Name: lineage tracing of inducible fluorescently-labeled stem cells in the adult mouse brain
Uploaded: 2022-05-20T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Lineage Tracing of Inducible Fluorescently-Labeled Stem Cells in the Adult Mouse Brain at JoVE.com

Forfatterne ønsker å takke Dr. Diana Carlone (Boston Children's Hospital, Harvard Medical School) og Dr. Matthew Lynes (Joslin Diabetes Center; Maine Medical Center Research Institute) for veiledning ved bruk av mTert-rtTA dyr.

Alle metodene beskrevet her er godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) ved Ohio State University.
1. Opprettelse av en avstamning som sporer Tet-On-muselinje, avlsstrategier og genotyping for eksperimentelle kohortmus
MERK: Her skisserer vi opprettelsen av et Tet-On-musesystem med Rosa-mTmG som det fluorescerende reportergenet som gjennomgår Cre-rekombinasjon, men forskjellige andre Cre-rekombinasjonsdrevne reporterlinjer kan ...

     

En metode for opprettelse, utnyttelse og analyse av en trippel transgen linjesporing muselinje som markerer stamceller i den voksne musehjernen in vivo er beskrevet. Når det kombineres med immunostaining eller hjernerydding, kan identifisering og karakterisering av sporede fluorescerende celler over hele hjernen oppnås. Denne teknikken gir muligheten til å forstå plastikk / regenerativ / remodeling potensial av merkede stamceller som de aktiverer, migrere, differensiere, eller spre seg. Mens tidligere data o...

