Name: lineage tracing of inducible fluorescently-labeled stem cells in the adult mouse brain
Uploaded: 2022-05-20T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Lineage Tracing of Inducible Fluorescently-Labeled Stem Cells in the Adult Mouse Brain at JoVE.com

Författarna vill tacka Dr. Diana Carlone (Boston Children's Hospital, Harvard Medical School) och Dr. Matthew Lynes (Joslin Diabetes Center; Maine Medical Center Research Institute) för vägledning som använder mTert-rtTA-djur.

Alla metoder som beskrivs här har godkänts av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) vid Ohio State University.
1. Skapande av en härstamning som spårar Tet-On-muslinjen, avelsstrategier och genotypning för experimentella kohortmöss
OBS: Här beskriver vi skapandet av ett Tet-On-mussystem med Rosa-mTmG som den fluorescerande reportergenen som genomgår Cre-rekombination, men olika andra Cre-rekombinationsdrivna reporterlinjer kan oc...

     

En metod för skapande, användning och analys av en trippel transgen härstamning som spårar muslinje som markerar stamceller i den vuxna mushjärnan in vivo beskrivs. I kombination med immunfärgning eller hjärnröjning kan identifiering och karakterisering av spårade fluorescerande celler över hela hjärnan åstadkommas. Denna teknik ger möjlighet att förstå plast/ regenerativ / ombyggnadspotentialen hos märkta stamceller när de aktiverar, migrerar, differentierar eller sprider sig. Medan tidigare da...

