허용한다. 그러나, 독시사이클린 대사는 노화된 마우스에서 느리며, 이는 어린 동물(33)보다 더 긴 효과적인 '맥박' 기간을 초래할 수 있다는 점에 유의하는 것이 중요하다.
추격 기간 동안, 표지된 세포는 증식, 분화, 또는 이동 후에도 계속 표지될 것이다. 이들 세포의 자손도 또한 라벨링될 것이다. 이 연구의 목표는 펄스 체이스 패러다임의 길이를 형성 할 것입니다. 연구의 목표가 관심있는 세포와 함께 장기간에 걸친 조직의 재생을 이해하는 것이라면 긴 추격 기간이 필요할 수 있습니다. 마지막으로, 중재 또는 치료의시기가 결정되어야합니다. 펄스 기간 동안의 투여는 이 시간 동안 생성된 임의의 자손뿐만 아니라 관심있는 유전자를 발현하는 세포에 영향을 미칠 것이며, 반면에 추격 기간 동안의 투여는 주로 관심있는 세포의 자손에 영향을 미칠 수 있지만, 이것은 표지된 세포가 얼마나 빨리 분열하거나 분화하는지에 의존할 것이다. 우리가 활용한 펄스 체이스 실험 설계의 예는 그림 2A에 요약되어 있습니다.
또한 누출 발현으로 인한 배경 GFP 신호의 가능성을 인식하는 것이 중요합니다. 새는 발현은 독시사이클린의 부재 하에 rtTA와 오테트 서열 사이의 고유 결합 전위의 결과로서 발생하고, rtTA의 부재 하에서의 오테트 전이유전자의 잔류 활성의 결과로서 발생한다(도 34에서 검토됨). 누출 발현은 Tet 시스템의 하나의 약점을 나타내며, 누출이 종종 시스템에 수용가능한 단점이지만, 누출 발현이 Otet-DTA 동물에서 딥테리아 독소 (DTA)와 같은 독성 및 사망률을 초래할 수있는 상황은 이러한 시스템(35)의 사용을 제한 할 수 있습니다.
현미경 검사를위한 얇은 절편의 뇌 처리, 단면화 및 면역 형광 혈통 추적 실험 후 마우스의 뇌를 분석하려면 먼저 뇌에서 높은 자기 형광을 유발할 수있는 혈액과 CSF를 제거하기 위해 수심 관류를 통해 마우스를 관류해야합니다. 동물이 관류 될 수있는 두 가지 일반적으로 사용되는 고정제가 있습니다 : 조직 조직 고정제, 글리 옥살 고정 제 (GF) 또는 4 % 파라포름 알데히드 (PFA). 글리옥살 고정제는 PFA보다 가교결합이 적은 비교적 부드러운 고정 공정을 가능하게 한다. 이것은 조직 경직을 감소시키고, 항원 검색의 필요성을 감소시키며, 면역염색 동안 덜 농축된 항체 용액을 허용한다. 그러나, 메탄올을 함유할 경우 이는 자가형광(36)을 증가시키는 역할을 할 수 있다. 한편, PFA는 종종 보다 강력한 고정을 허용하며, 면역염색 중에 항원 검색이 필요하지만, PFA 고정 조직에서만 작동하는 항체가 존재하며, 후술하는 광학 클리어링 기술을 위해서는 4% PFA를 사용한 관류가 요구된다.
관류 후 관류 단계는 뇌가 하룻밤 사이에 관류 중에 사용되는 동일한 유형의 고정제에 잠기는 사후 고정 단계입니다. 이것은 관류 중에 완전히 고정되지 않았을 수도있는 뇌 영역이 계속 고정되도록합니다. 다음으로, 뇌는 조직 내 얼음 형성을 방지하기 위해 동결 단계 전에 가능한 한 많은 물을 제거하기 위해 인산염 완충 식염수 (PBS) 중의 수크로스에서 인큐베이션될 것이다 ("동결-보존"). 그런 다음 뇌는 처리를 위해 임의의 수의 시상, 코로나 또는 횡단 조직 절편으로 절단 될 수 있습니다. 정밀도와 재현성 모두를 위해, 보정된 뇌 블록은 동물 사이에서 일관된 브레그마 절단을 보장하는 방식으로 사용되어야 합니다. 뇌가 어떻게 단면화되는지에 영향을 줄 수있는 가장 중요한 요소는 관심있는 뇌 영역입니다. 예를 들어, 시상 절단은 한 조직 절편에서 더 많은 뇌 영역을 분석 할 수 있지만, 측심실의 측면 및 내측 측면이 그 차원에서 식별하기가 불가능하고 관상 평면에서 더 잘 관찰되기 때문에이 절단은 심실 - 심실 하부 영역 (V-SVZ)의 신경 / 교세포 형성 영역의 분석을 허용하지 않습니다. 이것은 성인 신경 생성 연구에서 중요한 구별이 될 수 있는데, 측심실의 측면 측에는 신경 인성 V-SVZ가 포함되어 있고 측심실의 내측 벽은 더 교세포 생성 틈새 시장입니다37.
조직이 관상식, 시상 또는 횡단 섹션으로 나뉘어지면 최적 냉각 온도 (OCT) 임베딩 용액을 사용하여 블록으로 얼어 붙습니다. 여기에서, 뇌는 드라이 아이스와 에탄올의 혼합물을 사용하여이 임베딩 물질 내에서 얼어 붙습니다. 얇은 단면 분석이 필요한 경우, 블록은 냉동 스탯 상에서 슬라이스되고, 요구되는 다운스트림 분석에 따라 양전하를 띤 유리 슬라이드를 얇은 단면(<20 μm)으로 부착할 수 있다. 충전되지 않은 유리 슬라이드도 사용될 수 있지만, 충전되지 않은 슬라이드의 사용은 조직이 슬라이드(38)로부터 막히지 않게 되는 결과를 초래할 수 있다. 중간 두께의 자유 부유 조직 절편 (>20 μm)이 필요한 경우, 조직은 자유 부유 섹션으로 수집됩니다. 두꺼운 섹션 (0.5-4 mm)이 필요한 경우, vibratome으로 얼지 않은 뇌 섹션을 슬라이스해야합니다. -20 ~ -80 °C에서 동결해야하는 슬라이드의 섹션과 4 ° C에서 저장되는 동결 부동 섹션 간의 저장 차이에 유의하는 것이 중요합니다.
뇌 제거 및 전체 마운트 면역 형광 공초점 현미경 검사 마우스 뇌에서 혈통 추적 세포에 대한 더 광범위하면서도 덜 상세한 분석이 필요한 경우, iDISCO 뇌 클리어링39 다음에 면역 염색 및 타일 z-스택 공초점 현미경 또는 광 시트 현미경 검사로 뇌 조직의 두꺼운 세그먼트에 대한 포괄적 인 분석이 가능합니다. 여기서, 마우스 뇌의 큰 절편은 광학적으로 제거될 것이고(탈형화 과정(39)), 이는 1mm 조직 절편에 걸쳐 형광 신호 이미징을 더 잘 허용한다. 이 과정의 단점은 높은 자기 형광과 세포 형태학의 고해상도 이미지를 얻는 능력이 감소하고 더 전통적인 방법 (얇은 냉동 절편 또는 자유 부유 섹션)과 비교할 때 필요한 작업 거리가 증가했기 때문에 상세한 공동 염색 분석입니다. 이러한 이유로, 우리는 개별 세포를 특성화하거나 분석하려고 시도하는 대신 여러 뇌 영역에서 대규모 혈통 추적 결과를 분석하기 위해 뇌 지우기를 권장합니다.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>Antibody diluent</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>S080983-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antigen Retrieval Solution</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>S2367</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-GFP antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A2311</td>
