Name: lineage tracing of inducible fluorescently-labeled stem cells in the adult mouse brain
Uploaded: 2022-05-20T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Lineage Tracing of Inducible Fluorescently-Labeled Stem Cells in the Adult Mouse Brain at JoVE.com

Авторы хотели бы поблагодарить д-ра Диану Карлоне (Бостонская детская больница, Гарвардская медицинская школа) и д-ра Мэтью Лайнса (Центр диабета Джослина; Научно-исследовательский институт Медицинского центра штата Мэн) для руководства с использованием животных mTert-rtTA.

Все методы, описанные здесь, были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC) Университета штата Огайо.
1. Создание линии прослеживания линии мыши Тет-Он, стратегии размножения и генотипирования для экспериментальной когорты мы?...

     

Описан метод создания, использования и анализа тройной трансгенной линии, прослеживающей линию мыши, отмечающую стволовые клетки в мозге взрослой мыши in vivo. В сочетании с иммуноокрашиванием или очисткой мозга может быть выполнена идентификация и характеристика прослеживаемых фл...

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Antibody diluent</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>S080983-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antigen Retrieval Solution</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>S2367</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-GFP antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A2311</td>
			<td>Use at 1:500-1:000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A18-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B6.Cg-Tg(tet0-cre)1Jaw/J</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>JAX:006234</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B6.129(Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo/J</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>JAX:007676</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blocking Solution (IHC)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>20773</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blunt needle</td>
			<td>BSTEAN</td>
			<td>X0012SYHIV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coronal brain block</td>
			<td>Braintree</td>
			<td>BS-2000C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover slip</td>
			<td>Corning</td>
			<td>2850-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat</td>
			<td>Leica</td>
			<td>CM1900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D564</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dibenzyl ether</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>33630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichloromethane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>270997</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey Serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9663</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Doxycycline Hyclate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9891</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0718</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin Sodium Salt from Porcine Mucosa</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histochoice Molecular Biology Tissue Fixative</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>H120</td>
			<td>This product has since been discontinued, but can be replaced with Glyo-Fixx (Thermo Scientific, 6764265)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen Peroxide Solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>516813</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IHC Select TBS Rinse Buffer</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>20845</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine</td>
			<td>Westward</td>
			<td>0143-95095-10</td>
			<td>This product requires a DEA license for storage and use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A452-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Slides</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milipore Block</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>20773</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting medium</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>5013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optimal Cutting Temperature Solution</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS Solution (10X)</td>
			<td>Teknova</td>
			<td>P0496</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sagittal brain block</td>
			<td>Braintree</td>
			<td>RBM-2000S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saline</td>
			<td>Braun</td>
			<td>S8004-5264</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sudan (Typogen) Black</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>199664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetrahydrofuran</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>186562</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue cartridge</td>
			<td>Simport</td>
			<td>M512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>655205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>AnaSed</td>
			<td>sc-362950Rx</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

lineage tracing of inducible fluorescently-labeled stem cells in the adult mouse brain

Линия обратной транскриптазы теломеразы (Tert) была разработана для исследования поведения и судьбы взрослых тканевых стволовых клеток путем пересечения системы «Tet-On» oTet-Cre мыши с новым трансгеном обратного тетрациклинового трансактиватора (rtTA), связанным с промотором Трета, который, как мы продемонстрировали, отмечает новую популяцию взрослых стволовых клеток мозга. Здесь введение тетрациклинового производного доксициклина мышам mTert-rtTA::oTet-Cre позволит неизгладимо отметить популяцию клеток, экспрессирующих 4,4 кб фрагмента промоторной области гена Tert. При объединении репортера Rosa-mTmG мыши mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmG будут экспрессировать мембранный tdTomato (mTomato) до тех пор, пока лечение доксициклином не вызовет замену экспрессии mTomato мембраной EGFP (mGFP) в клетках, которые также экспрессируют Tert. Поэтому, когда эти мыши с тройной трансгенной линией, отслеживающие линию, получают доксициклин («импульсный» период, в течение которого отмечаются TERT-экспрессирующие клетки), эти клетки станут неизгладимо маркированными клетками mGFP+, которые можно отслеживать в течение любого желаемого периода времени после удаления доксициклина («период погони»), даже если экспрессия Tert впоследствии теряется. Затем мозг фиксируется перфузией и обрабатывается для иммунофлуоресценции и других последующих применений, чтобы интерпретировать изменения в активации стволовых клеток, пролиферации, приверженности родословной, миграции в различные ниши мозга и дифференцировки к зрелым типам клеток. Используя эту систему, любая мышь rtTA может быть соединена с oTet-Cre и репортером Rosa для проведения экспериментов по отслеживанию линий с использованием маркеров стволовых клеток, индуцируемых доксициклином.