Värdet för en ursprungsspårningsmuslinje Analys av stamceller in vivo kan vara svårt eftersom många analyser som undersöker sådana celler bara fokuserar på att karakterisera dessa celler vid djurets död, vilket representerar en terminal ögonblicksbild i tid. För att bättre förstå processerna för spridning, differentiering och migration av stamfader, mellanliggande / övergångscelltyper och mogna celler över tid krävs en longitudinell analysmetod. Detta kan uppnås med härstamningsspårningsstudier där stam-/stamceller markeras outplånligt och kan följas hur länge som helst efteråt1.
I den vuxna däggdjurshjärnan analyserades först processen för neurogenes genom vilken vuxenfödda neuroner skapas från stam- och stamceller via etikettretention med tymidin-H3 2,3,4 eller 5-brom-2'-deoxyuridin (BrdU)5,6,7,8 . I dessa studier markerades proliferativa celler med tyminanalogen, som införlivades i cellernas DNA under replikation och celldelning /proliferation. Den markerade cellen, liksom deras avkomma, innehöll därför denna analog, som sedan identifierades post-mortem. Men medan tymidin-H3 och BrdU möjliggjorde märkning av proliferativa celler och deras avkomma i hjärnregioner där stamceller var dåligt förstådda, hindrades dessa studier av nackdelarna med dessa verktyg. Tymidin-H3 inducerar cellcykelstopp, apoptos och dosberoende DNA-synthämning9, medan BrdU markerar celler på varierande nivåer beroende på administreringsväg10 och tas upp av celler under reparation eller apoptos, liksom under celldelning11. Effektivare märkningsmetoder har använts nyligen, såsom märkning med 5-etynyl-2'-deoxyuridin (EdU), men många av samma problem som BrdU är fortfarande12. Dessa tillvägagångssätt är också begränsande genom att de markerar alla proliferativa celler, inte bara stamceller, och därmed kan tolkning av resultat förvirras. I den neurogena härstamningen behåller alla stam- och stamceller mitotisk kapacitet, och endast terminala / mogna neuroner är inte proliferativa. För astrocyter och mikroglia, men inte oligodendrocyter, upprätthålls proliferationen på obestämd tid 13,14,15.
Transgena möss som används för att härstamma endast celler som uttrycker ett protein av intresse, till exempel ett som bekräftats för att identifiera vuxna stamceller som vi använder här, har därför blivit vanligare när man undersöker stamceller och deras avkomma. Även om det är svårt att generera genom mustransgena tillvägagångssätt, möjliggör härstamningsspårning av muslinjer spårning av specifikt markerade celler i hjärnan och förlitar sig inte på spridning ensam. I Tet-On transgena mussystem inducerar administrering av tetracyklin eller doxycyklin (ett tetracyklinderivat) Cre-rekombinasuttryck i celler som har konstruerats med en omvänd tetracyklintransaktivator (rtTA), som transkriberas av en promotor av intresse. Den Tet-inducerbara Cre-drivna rekombinationen aktiverar sedan uttrycket av ett outplånligt fluorescerande eller självlysande protein i cellerna av intresse, beroende på vilken Rosa-reporter-mus som används. Dessa outplånligt markerade celler fortsätter att uttrycka denna reporter efter delning, differentiering eller migration, vilket möjliggör spårning av dessa celler och deras avkomma över tid eller efter olika ingrepp16. Fördelarna med transgena härstamningsmetoder inkluderar: 1) specificitet för spårning till en viss celllinje eller stamfader / stamcell markerad av rtTA, 2) outplånligt uttryck av det fluorescerande eller självlysande proteinet trots cellomsättning eller differentiering, 3) låg toxicitet, 4) villkorlig aktivering under någon punkt i djurets livscykel och 5) användarvänlighet med vanliga analyser, inklusive immunfärgning/immunofluorescens16.
Andra metoder för tidsmässigt inducerbara reporterverktyg hos möss inkluderar användning av Cre-ERT2-möss, som kan paras ihop med ROSA-GFP, ROSA-mTmG eller andra fluorescerande reportertransgener. Hos dessa djur driver ett cellspecifikt reglerande element, såsom en promotor eller förstärkare av intresse, produktionen av Cre-rekombinas, som endast kan aktiveras via administrering av tamoxifen. Medan Cre-ERT2-muslinjer möjliggör induktion av Cre i specifika cellinjer, finns det en mängd kunskap som beskriver effekterna av tamoxifen på vuxen neurogenes17,18. Dessutom finns det många ROSA-drivna fluorescerande reportergener som kan användas istället för GFP eller mTmG, inklusive YFP eller CFP, vilket skulle möjliggöra alternativ fluorescerande märkning i andra fluorescerande våglängder. Dessa fluorescerande reportergener kan användas med Tet-On- eller Cre-ERT2-system.
Telomeras omvänd transkriptas (TERT) är den hastighetsbegränsande komponenten i holoenzym telomeras, som arbetar för att förlänga telomerer efter att de förkortats under celldelning19,20. TERT har identifierats som en markör för vuxna vävnadsstamceller i tarmen 21,22, benmärg21, lever 23, fett24, endometrium25,26 och ben1. Huruvida TERT-uttryck i dessa vuxna stamceller enbart är för telomerasutvidgande aktivitet eller för att utföra icke-kanoniska TERT-roller27 är fortfarande okänt. TERT-uttryckande vilande vuxna stamceller (qASCs) har identifierats och spårats i hela kroppen med transgena härstamningsspårningsmöss för att studera dessa stamcellers multipotens och självförnyelseförmåga, liksom deras potential att aktivera, sprida, differentiera och migrera 1,22,23,28. Skapandet av Tert-rtTA-transgenen har utförts tidigare1. I det här dokumentet kommer vi att beskriva användningen av en härstamningsspårning TERT-muslinje för att studera TERT + qASCs som vi har identifierat som en ny ASC-population i den vuxna mushjärnan.
Generering av en transgen härstamning som spårar muslinje För att generera en härstamningsspårningsmuslinje med hjälp av Tet-On-systemet måste tre transgener kombineras inom ett enda djur genom musparning. Den första är en rtTA, uttryckt under kontroll av promotorn av genen av intresse (vår är TERT-rtTA). I en cell som uttrycker denna gen av intresse kommer rtTA därför att uttryckas. Den andra är en oTet-Cre-gen, som innehåller ett tetracyklinresponselement (TRE) som möjliggör transkription av Cre-rekombinas i närvaro av både ett rtTA-fusionsutskrift och tetracyklin eller doxycyklin. Tetracyklin eller doxycyklin kan administreras till ett djur via dricksvatten eller chow29. Slutligen måste det finnas en gen som kommer att aktiveras av Cre-rekombinasklyvning. I detta manuskript är märkningsgenen vi kommer att beskriva Rosa26-mTmG-genen, som fram till Cre-rekombination kommer att transkribera mTomato (membranröd fluorescens i alla celler). Men om en cell uttrycker rtTA-transkriptet och innehåller tetracyklin eller doxycyklin, kommer Cre-rekombination av en uppsättning lox P-platser mellan mTomato- och mGFP-platserna att ändra R26-platsen och få cellen att producera membran EGFP (mGFP eller membrangrön fluorescens) istället för membrantomat. Den outplånliga karaktären hos denna mGFP-signal möjliggör in vivo-märkning och spårning av celler när de sprider sig, migrerar och differentierar. Efter spåret kan celler analyseras för uttryck av GFP via immunofluorescens i standard kryosektioner eller tjockare optiskt rensade hjärnor.