Verdien av en linjesporingsmuselinje Analyse av stamceller in vivo kan være vanskelig siden mange analyser som undersøker slike celler bare fokuserer på å karakterisere disse cellene på tidspunktet for dyrets død, som representerer et terminalt øyeblikksbilde i tid. For bedre å forstå prosessene for proliferasjon, differensiering og migrasjon av stamfar, mellomliggende / overgangscelletyper og modne celler over tid, er det nødvendig med en langsgående analysetilnærming. Dette kan oppnås med avstamningssporingsstudier der stam-/stamceller merkes uutslettelig og kan følges i lengre tid etterpå1.
I den voksne pattedyrhjernen ble prosessen med nevrogenese der voksenfødte nevroner opprettes fra stam- og stamceller først analysert via etikettretensjon med tymidin-H3 2,3,4 eller 5-bromo-2'-deoksyuridin (BrdU)5,6,7,8 . I disse studiene ble proliferative celler merket med tyminanalogen, som ble inkorporert i cellenes DNA under replikasjon og celledeling / proliferasjon. Den merkede cellen, så vel som deres avkom, inneholdt derfor denne analogen, som deretter ble identifisert post mortem. Men mens tymidin-H3 og BrdU tillot merking av proliferative celler og deres avkom i hjernegrupper der stamceller var dårlig forstått, ble disse studiene hindret av ulempene ved disse verktøyene. Tymidin-H3 induserer cellesyklusarrest, apoptose og doseavhengig DNA-syntesehemming9, mens BrdU markerer celler i varierende nivåer avhengig av administrasjonsveien10 og tas opp av celler under reparasjon eller apoptose, samt under celledeling11. Mer effektive merkingsmetoder har blitt brukt nylig, for eksempel merking med 5-ethynyl-2'-deoksyuridin (EdU), men mange av de samme problemene som BrdU forblir fortsatt12. Disse tilnærmingene er også begrensende ved at de markerer enhver proliferativ celle, ikke bare stamceller, og dermed kan tolkning av resultatene bli forvirret. I den nevrogene linjen beholder alle stam- og stamceller mitotisk kapasitet, og bare terminale / modne nevroner er ikke proliferative. For astrocytter og mikroglia, men ikke oligodendrocytter, opprettholdes proliferasjon på ubestemt tid 13,14,15.
Transgene mus som brukes til å avstamme spor bare celler som uttrykker et protein av interesse, for eksempel en bekreftet for å identifisere voksne stamceller som vi bruker her, har derfor blitt vanligere når man undersøker stamceller og deres avkom. Selv om det er vanskelig å generere gjennom musetransgene tilnærminger, tillater avstamningssporing av muselinjer sporing av spesifikt merkede celler i hjernen, og er ikke avhengig av spredning alene. I Tet-On-transgent musesystem induserer administrering av tetracyklin eller doksycyklin (et tetracyklinderivat) Cre-recombinase-ekspresjon i celler som er konstruert med en omvendt tetracyklintransaktivator (rtTA), som transkriberes av en promotor av interesse. Den Tet-induserbare Cre-drevne rekombinasjonen vil da aktivere uttrykket av et uutslettelig fluorescerende eller luminescerende protein i cellene av interesse, avhengig av Rosa-reportermusen som brukes. Disse uutslettelig merkede cellene fortsetter å uttrykke denne reporteren etter deling, differensiering eller migrasjon, slik at sporing av disse cellene og deres avkom over tid eller etter forskjellige inngrep16. Fordeler med transgene avstamningssporingsmetoder inkluderer: 1) spesifisitet ved sporing til en bestemt cellelinje eller stamcelle /stamcelle markert med rtTA, 2) uutslettelig uttrykk for fluorescerende eller selvlysende protein til tross for celleomsetning eller differensiering, 3) lav toksisitet, 4) betinget aktivering under ethvert punkt i dyrets livssyklus, og 5) brukervennlighet med vanlige analyser, inkludert immunostaining/immunfluorescens16.
Andre metoder for tidsmessig induserbare reporterverktøy hos mus inkluderer bruk av Cre-ERT2 mus, som kan parres med ROSA-GFP, ROSA-mTmG eller andre fluorescerende reportertransgener. I disse dyrene driver et cellespesifikt reguleringselement, for eksempel en promotor eller forsterkerregion av interesse, produksjonen av Cre recombinase, som bare kan aktiveres ved administrering av tamoxifen. Mens Cre-ERT2 muselinjer tillater induksjon av Cre i spesifikke cellelinjer, er det et vell av kunnskap som beskriver effekten av tamoxifen på voksen neurogenese17,18. I tillegg eksisterer det mange ROSA-drevne fluorescerende reportergener som kan brukes i stedet for GFP eller mTmG, inkludert YFP eller CFP, noe som vil tillate alternativ fluorescerende merking i andre fluorescerende bølgelengder. Disse fluorescerende reportergenene kan brukes med Tet-On- eller Cre-ERT2-systemer.
Telomerase reverstranskriptase (TERT) er den hastighetsbegrensende komponenten i holoenzym telomerase, som arbeider for å utvide telomerer etter at de er forkortet under celledeling19,20. TERT har blitt identifisert som en markør for voksne vevsstamceller i tarmen21,22, benmarg21, lever23, fett24, endometrium25,26 og bein 1. Hvorvidt TERT-uttrykk i disse voksne stamcellene utelukkende er for telomeraseforlengende aktivitet eller for å utføre ikke-kanoniske TERT-roller27, er fortsatt ukjent. TERT-uttrykkende hvilende voksne stamceller (qASCs) har blitt identifisert og sporet gjennom hele kroppen med transgene avstamningssporingsmus for å studere multipotensen og selvfornyelsesevnen til disse stamcellene, samt deres potensial til å aktivere, spre, differensiere og migrere 1,22,23,28. Opprettelsen av Tert-rtTA-transgenet har blitt utført tidligere1. I dette papiret vil vi beskrive bruken av en avstamningssporing TERT-muselinje for å studere TERT + qASCs som vi har identifisert som en ny ASC-populasjon i den voksne musehjernen.
Generering av en transgen avstamningssporingsmuselinje For å generere en avstamningssporingsmuselinje ved hjelp av Tet-On-systemet, må tre transgener kombineres i et enkelt dyr gjennom museparring. Den første er en rtTA, uttrykt under kontroll av promotoren av genet av interesse (vår er TERT-rtTA). I en celle som uttrykker dette genet av interesse, vil rtTA derfor bli uttrykt. Det andre er et oTet-Cre-gen, som inneholder et tetracyklinresponselement (TRE) som vil tillate transkripsjon av Cre recombinase i nærvær av både et rtTA-fusjonstransskript og tetracyklin eller doksycyklin. Tetracyklin eller doksycyklin kan administreres til et dyr via drikkevann eller chow29. Til slutt må det være et gen som vil bli aktivert av Cre recombinase cleavage. I dette manuskriptet er merkingsgenet vi vil beskrive Rosa26-mTmG-genet, som frem til Cre-rekombinasjon allestedsnærværende vil transkribere mTomato (membranrød fluorescens i alle celler). Men hvis en celle uttrykker rtTA-transkripsjonen og inneholder tetracyklin eller doksycyklin, vil Cre-rekombinasjon av et sett med lox P-steder mellom mTomato- og mGFP-stedene endre R26-stedet og føre til at cellen produserer membran EGFP (mGFP eller membrangrønn fluorescens) i stedet for membrantomat. Den uutslettelige naturen til dette mGFP-signalet vil tillate in vivo-merking og sporing av celler når de sprer seg, migrerer og differensierer. Etter sporet kan celler analyseres for ekspresjon av GFP via immunfluorescens i standard kryoseksjoner eller tykkere optisk ryddede hjerner.