			<td>Use at 1:500-1:000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A18-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B6.Cg-Tg(tet0-cre)1Jaw/J</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>JAX:006234</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B6.129(Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo/J</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>JAX:007676</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blocking Solution (IHC)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>20773</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blunt needle</td>
			<td>BSTEAN</td>
			<td>X0012SYHIV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coronal brain block</td>
			<td>Braintree</td>
			<td>BS-2000C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover slip</td>
			<td>Corning</td>
			<td>2850-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat</td>
			<td>Leica</td>
			<td>CM1900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D564</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dibenzyl ether</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>33630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichloromethane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>270997</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey Serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9663</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Doxycycline Hyclate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9891</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0718</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin Sodium Salt from Porcine Mucosa</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histochoice Molecular Biology Tissue Fixative</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>H120</td>
			<td>This product has since been discontinued, but can be replaced with Glyo-Fixx (Thermo Scientific, 6764265)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen Peroxide Solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>516813</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IHC Select TBS Rinse Buffer</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>20845</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine</td>
			<td>Westward</td>
			<td>0143-95095-10</td>
			<td>This product requires a DEA license for storage and use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A452-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Slides</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milipore Block</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>20773</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting medium</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>5013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optimal Cutting Temperature Solution</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS Solution (10X)</td>
			<td>Teknova</td>
			<td>P0496</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sagittal brain block</td>
			<td>Braintree</td>
			<td>RBM-2000S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saline</td>
			<td>Braun</td>
			<td>S8004-5264</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sudan (Typogen) Black</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>199664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetrahydrofuran</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>186562</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue cartridge</td>
			<td>Simport</td>
			<td>M512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>655205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>AnaSed</td>
			<td>sc-362950Rx</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