В то время как флуоресцентный сигнал, полученный от системы Tet-On с флуоресцентным репортером, будет варьироваться в зависимости от интересующего промотора и используемого флуорофора (флуорофоров), мы опишем, как результаты были проанализированы с животными mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmG. Анализ моз...

Watch this Scientific Journal Video about Lineage Tracing of Inducible Fluorescently-Labeled Stem Cells in the Adult Mouse Brain at JoVE.com

Lineage Tracing of Inducible Fluorescently-Labeled Stem Cells in the Adult Mouse Brain

Способность постоянно маркировать стволовые клетки и их потомство флуорофором с использованием индуцируемой трансгенной линии, прослеживающей линию мыши, позволяет проводить пространственный и временной анализ активации, пролиферации, миграции и / или дифференцировки in vivo. Трассировка родословной может выявить новую информацию о приверженности линии, реакции на вмешательство (вмешательства) и мультипотентности.

Прослеживание линии индуцируемых флуоресцентно меченых стволовых клеток в мозге взрослой мыши

A telomerase reverse transcriptase (Tert) lineage-tracing mouse line was developed to investigate the behavior and fate of adult tissue stem cells, by ...

Маркировка стволовых клеток и их потомства индуцируемой трансгенной линией, прослеживающей линию мыши, позволяет проводить пространственный и временной анализ активации, пролиферации, миграции и/или дифференцировки взрослых стволовых клеток в мозге in vivo. Отслеживание родословной может выявить новую информацию о приверженности линии, реакции на вмешательства и мультитенции. Преимущества подходов к трансгенному отслеживанию линий включают специфичность отслеживания конкретной клеточной линии, неизгладимую экспрессию флуоресцентного белка независимо от клеточного оборота или дифференцировки, низкую токсичность доксицилина, условную активацию и простоту использования с общими последующими анализами на прослеживающих тканях линии, включая иммуноокрашивание и иммунофлуоресценцию.Из-за широкого значения пластичности и клеток во взрослом мозге, характеристика и анализ взрослых стволовых клеток помогут информировать об изучении нейродегенеративных заболеваний, метаболических воздействий на пластичность мозга, старения и других связанных с этим состояний. Для начала разогрейте горки до комнатной температуры и зафиксируйте ледяным холодным ацетоном в течение 15 минут. Мойте слайды в течение пяти минут в 1X ополаскивательном буфере, встряхивая со скоростью 60 оборотов в минуту при комнатной температуре между каждым шагом.Пермеабилизируют для стояния ядерных антигенов с 0,3%Тритон Х-100 в течение 10 минут при комнатной температуре. Пермеабилизируют для стояния цитоплазматических антигенов с 0,3% Tween-20 в течение 10 минут при комнатной температуре. Выполняйте извлечение антигена с помощью микроволнистых слайдов в 50-100 миллилитрах 1x DAKO Antigen Retrieval Solution на низком уровне в течение 10 минут, дважды.Далее смойте буфером в течение пяти минут при комнатной температуре. инкубировать слайды в 0,3% Typogen Black в 70% этаноле в течение 20 минут при комнатной температуре, а затем промыть ополаскивателем. Нарисуйте гидрофобный барьер вокруг ткани.Блокируйте на 20 минут при температуре 37 градусов Цельсия блокирующим реагентом. И инкубировать с первичным антителом, разведенным в разбавитом антителе в течение ночи при четырех градусах Цельсия. Мойте горки в течение 10 минут при комнатной температуре.На следующий день инкубируют участки во вторичных антителах Alexa Fluor в течение 10 минут при комнатной температуре. Затем дважды промывайте слайды в буфере для полоскания в течение 10 минут. Покрыть участки мозга 100 микролитрами от одного до 500 антител против GFP, конъюгированных с AlexaFluor 488, и инкубировать в течение ночи при четырех градусах Цельсия, чтобы повысить эндогенный Fluor4, отмечая прослеживаемые клетки.На следующий день дважды помойте ополаскивателем. А затем промыть в проточной ВОДЕ в течение пяти минут. Противодействуйте 100 нанограммам на миллилитр 4'6-диамидино-2-фенилиндол в течение пяти минут.Затем промыть в проточной DI воде в течение пяти минут. Добавьте каплю флуоресцентной безопасной монтажной среды поверх каждого участка ткани и запечатайте крышкой размером 22 на 22 миллиметра. Визуализация рекомендуется в день монтажа для обеспечения оптимального сигнала.Начинать фиксацию и сечение после транскардиальной перфузии после фиксации мозга в 4% PFA за ночь при четырех градусах Цельсия. А затем снова в течение одного часа при комнатной температуре. Промывайте мозги в 1x PBS в течение часа дважды при комнатной температуре.Разрежьте мозг на участки толщиной в один миллиметр с помощью сагиттального блока мозга и поместите в пять миллилитровых микроцентрифужных трубок, содержащих 1x PBS. Для предварительной обработки метанола начните с промывки 1x PBS в течение одного часа дважды при комнатной температуре. Промыть в 50% метаноле в течение одного часа при комнатной температуре.