I denne artikkelen vil vi beskrive bruken av den spesifikke muselinjen, mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmG. For å lage denne trippel transgene muselinjen parret vi først oTet-Cre-dyr (Jackson Lab-stammen #006234) til Rosa-mTmG-dyr (Jackson Lab-stammen #007676) for å lage oTet-Cre::Rosa-mTmG dobbelttransgene mus. Disse dyrene ble genotypet med primere og PCR-maler angitt i tilleggstabell 1 og 2. mTert-rtTA mus (skapt av David Breault1) ble parret med oTet-Cre::Rosa-mTmG dyr for å lage mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmG mus (Figur 1A)1,30. Virkningsmekanismen til mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmG-muselinjen er illustrert i figur 1B.
Doxycyklin-induksjon og pulsjaktdesign Når du planlegger eksperimenter, er det viktig å vurdere flere faktorer som vil påvirke utfallet av avstamningssporingseksperimenter, inkludert dyrets alder ved doksycyklininduksjon, lengden på doksycyklinadministrasjon ("puls" -perioden), lengden på tiden etter fjerning av doksycyklin før vevsinnsamling ("jakt" -perioden) og tidspunktet for eventuelle inngrep under disse prosessene. Disse studiedesignhensynene er avgjørende for å forstå de merkede cellene og deres avkom ved avslutningen av eksperimentet. Det første trinnet i prosessen er å identifisere dyrets alder av interesse og lengden på doxycyklinadministrasjonen. Lengre pulsperioder vil gjøre det mulig for flere celler å uttrykke den rtTA-koblede promotoren å bli uttrykt og flere celler av interesse for å bli uutslettelig merket. En celletype som utviser forbigående uttrykk for genet av interesse, kan kreve en lengre pulsperiode enn celler som kontinuerlig uttrykker genet av interesse. Men hvis målet med studien er å forstå kortsiktige effekter av cellen av interesse eller et akutt inngrep, kan pulsperioden ikke være for lang, da når en celle er merket, vil den spores gjennom en rekke endringer i løpet av resten av pulsperioden. I noen av våre studier ble en 2 dagers puls uten jaktperiode brukt til å etterligne en direktereporter for TERT. Dette skyldes at minimumstiden for rekombinasjon av Rosa-mTmG-genet er 2 dager31.
Den neste viktige perioden i et pulsjakteksperiment er lengden mellom fjerning av doksycyklin og perfusjon av dyret, også kjent som "jakten". Halveringstiden for doksysyklin hos mus er ca. 170 minutter uavhengig av administrasjonsvei, noe som gjør det mulig å konkludere med at doksysyklininduksjon sannsynligvis ikke lenger forekommer flere timer etter fjerning32. Det er imidlertid viktig å merke seg at doksysyklinmetabolismen er langsommere hos eldre mus, noe som kan føre til lengre effektive pulsperioder enn unge dyr33.
I løpet av jaktperioden vil merkede celler fortsette å bli merket, selv etter spredning, differensiering eller migrasjon. Avkommet til disse cellene vil også bli merket. Målet med studien vil forme lengden på pulsjaktparadigmet. Hvis målet med studien er å forstå regenerering av et vev over lang tid med cellene av interesse, kan det være nødvendig med en lang jaktperiode. Til slutt må tidspunktet for eventuelle inngrep eller behandlinger avgjøres. Administrasjon i pulsperioden vil påvirke cellene som uttrykker genet av interesse, så vel som ethvert avkom opprettet i løpet av denne tiden, mens administrasjon i jaktperioden kan påvirke for det meste avkom av cellene av interesse, selv om dette vil avhenge av hvor raskt de merkede cellene deler seg eller differensierer. Eksempler på pulsjakt eksperimentelle design vi har benyttet er skissert i figur 2A.
Det er også viktig å være klar over muligheten for GFP-signal i bakgrunnen på grunn av lekkende uttrykk. Lekkende ekspresjon oppstår som et resultat av iboende bindingspotensial mellom rtTA og Otet-sekvensene i fravær av doksycyklin, og gjenværende aktivitet av Otet-transgenet i fravær av rtTA (gjennomgått i34). Lekkende uttrykk representerer en svakhet ved Tet-systemene, og selv om lekkasjen ofte er en akseptabel ulempe for systemet, kan situasjoner der det lekkende uttrykket kan føre til toksisitet og dødelighet, for eksempel med diptheriatoksin (DTA) hos Otet-DTA-dyr begrense bruken av disse systemene35.
Hjernebehandling, seksjonering og immunfluorescens av tynne seksjoner for mikroskopi For å analysere hjernen til mus etter et avstamningssporingseksperiment, må mus først perfunderes via transkardial perfusjon for å fjerne blod og CSF som kan føre til høy autofluorescens i hjernen. Det er to vanlige fikseringsmidler som dyret kan perfunderes med: Histochoice Tissue Fixative, et glyoksalfiksativ (GF) eller 4% paraformaldehyd (PFA). Glyoksale fikseringsmidler tillater en relativt skånsom fikseringsprosess med mindre kryssbinding enn PFA. Dette reduserer vevsstivhet, reduserer behovet for antigenuthenting, og muliggjør mindre konsentrerte antistoffløsninger under immunostaining. Men hvis de inneholder metanol, kan dette tjene til å øke autofluorescens36. På den annen side vil PFA ofte tillate en mer robust fiksering, og mens antigenuthenting vil være nødvendig under immunostaining, er det antistoffer som bare vil fungere med PFA-faste vev, og perfusjon med 4% PFA er nødvendig for den optiske clearingteknikken beskrevet senere.
Følgende perfusjon er et postfikseringstrinn, hvor hjernen er nedsenket i samme type fikseringsmiddel som brukes under perfusjonen over natten. Dette gjør det mulig for alle hjernegrupper som kanskje ikke har blitt fullstendig løst under perfusjonen å fortsette å fikse. Deretter vil hjernen inkuberes i sukrose i fosfatbufret saltvann (PBS) for å fjerne så mye vann som mulig før frysetrinnet for å forhindre isdannelse i vevet ("kryobevaring"). Hjerner kan da kuttes i et hvilket som helst antall sagittale, koronale eller tverrgående vevsseksjoner for behandling. For både presisjon og reproduserbarhet må kalibrerte hjerneblokker brukes på en måte som sikrer konsistente bregma-kutt mellom dyr. Den viktigste faktoren som kan påvirke hvordan hjernen er seksjonert, er hjerneområdet (e) av interesse. For eksempel, mens et sagittalt kutt kan tillate at flere hjernegrupper analyseres i en vevsseksjon, vil dette kuttet ikke tillate analyse av nevro / gliogene regioner i den ventrikulære subventrikulære sonen (V-SVZ) da laterale og mediale sider av lateral ventrikel vil være umulig å skille i den dimensjonen og observeres bedre i koronalplanet. Dette kan være et viktig skille å gjøre i voksne nevrogenesestudier, da lateralsiden av lateral ventrikel inneholder den neurogene V-SVZ, mens medialveggen i lateral ventrikel er en mer gliogen nisje37.