lineage tracing of inducible fluorescently-labeled stem cells in the adult mouse brain

텔로머라아제 역전사효소(Tert) 계보-추적 마우스 라인은 성체조직 줄기세포의 거동과 운명을 조사하기 위해 개발되었으며, 'Tet-On' 시스템 oTet-Cre 마우스와 Tert 프로모터에 연결된 신규한 역테트라사이클린 트랜스액티베이터(rtTA) 전이유전자를 교차시킴으로써, 이는 성체 뇌 줄기세포의 새로운 집단을 표시함을 입증하였다. 여기서, 테트라사이클린 유도체 독시사이클린을 mTert-rtTA::oTet-Cre 마우스에 투여하면 Tert 유전자의 프로모터 영역의 4.4 kb 단편을 발현하는 세포 집단을 불가분하게 표시할 것이다. Rosa-mTmG 리포터를 조합하면, mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmG 마우스는 독시사이클린 처리가 mTomato 발현의 대체를 유도할 때까지 막 tdTomato(mTomato)를 발현할 것이고, 또한 Tert를 발현하는 세포에서 막 EGFP(mGFP)로 대체한다. 따라서, 이들 삼중-트랜스제닉 혈통 추적 마우스가 독시사이클린(TERT 발현 세포가 마크되는 "펄스" 기간)을 수신하면, 이들 세포는 불가분하게 마크된 mGFP+ 세포가 될 것이며, 이는 해독사이클린 제거 후 임의의 바람직한 시간 동안("추격" 기간) 동안 추적될 수 있으며, 이는 Tert 발현이 후속적으로 소실되더라도. 그런 다음 뇌는 줄기 세포 활성화, 증식, 혈통 투입, 다양한 뇌 틈새 시장으로의 이동 및 성숙한 세포 유형으로의 분화에 대한 변화를 해석하기 위해 면역 형광 및 기타 하류 응용 프로그램을 위해 관류 고정 및 처리됩니다. 이 시스템을 사용하여, 임의의 rtTA 마우스를 oTet-Cre 및 Rosa 리포터에 교배시켜 줄기 세포의 마커를 사용하여 독시사이클린-유도성 "펄스-체이스" 계보 추적 실험을 수행할 수 있다.

형광 리포터가 있는 Tet-On 시스템에서 발생하는 형광 신호는 관심 있는 프로모터 및 사용된 형광단에 따라 달라지지만, mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmG 동물로 결과를 분석한 방법을 설명합니다. 펄스 체이스 후 성인 뇌의 분석은 다양한 해부학 적 틈새 시장에 걸쳐 GFP 발현 세포를 막으로 만들었습니다. 다양한 세포 유형 간의 형광 강도의 차이에 유의해야합니다. 형광 강도에 관한 한 가지 변수는 세포막...

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Lineage Tracing of Inducible Fluorescently-Labeled Stem Cells in the Adult Mouse Brain

유도성 트랜스제닉 계보 추적 마우스 라인을 사용하여 줄기 세포 및 그의 자손을 형광단으로 영구적으로 표시하는 능력은 생체내에서 활성화, 증식, 이동 및/또는 분화의 공간적 및 시간적 분석을 가능하게 한다. 계보 추적은 혈통 헌신, 개입에 대한 반응 및 다능성에 대한 새로운 정보를 나타낼 수 있습니다.

성인 마우스 뇌에서 유도성 형광 표지 줄기 세포의 계보 추적

A telomerase reverse transcriptase (Tert) lineage-tracing mouse line was developed to investigate the behavior and fate of adult tissue stem cells, by ...

