Name: lineage tracing of inducible fluorescently-labeled stem cells in the adult mouse brain
Uploaded: 2022-05-20T14:00:00
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Diana Carlone (Boston Children's Hospital, Harvard Medical School) y al Dr. Matthew Lynes (Joslin Diabetes Center; Maine Medical Center Research Institute) para orientación utilizando animales mTert-rtTA.

Todos los métodos descritos aquí han sido aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad Estatal de Ohio.
1. Creación de una línea de ratón Tet-On de rastreo de linaje, estrategias de reproducción y genotipado para ratones de cohorte experimentales
NOTA: Aquí, describimos la creación de un sistema de ratón Tet-On con Rosa-mTmG como el gen reportero fluorescente que se somete a la recombinación C...

     

Se describe un método para la creación, utilización y análisis de una línea de ratón de rastreo de linaje transgénico triple que marca las células madre dentro del cerebro del ratón adulto in vivo. Cuando se combina con la inmunotinción o la limpieza cerebral, se puede lograr la identificación y caracterización de células fluorescentes trazadas en todo el cerebro. Esta técnica ofrece la capacidad de comprender el potencial plástico / regenerativo / remodelante de las células madre marcadas a medi...

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	<tbody>
		<tr>
			<td>Antibody diluent</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>S080983-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antigen Retrieval Solution</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>S2367</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-GFP antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A2311</td>
			<td>Use at 1:500-1:000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A18-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B6.Cg-Tg(tet0-cre)1Jaw/J</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>JAX:006234</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B6.129(Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo/J</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>JAX:007676</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blocking Solution (IHC)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>20773</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blunt needle</td>
			<td>BSTEAN</td>
			<td>X0012SYHIV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coronal brain block</td>
			<td>Braintree</td>
			<td>BS-2000C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover slip</td>
			<td>Corning</td>
			<td>2850-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat</td>
			<td>Leica</td>
			<td>CM1900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D564</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dibenzyl ether</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>33630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichloromethane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>270997</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey Serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9663</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Doxycycline Hyclate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9891</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0718</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin Sodium Salt from Porcine Mucosa</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histochoice Molecular Biology Tissue Fixative</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>H120</td>
			<td>This product has since been discontinued, but can be replaced with Glyo-Fixx (Thermo Scientific, 6764265)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen Peroxide Solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>516813</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IHC Select TBS Rinse Buffer</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>20845</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine</td>
			<td>Westward</td>
			<td>0143-95095-10</td>
			<td>This product requires a DEA license for storage and use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A452-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Slides</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milipore Block</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>20773</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting medium</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>5013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optimal Cutting Temperature Solution</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS Solution (10X)</td>
			<td>Teknova</td>
			<td>P0496</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sagittal brain block</td>
			<td>Braintree</td>
			<td>RBM-2000S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saline</td>
			<td>Braun</td>
			<td>S8004-5264</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sudan (Typogen) Black</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>199664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetrahydrofuran</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>186562</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue cartridge</td>
			<td>Simport</td>
			<td>M512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>655205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>AnaSed</td>
			<td>sc-362950Rx</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

lineage tracing of inducible fluorescently-labeled stem cells in the adult mouse brain

Se desarrolló una línea de ratón de rastreo de linaje de transcriptasa inversa (Tert) para investigar el comportamiento y el destino de las células madre de tejidos adultos, cruzando el sistema 'Tet-On' del ratón oTet-Cre con un nuevo transgén transactivador de tetraciclina inversa (rtTA) vinculado al promotor Tert, que hemos demostrado que marca una nueva población de células madre cerebrales adultas. Aquí, la administración del derivado de la tetraciclina doxiciclina a ratones mTert-rtTA::oTet-Cre marcará indeleblemente una población de células que expresan un fragmento de 4,4 kb de la región promotora del gen Tert. Cuando se combina el reportero Rosa-mTmG, los ratones mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmG expresarán tdTomato de membrana (mTomato) hasta que el tratamiento con doxiciclina induzca el reemplazo de la expresión de mTomato con EGFP de membrana (mGFP) en células que también expresan Tert. Por lo tanto, cuando estos ratones de rastreo de linaje triple transgénico reciben doxiciclina (el período de "pulso" durante el cual se marcan las células que expresan TERT), estas células se convertirán en células mGFP + marcadas indeleblemente, que se pueden rastrear durante cualquier cantidad de tiempo deseable después de la eliminación de doxiciclina (el período de "persecución"), incluso si la expresión de Tert se pierde posteriormente. Los cerebros se fijan y procesan para la inmunofluorescencia y otras aplicaciones posteriores con el fin de interpretar los cambios en la activación de las células madre, la proliferación, el compromiso de linaje, la migración a varios nichos cerebrales y la diferenciación a tipos de células maduras. Usando este sistema, cualquier ratón rtTA se puede acoplar a oTet-Cre y un reportero Rosa para llevar a cabo experimentos de rastreo de linaje de "persecución de pulso" inducibles por doxiciclina utilizando marcadores de células madre.