Etter at vev har blitt delt inn i koronale, sagittale eller tverrgående seksjoner, vil de bli frosset i blokker ved hjelp av optimal kjøletemperatur (OCT) innebyggingsløsning. Her fryses hjerner i dette materialet, med bruk av en blanding av tørris og etanol. Hvis tynn seksjonsanalyse er nødvendig, vil blokker bli skåret på en kryostat, og avhengig av nedstrømsanalysen som kreves, kan man følge positivt ladede glassglass som tynne seksjoner (<20 μm). Glassglass som ikke er ladet kan også brukes, men bruk av usladede lysbilder kan føre til at vev løsner fra lysbildene38. Hvis det er behov for frittflytende vevsseksjoner med middels tykkelse (>20 μm), vil vev bli samlet som frittflytende seksjoner. Hvis tykke seksjoner (0,5-4 mm) er nødvendig, er det nødvendig å skjære ikke-frosne hjerneseksjoner med en vibratom. Det er viktig å merke seg lagringsforskjellene mellom seksjoner på lysbilder, som krever frysing ved -20 til -80 ° C og frittflytende seksjoner, som vil bli lagret ved 4 ° C.
Hjernerydding og heldekkende immunfluorescerende konfokalmikroskopi Hvis en bredere, men mindre detaljert analyse av avstamningssporede celler i musehjernen er ønskelig, er en omfattende analyse av tykkere segmenter av hjernevev mulig med iDISCO hjernerydding39 etterfulgt av immunostaining og flislagt z-stack konfokal mikroskopi eller lysarkmikroskopi. Her vil store deler av musehjernen bli optisk ryddet (en prosess med delipidering39), noe som bedre muliggjør fluorescerende signalavbildning over en 1 mm vevsseksjon. Ulempene med denne prosessen er høy autofluorescens og redusert evne til å oppnå høyoppløselige bilder av cellemorfologi og detaljert samfargingsanalyse på grunn av de økte arbeidsavstandene som kreves sammenlignet med mer tradisjonelle metoder (tynne kryoseksjoner eller frittflytende seksjoner). Av denne grunn anbefaler vi hjernerydding for å analysere de store avstamningssporingsresultatene gjennom flere hjerneområder, i stedet for å forsøke å karakterisere eller analysere individuelle celler.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Antibody diluent</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>S080983-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antigen Retrieval Solution</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>S2367</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-GFP antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A2311</td>
			<td>Use at 1:500-1:000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A18-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B6.Cg-Tg(tet0-cre)1Jaw/J</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>JAX:006234</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B6.129(Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo/J</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>JAX:007676</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blocking Solution (IHC)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>20773</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blunt needle</td>
			<td>BSTEAN</td>
			<td>X0012SYHIV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coronal brain block</td>
			<td>Braintree</td>
			<td>BS-2000C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover slip</td>
			<td>Corning</td>
			<td>2850-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat</td>
			<td>Leica</td>
			<td>CM1900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D564</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dibenzyl ether</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>33630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichloromethane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>270997</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey Serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9663</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Doxycycline Hyclate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9891</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0718</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin Sodium Salt from Porcine Mucosa</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histochoice Molecular Biology Tissue Fixative</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>H120</td>
			<td>This product has since been discontinued, but can be replaced with Glyo-Fixx (Thermo Scientific, 6764265)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen Peroxide Solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>516813</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IHC Select TBS Rinse Buffer</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>20845</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine</td>
			<td>Westward</td>
			<td>0143-95095-10</td>
			<td>This product requires a DEA license for storage and use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A452-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Slides</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milipore Block</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>20773</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting medium</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>5013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optimal Cutting Temperature Solution</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS Solution (10X)</td>
			<td>Teknova</td>
			<td>P0496</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sagittal brain block</td>
			<td>Braintree</td>
			<td>RBM-2000S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saline</td>
			<td>Braun</td>
			<td>S8004-5264</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sudan (Typogen) Black</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>199664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetrahydrofuran</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>186562</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue cartridge</td>
			<td>Simport</td>
			<td>M512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>655205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>AnaSed</td>
			<td>sc-362950Rx</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