Промыть в 80% метаноле в течение одного часа при комнатной температуре. Промыть в 100% метаноле в течение одного часа, дважды, при комнатной температуре. Отбеливающие образцы с 5% перекисью водорода в 20% диметилсульфоксида и метанолом при четырех градусах Цельсия за ночь.После отбеливания промыть образцы метанолом в течение одного часа дважды при комнатной температуре. Промыть в 20% диметилсульфоксиде и метаноле в течение одного часа дважды при комнатной температуре. Промыть в 80% метаноле в течение одного часа при комнатной температуре.Промыть в 50% метаноле в течение одного часа при комнатной температуре. Мойте в PBS в течение одного часа дважды при комнатной температуре. Стирайте в PBS 0,2%Triton X-100 в течение одного часа дважды при комнатной температуре.Для иммуноокрашения очищающего мозга начните с инкубации образцов в 1x PBS, 0,2% Triton X-100, 20% DMSO, 0,3 молярного глицина, при 37 градусах Цельсия в течение ночи на орбитальном шейкере. Блокируйте в 1x PBS, 0,2% Triton X-100, 10% DMSO, 6% козьей сыворотке при 37 градусах Цельсия в течение трех дней на орбитальном шейкере. Промывайте образцы в 1x PBS, 0,2%Tween-20, 10 мкг на миллилитр гепариновой натриевой соли из слизистой оболочки свиней в течение одного часа дважды при 37 градусах Цельсия.Далее инкубируют в 1x PBS, 0,2%Tween-20, 10 мкг на миллилитр гепарина, 5%DMSO, 3%козьей сыворотки, содержащей от одной до 500 концентраций анти-кролика против GFP AlexaFluor 488 при 37 градусах Цельсия на орбитальном шейкере в течение двух дней. Промывайте образцы в 1x PBS, 0,2% Tween-20 с 10 микрограммами на миллилитр гепарина в течение одного часа при 37 градусах Цельсия на орбитальном шейкере три раза, а затем один раз в день в течение двух дней. Инкубируйте образцы на ночь в одном миллилитре 50% тетрагидрофурана и воде.Инкубируйте образцы в течение одного часа в одном миллилитре 80% ТГФ тетрагидрофурана и воды. Инкубируйте образцы дважды в течение одного часа в 100% тетрагидрофуране. Сушат образцы стерильной салфеткой и инкубируют в дихлорметане до тех пор, пока они не опустятся на дно флакона.Не инкубируйте более 60 минут. Инкубируйте образцы в одном миллилитре дибензилового эфира до очистки. Храните образцы в дибензиловом эфире при комнатной температуре до готовности к изображению.Чтобы получить изображение иммуноокрашенных участков мозга, проанализируйте слайды с помощью конфокальной микроскопии, где может быть подтверждена коэкспрессия нескольких антител. Мы используем пятимикроскоп Leica Stellaris с гибридными детекторами HyD S. Чтобы получить изображение очищенного мозга, используйте перевернутый конфокальный микроскоп с автоматизированной сценой и автоматизированной функцией укладки плитки.Начните с того, что положите очищенный участок мозга плоско на стеклянную нижнюю чашку в погружение в дибензиловый эфир. Заметная разница в интенсивности флуоресценции в разных областях мозга и различных типах клеток наблюдалась после периода погони за пульсом в линии прослеживаемого мозга. Хориоидные эпителиальные клетки в сосудистом сплетении имели толстую клеточную мембрану и сильный зеленый флуоресцентный сигнал, указывающий на то, что они получены из трет-положительных клеток, которые легко отличимы от окружающих клеток.Другие более мелкие типы клеток в строме сосудистого сплетения имели более слабый сигнал GFP. В мозжечке глиальные клетки Бергмана экспрессировали более высокие уровни GFP, чем клетки корзины, и вариации в экспрессии GFP также существовали между отдельными клетками корзины. Для заводских сенсорных нейронов аксоны в клубочковом слое обонятельной луковицы также экспрессировали высокие уровни GFP Обонятельные сенсорные нейронные аксоны, которые заполняют клубочковый слой обонятельной луковицы, выражали высокие уровни мембранного помидора или красную флуоресценцию по сравнению с большинством других областей мозга, даже когда те же нейроны являются положительными GFP, что указывает на то, что некоторые клетки, по-видимому, теряют сигнал mTomato медленнее во время трассировки линии.Напротив, в сосудистом сплетении GFP положительные клетки экспрессируют низкий mTomato. В большинстве других областей мозга томатные сигналы экспрессируются на низком уровне в большинстве типов клеток, причем эндотелиальные клетки являются одними из единственных клеток, чей флуоресцентный сигнал был достаточно ярким, чтобы отчетливо выделяться на красном флуоресцентном фоне ткани мозга. Самое главное, что нужно помнить, это то, что флуоресцентный сигнал в очищенном мозге исчезает быстрее, чем большинство других иммунопробиров.Не забудьте изобразить образцы как можно скорее и в течение семи дней. После этого визуализация срезов мозга или чистого мозга, окрашивание маркеров сигналами GFP и наша количественная оценка флуоренса могут быть предприняты с помощью программ.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay

Выделение и расширение взрослой мыши нервные стволовые клетки Использование Neurosphere Пробирной

Isolation and expansion of the putative neural stem cells (NSCs) from the adult murine brain was first described by Reynolds and Weiss in 1992 employing a ...

Growing Neural Stem Cells from Conventional and Nonconventional Regions of the Adult Rodent Brain

Выращивание нервные стволовые клетки из обычных и нетрадиционных областях мозга взрослых грызунов

Recent work demonstrates that central nervous system (CNS) regeneration and tumorigenesis involves populations of stem cells (SCs) resident within the ...

Electrophysiological Recording in the Brain of Intact Adult Zebrafish

Электрофизиологические записи в мозгу неповрежденном взрослых данио рерио

Previously, electrophysiological studies in adult zebrafish have been limited to slice preparations or to eye cup preparations and electrorentinogram ...

Assessing Cell Cycle Progression of Neural Stem and Progenitor Cells in the Mouse Developing Brain after Genotoxic Stress

Оценка клеточного цикла Прогрессирование нервных стволовых и клеток-предшественников в развивающемся мозге мыши после Генотоксические стресса

Neurons of the cerebral cortex are generated during brain development from different types of neural stem and progenitor cells (NSPC), which form a ...

Lineage-reprogramming of Pericyte-derived Cells of the Adult Human Brain into Induced Neurons

Lineage-перепрограммирование перицитов клеток, полученных из взрослых мозга человека в индуцированные нейронов

Direct lineage-reprogramming of non-neuronal cells into induced neurons (iNs) may provide insights into the molecular mechanisms underlying neurogenesis ...

Conditional Genetic Transsynaptic Tracing in the Embryonic Mouse Brain

Условный Генетическая Transsynaptic Трассировка в мозге эмбриональных мыши

Anatomical path tracing is of pivotal importance to decipher the relationship between brain and behavior. Unraveling the formation of neural circuits ...

Laser-guided Neuronal Tracing In Brain Explants

Лазерным наведением нейронов в головном мозге Трассировка Экспланты

We present a technique which combines an in vitro tracer injection protocol, which uses a series of electrical and pressure pulses to increase dye uptake ...

Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Mouse Subcallosal Zone

Выделение и культуры взрослых нервные стволовые клетки от мыши зоны расположенный под мозолистым телом

Adult neural stem cells (aNSCs) can be used for the regeneration of damaged brain tissue. NSCs have the potential for differentiation and proliferation ...

An In Vivo Blood-brain Barrier Permeability Assay in Mice Using Fluorescently Labeled Tracers

An In Vivo Blood-brain Barrier Permeability Assay in Mice Using Fluorescently Labeled Tracers

В естественных условиях Blood - brain барьер проницаемость Assay мышей с использованием дневно помечены Трейсеры

Blood-brain barrier (BBB) is a specialized barrier that protects the brain microenvironment from toxins and pathogens in the circulation and maintains ...

Intra-Arterial Delivery of Neural Stem Cells to the Rat and Mouse Brain: Application to Cerebral Ischemia

Внутриархивная доставка нейронных стволовых клеток крыс и мышей мозга: Применение к церебральной ишемии

Neural stem cell (NSC) therapy is an emerging innovative treatment for stroke, traumatic brain injury and neurodegenerative disorders. As compared to ...