Si bien la señal fluorescente resultante de un sistema Tet-On con un reportero fluorescente variará dependiendo del promotor de interés y los fluoróforos utilizados, describiremos cómo se analizaron los hallazgos con animales mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmG. El análisis de cerebros adultos después de una persecución de pulsos dio como resultado células que expresan GFP de membrana en varios nichos anatómicos. Se debe tener en cuenta la diferencia en la intensidad fluorescente entre varios tipos de células. Una...

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Lineage Tracing of Inducible Fluorescently-Labeled Stem Cells in the Adult Mouse Brain

La capacidad de marcar permanentemente las células madre y su progenie con un fluoróforo utilizando una línea de ratón de rastreo de linaje transgénico inducible permite el análisis espacial y temporal de la activación, proliferación, migración y / o diferenciación in vivo. El rastreo de linaje puede revelar información novedosa sobre el compromiso del linaje, la respuesta a las intervenciones y la multipotencia.

Rastreo de linaje de células madre inducibles marcadas fluorescentemente en el cerebro de ratón adulto

A telomerase reverse transcriptase (Tert) lineage-tracing mouse line was developed to investigate the behavior and fate of adult tissue stem cells, by ...

El marcado de células madre y su progenie con una línea de ratón de rastreo de linaje transgénico inducible permite el análisis espacial y temporal de la activación, proliferación, migración y / o diferenciación de células madre adultas en el cerebro in vivo. El rastreo de linaje puede revelar información novedosa sobre el compromiso del linaje, la respuesta a las intervenciones y la potencia múltiple. Las ventajas de los enfoques de rastreo de linaje transgénico incluyen la especificidad de rastrear un linaje celular en particular, la expresión indeleble de la proteína fluorescente independientemente de la renovación o diferenciación celular, la baja toxicidad de la doxiciclina, la activación condicional y la facilidad de uso con ensayos comunes aguas abajo en tejidos traza del linaje, incluida la inmunotinción y la inmunofluorescencia.Debido a la amplia implicación de la plasticidad y la célula en el cerebro adulto, la caracterización y el análisis de las células madre adultas ayudarán a informar sobre el estudio de las enfermedades neurodegenerativas, los impactos metabólicos en la plasticidad cerebral, el envejecimiento y otras afecciones relacionadas. Para comenzar, calienta los portaobjetos a temperatura ambiente y pos-fija con acetona helada durante 15 minutos. Lave los portaobjetos durante cinco minutos en un tampón de enjuague 1X, agitando a 60 rotaciones por minuto a temperatura ambiente entre cada paso.Permeabilizar para la posición de antígenos nucleares con 0.3%Triton X-100 durante 10 minutos a temperatura ambiente. Permeabilizar para la posición de antígenos citoplasmáticos con 0.3%Tween-20 durante 10 minutos a temperatura ambiente. Realice la recuperación de antígenos mediante portaobjetos de microondas en 50 a 100 mililitros de 1 x DAKO Antigen Retrieval Solution en baja durante 10 minutos, dos veces.A continuación, enjuague con tampón durante cinco minutos a temperatura ambiente. incubar portaobjetos en 0.3% Typogen Black en 70% etanol durante 20 minutos a temperatura ambiente y luego lavar con tampón de enjuague. Dibuje una barrera hidrofóbica alrededor del tejido.Bloquee durante 20 minutos a 37 grados centígrados con reactivo de bloqueo. E incubar con anticuerpo primario diluido en diluyente de anticuerpos durante la noche a cuatro grados centígrados. Lave los portaobjetos durante 10 minutos a temperatura ambiente.Al día siguiente, incuba secciones en anticuerpos secundarios de Alexa Fluor durante 10 minutos a temperatura ambiente. Luego lave las diapositivas dos veces en el tampón de enjuague durante 10 minutos. Cubra las secciones cerebrales en 100 microlitros de uno a 500 anticuerpos anti-GFP conjugados con AlexaFluor 488, e incube durante la noche a cuatro grados Celsius para aumentar el Fluor4 endógeno, marcando las células trazadas.Al día siguiente, lavar con tampón de enjuague dos veces. Y luego lavar en agua corriente di durante cinco minutos. Contramancha con 100 nanogramos por mililitro 4'6-diamidino-2-fenilindol durante cinco minutos.Luego lavar en agua corriente di durante cinco minutos. Agregue una gota de medio de montaje seguro fluorescente en la parte superior de cada sección de tejido y selle con una cubierta de 22 milímetros por 22 milímetros. Se recomiendan imágenes el día del montaje para garantizar una señal óptima.Para comenzar la fijación y la seccionamiento después de la perfusión transcárdica post-fijación de cerebros en 4% PFA durante la noche a cuatro grados centígrados. Y luego de nuevo durante una hora a temperatura ambiente. Lave los cerebros en 1x PBS durante una hora dos veces a temperatura ambiente.Corte el cerebro en secciones de un milímetro de grosor usando el bloqueo cerebral sagital y colóquelo en tubos de micro centrífuga de cinco mililitros que contengan 1x PBS. Para el pretratamiento con metanol, comience