lineage tracing of inducible fluorescently-labeled stem cells in the adult mouse brain

En telomerase revers transkriptase (Tert) lineage-tracing muselinje ble utviklet for å undersøke oppførselen og skjebnen til voksne vevstamceller, ved å krysse 'Tet-On' -systemet oTet-Cre-musen med en ny omvendt tetracyklintransaktivator (rtTA) transgen knyttet til Tert-promotoren, som vi har demonstrert markerer en ny populasjon av voksne hjernestamceller. Her vil administrering av tetracyklinderivatet doksycyklin til mTert-rtTA::oTet-Cre mus uutslettelig markere en populasjon av celler som uttrykker et 4,4 kb fragment av promotorregionen av genet Tert. Når kombinert Rosa-mTmG reporter, mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmG mus vil uttrykke membran tdTomato (mTomato) inntil doksycyklin behandling induserer erstatning av mTomato uttrykk med membran EGFP (mGFP) i celler som også uttrykker Tert. Derfor, når disse trippeltransgene avstamningssporingsmusene mottar doksycyklin ("puls" -perioden der TERT-uttrykkende celler er merket), vil disse cellene bli uutslettelig merkede mGFP + -celler, som kan spores i en hvilken som helst ønskelig tid etter doxycyklinfjerning ("jakt" -perioden), selv om Tert-uttrykket senere går tapt. Hjerner blir deretter perfusjonsfaste og behandlet for immunfluorescens og andre nedstrømsapplikasjoner for å tolke endringer i stamcelleaktivering, proliferasjon, avstamningsforpliktelse, migrasjon til ulike hjernenisjer og differensiering til modne celletyper. Ved hjelp av dette systemet kan enhver rtTA-mus parres med oTet-Cre og en Rosa-reporter for å utføre doksycyklinininduserbare "pulsjakt" avstamningssporingseksperimenter ved hjelp av markører av stamceller.