유도성 트랜스제닉 계보 추적 마우스 라인으로 줄기 세포 및 그 자손을 마킹하는 것은 생체내에서 뇌에서 성체 줄기 세포의 활성화, 증식, 이동 및/또는 분화에 대한 공간적 및 시간적 분석을 가능하게 한다. 계보 추적은 계보 헌신, 개입에 대한 반응 및 다중 효능에 대한 새로운 정보를 나타낼 수 있습니다. 트랜스제닉 계보 추적 접근법의 장점은 특정 세포 계보 추적의 특이성, 세포 회전율 또는 분화에 관계없이 형광 단백질의 지울 수 없는 발현, 독시실린의 낮은 독성, 조건부 활성화, 및 면역염색 및 면역형광을 포함하는 혈통 미량 조직에 대한 일반적인 하류 분석과 함께 사용의 용이성을 포함한다.성인 뇌의 가소성과 세포의 광범위한 함의로 인해 성체 줄기 세포의 특성화 및 분석은 신경 퇴행성 질환, 뇌 가소성에 대한 대사 영향, 노화 및 기타 관련 조건에 대한 연구를 알리는 데 도움이됩니다. 시작하려면 슬라이드를 실온으로 따뜻하게하고 얼음처럼 차가운 아세톤으로 15 분 동안 고정하십시오. 슬라이드를 1X 헹굼 버퍼에서 5분 동안 세척하고, 각 단계 사이의 실온에서 분당 60회 회전으로 진탕한다.핵 항원을 실온에서 10분 동안 0.3%Triton X-100으로 방치하여 투과시킨다. 세포질 항원을 0.3%Tween-20으로 실온에서 10분 동안 방치하여 투과시킨다. 1x DAKO 항원 검색 용액의 50 내지 100 밀리리터에서 10분 동안 마이크로웨이빙 슬라이드를 10분 동안 두 번 미세 흔들어서 항원 검색을 수행한다.다음으로, 실온에서 다섯 분 동안 완충액으로 헹구십시오. 실온에서 20분 동안 70%에탄올 중의 0.3%Typogen Black에서 슬라이드를 인큐베이션한 다음, 헹굼 완충액으로 세척한다. 조직 주위에 소수성 장벽을 그립니다.차단 시약으로 섭씨 37도에서 20 분 동안 차단하십시오. 항체 희석액에 희석된 일차 항체와 함께 섭씨 네 도에서 하룻밤 동안 인큐베이션한다. 실온에서 10 분 동안 슬라이드를 씻으십시오.다음날, 알렉사 플루오르 이차 항체의 절편을 실온에서 10분 동안 인큐베이션한다. 그런 다음 슬라이드를 10 분 동안 헹굼 완충액에서 두 번 씻으십시오. AlexaFluor 488에 컨쥬게이트된 1 내지 500개의 항-GFP 항체의 100 마이크로리터로 뇌 절편을 표지하고, 섭씨 4도에서 밤새 인큐베이션하여 내인성 Fluor4를 부스트하여, 추적된 세포를 표시한다.다음날 헹굼 버퍼로 두 번 씻으십시오. 그런 다음 실행 중인 DI 물에서 다섯 분 동안 세척한다. 밀리리터 당 100 나노그램의 4'6-디아미디노-2-페닐인돌로 5분 동안 카운터염색한다.그런 다음 실행 DI 물에서 다섯 분 동안 씻으십시오. 각 조직 섹션 위에 형광 안전 장착 매체 한 방울을 추가하고 22mm x 22mm 커버슬립으로 밀봉합니다. 최적의 신호를 보장하기 위해 장착 당일에 이미징을 권장합니다.섭씨 4도에서 하룻밤 사이에 4 % PFA에서 심질 관류 후 뇌를 고정시키고 절편화하기 시작합니다. 그리고 다시 실온에서 한 시간 동안. 실온에서 두 번 1x PBS로 한 시간 동안 뇌를 세척하십시오.시상 뇌 블록을 사용하여 뇌를 1 밀리미터 두께의 섹션으로 자르고 1x PBS가 들어있는 다섯 밀리리터 마이크로 원심 분리 튜브에 넣으십시오. 메탄올 전처리를 위해, 실온에서 1시간 동안 1x PBS로 두 번 세척하여 시작한다. 실온에서 한 시간 동안 50 % 메탄올로 씻으십시오.실온에서 한 시간 동안 80 % 메탄올로 씻으십시오. 실온에서 한 시간, 두 번 100 % 메탄올로 씻으십시오. 표백제 샘플은 20% 디메틸설폭사이드와 메탄올 중 5% 과산화수소를 섭씨 네 도에서 밤새 처리한다.표백 후, 실온에서 두 번 메탄올로 샘플을 한 시간 동안 세척한다. 실온에서 한 시간 동안 20 % 디메틸 설폭사이드와 메탄올로 두 번 씻으십시오. 실온에서 한 시간 동안 80 % 메탄올로 씻으십시오.실온에서 한 시간 동안 50 % 메탄올로 씻으십시오. 