lavando con 1x PBS durante una hora dos veces a temperatura ambiente. Lavar en etanol al 50% durante una hora a temperatura ambiente.Lavar en etanol al 80% durante una hora a temperatura ambiente. Lavar en 100% metanol durante una hora, dos veces, a temperatura ambiente. Muestras de lejía con peróxido de hidrógeno al 5% en sulfuro de dimetilo al 20% y metanol a cuatro grados centígrados durante la noche.Después del blanqueo, lave las muestras en metanol durante una hora dos veces a temperatura ambiente. Lavar en 20% dimetilsulfóxido y metanol durante una hora dos veces a temperatura ambiente. Lavar en etanol al 80% durante una hora a temperatura ambiente.Lavar en etanol al 50% durante una hora a temperatura ambiente. Lavar en PBS durante una hora dos veces a temperatura ambiente. Lavar en PBS 0.2%Triton X-100 durante una hora dos veces a temperatura ambiente.Para la inmunotinción de cerebros de limpieza, comience incubando muestras en 1x PBS, 0.2% Tritón X-100, 20% DMSO, 0.3 glicina molar, a 37 grados Celsius durante la noche en un agitador orbital. Bloquee en 1x PBS, 0.2% Triton X-100, 10% DMSO, 6% suero de cabra a 37 grados Celsius durante tres días en un agitador orbital. Lave las muestras en 1x PBS, 0.2% Tween-20, 10 microgramos por mililitros de sal de sodio de heparina de la mucosa porcina durante una hora dos veces a 37 grados centígrados.A continuación, incube en 1x PBS, 0.2% Tween-20, 10 microgramos por mililitros de heparina, 5% DMSO, 3% de suero de cabra que contiene de una a 500 concentraciones de conejo anti GFP AlexaFluor 488 a 37 grados Celsius en un agitador orbital durante dos días. Lave las muestras en 1x PBS, 0.2% Tween-20 con 10 microgramos por mililitro de heparina durante una hora a 37 grados Celsius en un agitador orbital tres veces y luego una vez al día durante dos días. Incubar muestras durante la noche en un mililitro de tetrahidrofurano al 50% y agua.Incubar muestras durante una hora en un mililitro de tetrahidrofurano 80%THF y agua. Incubar muestras dos veces durante una hora en 100%Tetrahidrofurano. Seque las muestras con una toallita estéril e incube en diclorometano hasta que se hundan en el fondo del vial.No incubar por más de 60 minutos. Incubar muestras en un mililitro de éter dibencil hasta que estén claras. Almacene las muestras en éter de dibencil a temperatura ambiente hasta que estén listas para obtener imágenes.Para obtener imágenes de secciones cerebrales inmunoteñidas, analice las diapositivas a través de microscopía confocal, donde se puede confirmar la coexpresión de múltiples anticuerpos. Utilizamos un microscopio leica Stellaris de cinco con detectores híbridos HyD S. Para obtener imágenes de cerebros despejados, use un microscopio confocal invertido con una etapa automatizada y una función de mosaico automatizada.Comience colocando una sección cerebral despejada plana contra un plato con fondo de vidrio sumergido en éter dibencil. Se observó una diferencia notable en la intensidad fluorescente en diferentes regiones del cerebro y varios tipos de células después de un período de persecución de pulsos en los cerebros trazados por el linaje. Las células epiteliales coroideas en el plexo coroideo tenían una membrana celular gruesa y una fuerte señal fluorescente verde que indicaba que derivaban de células Tert positivas que eran fácilmente distinguibles de las células circundantes.Los otros tipos de células más pequeñas en el estroma del plexo coroideo tenían una señal GFP más débil. En el cerebelo, las células gliales de Bergmann expresaron niveles más altos de GFP que las células de la canasta, y también existió variación en la expresión de GFP entre las células individuales de la canasta. Para los axones de las neuronas sensoriales de fábrica dentro de la capa glomerular del bulbo olfatorio también se expresan altos niveles de GFP Los axones de las neuronas sensoriales olfativas que llenan la capa glomerular del bulbo olfatorio expresaron altos niveles de tomate de membrana, o fluorescencia roja en comparación con la mayoría de las otras regiones del cerebro, incluso cuando las mismas neuronas son GFP positivas, lo que indica que algunas células parecían perder la señal de mTomato más lentamente durante el rastreo del linaje.Por el contrario, en el plexo coroideo las células GFP positivas expresaron mTomato bajo. En la mayoría de las otras regiones del cerebro, las señales de tomate se expresan a bajo nivel en la mayoría de los tipos de células, siendo las células endoteliales algunas de las únicas células cuya señal fluorescente era lo suficientemente brillante como para destacarse claramente del fondo fluorescente rojo del tejido cerebral. Lo más importante a recordar es que la señal fluorescente en los cerebros despejados se desvanece más rápido que la mayoría de los otros ensayos inmunológicos.Recuerde obtener imágenes de sus muestras lo antes posible y dentro de los siete días. A continuación, las imágenes de las rebanadas cerebrales o cerebros claros, la coloración de los marcadores con las señales GFP y nuestra cuantificación de la fluorencia se pueden llevar a cabo utilizando programas de software.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay

El aislamiento y la expansión de las células troncales nerviosas de ratones adultos mediante el ensayo de neuroesfera

Isolation and expansion of the putative neural stem cells (NSCs) from the adult murine brain was first described by Reynolds and Weiss in 1992 employing a ...

Investigación

Neurociencias

Growing Neural Stem Cells from Conventional and Nonconventional Regions of the Adult Rodent Brain

Cultivo de células madre neurales de Regiones convencionales y no convencionales del cerebro adulto de roedores

Recent work demonstrates that central nervous system (CNS) regeneration and tumorigenesis involves populations of stem cells (SCs) resident within the ...

Electrophysiological Recording in the Brain of Intact Adult Zebrafish

Registro electrofisiológico en el cerebro del pez cebra adultos Intacto

Previously, electrophysiological studies in adult zebrafish have been limited to slice preparations or to eye cup preparations and electrorentinogram ...

Assessing Cell Cycle Progression of Neural Stem and Progenitor Cells in the Mouse Developing Brain after Genotoxic Stress

La evaluación de la progresión del ciclo celular de la madre neurales y células progenitoras en el cerebro en desarrollo del ratón después de estrés genotóxico

Neurons of the cerebral cortex are generated during brain development from different types of neural stem and progenitor cells (NSPC), which form a ...

Lineage-reprogramming of Pericyte-derived Cells of the Adult Human Brain into Induced Neurons

Lineage-reprogramación de células derivadas de pericitos del cerebro humano adulto en neuronas inducidas

Direct lineage-reprogramming of non-neuronal cells into induced neurons (iNs) may provide insights into the molecular mechanisms underlying neurogenesis ...

Conditional Genetic Transsynaptic Tracing in the Embryonic Mouse Brain

Condicional transsynaptic genética Seguimiento en el cerebro de embriones de ratón

Anatomical path tracing is of pivotal importance to decipher the relationship between brain and behavior. Unraveling the formation of neural circuits ...

Laser-guided Neuronal Tracing In Brain Explants

Neuronal Tracing en explantes cerebrales guiadas por láser

We present a technique which combines an in vitro tracer injection protocol, which uses a series of electrical and pressure pulses to increase dye uptake ...

Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Mouse Subcallosal Zone

Aislamiento y cultivo de células madre adultas neural de la Zona subcallosal Ratón

Adult neural stem cells (aNSCs) can be used for the regeneration of damaged brain tissue. NSCs have the potential for differentiation and proliferation ...

An In Vivo Blood-brain Barrier Permeability Assay in Mice Using Fluorescently Labeled Tracers

An In Vivo Blood-brain Barrier Permeability Assay in Mice Using Fluorescently Labeled Tracers

Un en Vivo Barrera Blood - brain permeabilidad ensayo en ratones usando fluorescencia etiquetada trazadores

Blood-brain barrier (BBB) is a specialized barrier that protects the brain microenvironment from toxins and pathogens in the circulation and maintains ...

Intra-Arterial Delivery of Neural Stem Cells to the Rat and Mouse Brain: Application to Cerebral Ischemia

Entrega intra-arterial de células madre neuronales a la rata y el cerebro del ratón: aplicación a la isquemia cerebral

Neural stem cell (NSC) therapy is an emerging innovative treatment for stroke, traumatic brain injury and neurodegenerative disorders. As compared to ...