Mens fluorescerende signal som følge av et Tet-On-system med en fluorescerende reporter vil variere avhengig av promotoren av interesse og fluorofor (er) som brukes, vil vi beskrive hvordan funnene ble analysert med mTert-rtTA: : oTet-Cre: : Rosa-mTmG dyr. Analyse av voksne hjerner etter en pulsjakt resulterte i membran GFP-uttrykkende celler gjennom ulike anatomiske nisjer. Forskjellen i fluorescerende intensitet mellom ulike celletyper må noteres. En variabel angående fluorescerende intensitet er størrelsen på cel...

Watch this Scientific Journal Video about Lineage Tracing of Inducible Fluorescently-Labeled Stem Cells in the Adult Mouse Brain at JoVE.com

Lineage Tracing of Inducible Fluorescently-Labeled Stem Cells in the Adult Mouse Brain

Evnen til permanent å markere stamceller og deres avkom med en fluorofor ved hjelp av en induserbar transgen linjesporingsmuselinje muliggjør romlig og tidsmessig analyse av aktivering, proliferasjon, migrasjon og / eller differensiering in vivo. Avstamningssporing kan avsløre ny informasjon om avstamningsforpliktelse, respons på intervensjon (er) og multipotens.

Avstamningssporing av induserbare fluorescerende merkede stamceller i den voksne musehjernen

A telomerase reverse transcriptase (Tert) lineage-tracing mouse line was developed to investigate the behavior and fate of adult tissue stem cells, by ...