실온에서 한 시간 동안 PBS로 두 번 세척한다. PBS 0.2%Triton X-100으로 실온에서 1시간 2회 세척한다.뇌를 맑게 하는 면역염색을 위해, 샘플을 오비탈 진탕기에서 밤새 섭씨 37도에서 1x PBS, 0.2%Triton X-100, 20%DMSO, 0.3몰 글리신으로 인큐베이션하여 시작하십시오. 1x PBS, 0.2%Triton X-100, 10%DMSO, 6%염소 혈청을 섭씨 37도에서 오비탈 쉐이커에서 3일 동안 차단한다. 샘플을 1x PBS, 0.2 % Tween-20, 10 마이크로 그램 / 밀리리터 헤파린 나트륨 염으로 섭씨 37도에서 1 시간 동안 두 번 씻으십시오.다음에, 1x PBS, 0.2%Tween-20, 밀리리터 당 10 마이크로그램의 헤파린, 5%DMSO, 3%염소 혈청을 함유하는 1 내지 500 농도의 토끼 항GFP 알렉사플루오르 488을 섭씨 37도에서 2일 동안 안비진탕기에서 인큐베이션한다. 샘플을 1x PBS, 0.2%Tween-20에서 밀리리터 헤파린 당 10마이크로그램으로 오비탈 쉐이커에서 섭씨 37도에서 1시간 동안 세척한 다음 이틀 동안 하루에 한 번 세척합니다. 샘플을 50% 테트라하이드로퓨란과 물의 한 밀리리터에서 하룻밤 동안 배양한다.샘플을 80%THF 테트라하이드로퓨란과 물의 한 밀리리터에서 한 시간 동안 인큐베이션한다. 샘플을 100% 테트라하이드로퓨란에서 한 시간 동안 두 번 인큐베이션한다. 멸균 닦아내기로 샘플을 건조시키고 바이알 바닥에 가라 앉을 때까지 디클로로메탄에서 배양하십시오.60 분 이상 배양하지 마십시오. 샘플이 맑아질 때까지 한 밀리리터의 디벤질 에테르에서 인큐베이션한다. 이미지를 준비할 때까지 실온에서 디벤질 에테르에 샘플을 보관하십시오.면역염색된 뇌 절편을 이미지화하려면 여러 항체의 동시 발현을 확인할 수 있는 공초점 현미경을 통해 슬라이드를 분석합니다. 우리는 라이카 스텔라리스 다섯 현미경을 HyD S 하이브리드 검출기와 함께 사용합니다. 맑은 뇌를 이미지화하려면 자동화 된 단계와 자동화 된 타일링 기능이있는 거꾸로 된 공초점 현미경을 사용하십시오.먼저 디벤질 에테르에 잠겨있는 유리 바닥 접시에 평평한 뇌 섹션을 놓으십시오. 상이한 뇌 영역과 다양한 세포 유형에 걸친 형광 강도의 현저한 차이가 혈통 추적 뇌에서 펄스 추격 기간 이후에 관찰되었다. 맥락막 신경총에서 맥락막 상피 세포는 두꺼운 세포막과 강한 녹색 형광 신호를 가졌는데, 이는 주변 세포와 쉽게 구별할 수 있는 Tert 양성 세포로부터 유래되었음을 나타낸다.맥락막 신경총에서 다른 더 작은 세포 유형은 더 약한 GFP 신호를 가졌다. 소뇌에서, 베르그만 신경교 세포는 바스켓 세포보다 더 높은 수준의 GFP를 발현했고, GFP 발현의 변화는 또한 개별 바스켓 세포 사이에 존재했다. 공장 감각 뉴런 축색돌기의 경우 후각전구의 사구체층 내에서도 높은 수준의 GFP 후각구근의 사구체층을 채우는 감각신경색돌기를 발현하여 토마토막을 높은 수준으로 발현하거나, 대부분의 다른 뇌 영역과 비교했을 때 적색 형광이 동일한 뉴런이 GFP 양성인 경우에도 일부 세포가 계보 추적 중에 mTomato 신호를 더 느리게 잃는 것으로 나타났음을 나타낸다.대조적으로, 맥락막 신경총에서 GFP 양성 세포는 낮은 mTomato를 발현하였다. 대부분의 다른 뇌 영역에서, 토마토 신호는 대부분의 세포 유형에서 낮은 수준으로 발현되며, 내피 세포는 뇌 조직의 적색 형광 배경에서 뚜렷하게 눈에 띄기에 충분히 밝은 형광 신호가 유일한 세포 중 일부입니다. 기억해야 할 가장 중요한 것은 맑은 뇌의 형광 신호가 대부분의 다른 면역 분석법보다 빨리 퇴색한다는 것입니다.가능한 한 빨리 그리고 칠일 이내에 샘플을 이미지화하는 것을 잊지 마십시오. 다음으로, 뇌 조각 또는 맑은 뇌의 이미징, GFP 신호로 마커의 착색 및 불소의 정량화는 소프트웨어 프로그램을 사용하여 수행 할 수 있습니다.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay

절연 및 Neurosphere 어세를 사용하여 성인 마우스 신경 줄기 세포의 확장

Isolation and expansion of the putative neural stem cells (NSCs) from the adult murine brain was first described by Reynolds and Weiss in 1992 employing a ...

연구

신경과학

Growing Neural Stem Cells from Conventional and Nonconventional Regions of the Adult Rodent Brain

성인 쥐의 뇌의 기존 및 비 인습적 인 지역에서 신경 줄기 세포 성장

Recent work demonstrates that central nervous system (CNS) regeneration and tumorigenesis involves populations of stem cells (SCs) resident within the ...

Electrophysiological Recording in the Brain of Intact Adult Zebrafish

온전한 성인 Zebrafish의의 뇌에 전기 생리학 기록

Previously, electrophysiological studies in adult zebrafish have been limited to slice preparations or to eye cup preparations and electrorentinogram ...

Assessing Cell Cycle Progression of Neural Stem and Progenitor Cells in the Mouse Developing Brain after Genotoxic Stress

유전자 독성 스트레스 후 신경 줄기 및 마우스 두뇌 개발의 전구 세포의 사정 세포주기의 진행 상황

Neurons of the cerebral cortex are generated during brain development from different types of neural stem and progenitor cells (NSPC), which form a ...

Lineage-reprogramming of Pericyte-derived Cells of the Adult Human Brain into Induced Neurons

유도 된 신경 세포로 성숙한 인간 두뇌의 혈관 주위 세포에서 파생 된 세포의 리니지 - 프로그래밍

Direct lineage-reprogramming of non-neuronal cells into induced neurons (iNs) may provide insights into the molecular mechanisms underlying neurogenesis ...

Conditional Genetic Transsynaptic Tracing in the Embryonic Mouse Brain

배아 마우스의 뇌에 추적 조건부 유전 Transsynaptic

Anatomical path tracing is of pivotal importance to decipher the relationship between brain and behavior. Unraveling the formation of neural circuits ...

Laser-guided Neuronal Tracing In Brain Explants

레이저 유도 신경 세포의 추적에서 뇌 외식

We present a technique which combines an in vitro tracer injection protocol, which uses a series of electrical and pressure pulses to increase dye uptake ...

Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Mouse Subcallosal Zone

마우스 뇌량 밑 영역에서의 분리 및 성인 신경 줄기 세포의 문화

Adult neural stem cells (aNSCs) can be used for the regeneration of damaged brain tissue. NSCs have the potential for differentiation and proliferation ...

An In Vivo Blood-brain Barrier Permeability Assay in Mice Using Fluorescently Labeled Tracers

An In Vivo Blood-brain Barrier Permeability Assay in Mice Using Fluorescently Labeled Tracers

Vivo에서 혈액-뇌 장벽 침투성 분석 결과 사용 하 여 마우스에 붙일 추적기 표시

Blood-brain barrier (BBB) is a specialized barrier that protects the brain microenvironment from toxins and pathogens in the circulation and maintains ...

Intra-Arterial Delivery of Neural Stem Cells to the Rat and Mouse Brain: Application to Cerebral Ischemia

쥐와 마우스 두뇌에 신경 줄기 세포의 동맥 내 납품: 대뇌 허혈에 응용 프로그램

Neural stem cell (NSC) therapy is an emerging innovative treatment for stroke, traumatic brain injury and neurodegenerative disorders. As compared to ...