Merking av stamceller og deres avkom med en induserbar transgen linjesporing muslinje muliggjør romlig og tidsmessig analyse av aktivering, spredning, migrasjon og / eller differensiering av voksne stamceller i hjernen in vivo. Avstamningssporing kan avsløre ny informasjon om avstamningsforpliktelse, respons på intervensjoner og multistyrke. Fordeler med transgene avstamningssporingsmetoder inkluderer spesifisitet ved å spore en bestemt cellelinje, uutslettelig ekspresjon av det fluorescerende proteinet uavhengig av celleomsetning eller differensiering, lav toksisitet av doksycylin, betinget aktivering og brukervennlighet med vanlige nedstrømsanalyser på avstamningssporvev, inkludert immunostaining og immunfluorescens.På grunn av den brede implikasjonen av plastisitet og celle i den voksne hjernen, vil karakterisering og analyse av voksne stamceller bidra til å informere om studiet av nevrodegenerative sykdommer, metabolske virkninger på hjernens plastisitet, aldring og andre relaterte forhold. For å begynne, glir varm til romtemperatur og etter fiksering med iskald aceton i 15 minutter. Vask lysbilder i fem minutter i 1X skyllebuffer, rist ved 60 rotasjoner per minutt ved romtemperatur mellom hvert trinn.Permeabilize for stående av kjernefysiske antigener med 0,3% Triton X-100 i 10 minutter ved romtemperatur. Permeabilize for stående av cytoplasmatiske antigener med 0,3% Tween-20 i 10 minutter ved romtemperatur. Utfør antigenhenting ved å mikrobølgeovn lysbilder i 50 til 100 milliliter 1x DAKO Antigen Retrieval Solution på lav i 10 minutter, to ganger.Skyll deretter med buffer i fem minutter ved romtemperatur. inkuber lysbilder i 0,3% Typogen Black i 70% etanol i 20 minutter ved romtemperatur og vask deretter med skyllbuffer. Tegn hydrofob barriere rundt vev.Blokker i 20 minutter ved 37 grader Celsius med blokkerende reagens. Og inkubere med primært antistoff fortynnet i antistoff fortynningsmiddel over natten ved fire grader Celsius. Vask lysbildene i 10 minutter ved romtemperatur.Neste dag inkuberes seksjoner i Alexa Fluor sekundære antistoffer i 10 minutter ved romtemperatur. Vask deretter lysbildene to ganger i skyllebuffer i 10 minutter. Dekk hjerneseksjoner i 100 mikroliter av ett til 500 anti-GFP antistoff konjugert til AlexaFluor 488, og inkuber over natten ved fire grader Celsius for å øke den endogene Fluor4, som markerer de sporede cellene.Neste dag vaskes med skyllebuffer to ganger. Og vask deretter i rennende DI-vann i fem minutter. Counterstain med 100 nanogram per milliliter 4'6-diamidino-2-fenylindol i fem minutter.Vask deretter i rennende DI-vann i fem minutter. Legg til en dråpe fluorescerende trygt monteringsmedium på toppen av hver vevsseksjon og forsegl med en 22 millimeter x 22 millimeter deksler. Bildebehandling anbefales på monteringsdagen for å sikre optimalt signal.For å begynne fiksering og seksjonering etter transkardial perfusjon post-fix hjerner i 4% PFA over natten ved fire grader Celsius. Og så igjen i en time ved romtemperatur. Vask hjernen i 1x PBS i en time to ganger ved romtemperatur.Klipp hjernen i en millimeter tykke seksjoner ved hjelp av sagittal hjerneblokk og plasser i fem milliliter mikro sentrifugerør som inneholder 1x PBS. For metanolforbehandling, start med å vaske med 1x PBS i en time to ganger ved romtemperatur. Vask i 50% metanol i en time ved romtemperatur.Vask i 80% metanol i en time ved romtemperatur. Vask i 100% metanol i en time, to ganger, ved romtemperatur. Blekemiddelprøver med 5% hydrogenperoksid i 20% dimetylsulfoksid og metanol ved fire grader Celsius over natten.Etter bleking, vask prøver i metanol i en time to ganger ved romtemperatur. Vask i 20% dimetylsulfoksid og metanol i en time to ganger ved romtemperatur. Vask i 80% metanol i en time ved romtemperatur.Vask i 50% metanol i en time ved romtemperatur. Vask i PBS i en time to ganger ved romtemperatur. Vask i PBS 0.2% Triton X-100 i en time to ganger ved romtemperatur.For immunostain av clearing hjerner, begynn med å inkubere prøver i 1x PBS, 0,2% Triton X-100, 20% DMSO, 0,3 molar glycin, ved 37 grader Celsius over natten på en orbital shaker. Blokk i 1x PBS, 0,2% Triton X-100, 10% DMSO, 6% geiteserum ved 37 grader Celsius i tre dager på en orbital shaker. Vask prøver i 1x PBS, 0,2% Tween-20, 10 mikrogram per milliliter heparin natriumsalt fra svineslimhinnen i en time to ganger ved 37 grader Celsius.Deretter inkuberes i 1x PBS, 0,2% Tween-20, 10 mikrogram per milliliter heparin, 5% DMSO, 3% geiteserum som inneholder en til 500 konsentrasjon av kanin anti GFP AlexaFluor 488 ved 37 grader Celsius på en orbital shaker i to dager. Vask prøver i 1x PBS, 0,2% Tween-20 med 10 mikrogram per milliliter heparin i en time ved 37 grader Celsius på en orbital shaker tre ganger og deretter en gang om dagen i to dager. Inkuber prøver over natten i en milliliter 50% Tetrahydrofuran og vann.Inkuber prøver i en time i en milliliter 80% THF Tetrahydrofuran og vann. Inkuber prøver to ganger i en time i 100% Tetrahydrofuran. Tørk prøvene med en steril våtserviett og inkuber i diklormetan til de synker til bunnen av hetteglasset.Ikke inkuber i mer enn 60 minutter. Inkuber prøver i en milliliter dibenzyleter til klar. Oppbevar prøver i dibenzyleter ved romtemperatur til de er klare til å avbildes.For å avbilde immunsekkede hjerneseksjoner, analyser lysbilder via konfokal mikroskopi, hvor samuttrykk av flere antistoffer kan bekreftes. Vi bruker et Leica Stellaris femmikroskop med HyD S hybriddetektorer. For å avbilde ryddede hjerner, bruk et omvendt konfokalt mikroskop med en automatisert scene og automatisert flisleggingsfunksjon.Begynn med å legge en ryddet hjerneseksjon flatt mot en glassbunnsfat i nedsenk i dibenzyleter. En merkbar forskjell i fluorescerende intensitet på tvers av forskjellige hjernegrupper og forskjellige celletyper ble observert etter en pulsjaktperiode i avstamningssporede hjerner. Choroidepitelceller i choroid plexus hadde en tykk cellemembran og sterkt grønt fluorescerende signal som indikerer at de stammer fra Tert-positive celler som lett kunne skilles fra de omkringliggende cellene.De andre mindre celletypene i choroid plexus stroma hadde et svakere GFP-signal. I lillehjernen uttrykte Bergmanns gliaceller høyere nivåer av GFP enn kurvceller, og variasjon i GFP-ekspresjon eksisterte også mellom individuelle kurvceller. For fabrikk sensoriske nevronaksoner i det glomerulære laget av den olfaktoriske pæren uttrykte også høye nivåer av GFP Olfactory sensoriske nevronaksoner som fyller det glomerulære laget av den olfaktoriske pæren uttrykt høye nivåer av membrantomat, eller rød fluorescens sammenlignet med de fleste andre hjernegrupper, selv når de samme nevronene er GFP-positive, noe som indikerer at noen celler syntes å miste mTomato-signal saktere under avstamningssporing.I motsetning til dette uttrykte GFP-positive celler i choroid plexus lav mTomato. I de fleste andre hjernegrupper uttrykte tomatsignaler på lavt nivå over de fleste celletyper med endotelceller som noen av de eneste cellene hvis fluorescerende signal var lyst nok til å skille seg tydelig ut fra den røde fluorescerende bakgrunnen til hjernevævet. Det viktigste å huske er at det fluorescerende signalet i ryddede hjerner falmer raskere enn de fleste andre immunanalyser.Husk å avbilde prøvene dine så snart som mulig og innen syv dager. Følgende, avbildning av hjerneskiver eller klare hjerner, fargelegging av markører med GFP-signalene og vår kvantifisering av fluorens kan utføres ved hjelp av programmer.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay

Isolation and expansion of the putative neural stem cells (NSCs) from the adult murine brain was first described by Reynolds and Weiss in 1992 employing a ...

Growing Neural Stem Cells from Conventional and Nonconventional Regions of the Adult Rodent Brain

Økende nevrale stamceller fra konvensjonelle og ikke-konvensjonelle Regions of Adult Rodent Brain

Recent work demonstrates that central nervous system (CNS) regeneration and tumorigenesis involves populations of stem cells (SCs) resident within the ...

Electrophysiological Recording in the Brain of Intact Adult Zebrafish

Elektro opptak i hjernen til Intakt Adult Sebrafisk

Previously, electrophysiological studies in adult zebrafish have been limited to slice preparations or to eye cup preparations and electrorentinogram ...

Assessing Cell Cycle Progression of Neural Stem and Progenitor Cells in the Mouse Developing Brain after Genotoxic Stress

Vurdere Cell Cycle Progresjon av Neural Stem og stamceller i mus utvikling av hjernen etter Gentoksisk Stress

Neurons of the cerebral cortex are generated during brain development from different types of neural stem and progenitor cells (NSPC), which form a ...

Lineage-reprogramming of Pericyte-derived Cells of the Adult Human Brain into Induced Neurons

Lineage-omprogrammering av Pericyte-deriverte celler av den voksne Human Brain inn Utførte Nerveceller

Direct lineage-reprogramming of non-neuronal cells into induced neurons (iNs) may provide insights into the molecular mechanisms underlying neurogenesis ...

Conditional Genetic Transsynaptic Tracing in the Embryonic Mouse Brain

Betinget Genetisk Transsynaptic Tracing i Embryonic Mouse Brain

Anatomical path tracing is of pivotal importance to decipher the relationship between brain and behavior. Unraveling the formation of neural circuits ...

Laser-guided Neuronal Tracing In Brain Explants

Laserstyrte Neuronal Tracing i Brain eksplantater

We present a technique which combines an in vitro tracer injection protocol, which uses a series of electrical and pressure pulses to increase dye uptake ...

Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Mouse Subcallosal Zone

Isolasjon og Culture of Adult Neural stamceller fra mus Subcallosal Zone

Adult neural stem cells (aNSCs) can be used for the regeneration of damaged brain tissue. NSCs have the potential for differentiation and proliferation ...

An In Vivo Blood-brain Barrier Permeability Assay in Mice Using Fluorescently Labeled Tracers

An In Vivo Blood-brain Barrier Permeability Assay in Mice Using Fluorescently Labeled Tracers

I Vivo blod - hjerne barrieren permeabilitet analysen mus med Fluorescently merket Tracers

Blood-brain barrier (BBB) is a specialized barrier that protects the brain microenvironment from toxins and pathogens in the circulation and maintains ...

Intra-Arterial Delivery of Neural Stem Cells to the Rat and Mouse Brain: Application to Cerebral Ischemia

Intraarteriell levering av nevrale stamceller til rotte- og mushjernen: Søknad om cerebral iskemi

Neural stem cell (NSC) therapy is an emerging innovative treatment for stroke, traumatic brain injury and neurodegenerative disorders. As compared to ...