I det här dokumentet kommer vi att beskriva användningen av den specifika muslinjen, mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmG. För att skapa denna trippel transgena muslinje parade vi först oTet-Cre-djur (The Jackson Lab-stammen #006234) med Rosa-mTmG-djur (The Jackson Lab-stammen #007676) för att skapa oTet-Cre::Rosa-mTmG dubbla transgena möss. Dessa djur genotypades med primers och PCR-mallar som anges i tilläggstabellerna 1 och 2. mTert-rtTA-möss (skapade av David Breault1) parades med oTet-Cre::Rosa-mTmG-djur för att skapa mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmG-möss (figur 1A)1,30. Verkningsmekanismen för mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmG-muslinjen illustreras i figur 1B.
Doxycyklininduktion och pulsjaktdesign Vid planering av experiment är det viktigt att överväga flera faktorer som kommer att påverka resultatet av härstamningsspårningsexperiment, inklusive djurets ålder vid doxycyklininduktion, längden på administrering av doxycyklin ("puls" -perioden), tiden efter avlägsnande av doxycyklin före vävnadsuppsamling ("jakt" -perioden) och tidpunkten för eventuella ingrepp under dessa processer. Dessa överväganden för studiedesign är viktiga för att förstå de märkta cellerna och deras avkomma vid experimentets slut. Det första steget i processen är att identifiera djurets intresseålder och längden på doxycyklinadministrationen. Längre pulsperioder gör det möjligt för fler celler att uttrycka den rtTA-länkade promotorn att uttryckas och fler celler av intresse att outplånligt markeras. En celltyp som uppvisar övergående uttryck av genen av intresse kan kräva en längre pulsperiod än celler som kontinuerligt uttrycker genen av intresse. Men om målet med studien är att förstå kortsiktiga effekter av cellen av intresse eller ett akut ingrepp, kan pulsperioden inte vara för lång, eftersom när en cell är markerad kommer den att spåras genom valfritt antal förändringar under resten av pulsperioden. I några av våra studier användes en 2 dagars puls utan jaktperiod för att närmare efterlikna en direktreporter för TERT. Detta beror på att den minsta tiden för rekombination av Rosa-mTmG-genen är 2 dagar31.
Nästa viktiga period i ett pulsjaktsexperiment är längden mellan avlägsnande av doxycyklin och perfusion av djuret, även känt som "jakten". Halveringstiden för doxycyklin hos möss är cirka 170 minuter oavsett administreringsväg, vilket möjliggör slutsatsen att doxycyklininduktion sannolikt inte längre förekommer flera timmar efter borttagning32. Det är dock viktigt att notera att doxycyklinmetabolismen är långsammare hos äldre möss, vilket kan leda till längre effektiva "pulsperioder" än unga djur33.
Under jaktperioden kommer märkta celler att fortsätta att märkas, även efter spridning, differentiering eller migration. Avkomman från dessa celler kommer också att märkas. Målet med studien kommer att forma längden på pulsjaktparadigmet. Om målet med studien är att förstå regenereringen av en vävnad under en lång tidsperiod med cellerna av intresse kan en lång jaktperiod krävas. Slutligen måste tidpunkten för eventuella ingrepp eller behandlingar bestämmas. Administrering under pulsperioden kommer att påverka cellerna som uttrycker genen av intresse såväl som eventuell avkomma som skapats under denna tid, medan administrering under jaktperioden kan påverka mestadels avkomman från cellerna av intresse, även om detta beror på hur snabbt de märkta cellerna delar sig eller differentierar. Exempel på pulsjaktsexperimentella konstruktioner som vi har använt beskrivs i figur 2A.
Det är också viktigt att vara medveten om möjligheten till bakgrunds-GFP-signal på grund av läckande uttryck. Läckande uttryck uppstår som ett resultat av inneboende bindningspotential mellan rtTA och Otet-sekvenserna i frånvaro av doxycyklin och restaktivitet hos Otet-transgenen i frånvaro av rtTA (granskad i34). Läckande uttryck representerar en svaghet i Tet-systemen, och även om läckan ofta är en acceptabel nackdel för systemet, kan situationer där det läckande uttrycket kan leda till toxicitet och dödlighet, såsom med difteritoxin (DTA) hos Otet-DTA-djur begränsa användningen av dessa system35.
Hjärnbearbetning, sektionering och immunofluorescens av tunna sektioner för mikroskopi För att analysera hjärnan hos möss efter ett härstamningsspårningsexperiment måste möss först perfuseras via transkardiell perfusion för att ta bort blod och CSF som kan leda till hög autofluorescens i hjärnan. Det finns två vanliga fixeringsmedel som djuret kan perfuseras med: Histochoice Tissue Fixative, ett glyoxalfixativ (GF) eller 4% paraformaldehyd (PFA). Glyoxala fixeringsmedel möjliggör en relativt skonsam fixeringsprocess med mindre tvärbindning än PFA. Detta minskar vävnadsstyvheten, minskar behovet av antigenhämtning och möjliggör mindre koncentrerade antikroppslösningar under immunfärgning. Men om de innehåller metanol kan detta tjäna till att öka autofluorescensen36. Å andra sidan kommer PFA ofta att möjliggöra en mer robust fixering, och även om antigenhämtning kommer att krävas under immunfärgning, finns det antikroppar som bara fungerar med PFA-fixerade vävnader, och perfusion med 4% PFA krävs för den optiska clearingtekniken som beskrivs senare.
Följande perfusion är ett postfixeringssteg, där hjärnor nedsänks i samma typ av fixeringsmedel som används under perfusionen över natten. Detta gör det möjligt för alla hjärnregioner som kanske inte har fixerats helt under perfusionen att fortsätta att fixa. Därefter kommer hjärnor att inkuberas i sackaros i fosfatbuffrad saltlösning (PBS) för att avlägsna så mycket vatten som möjligt före frysningssteget för att förhindra isbildning i vävnaden ("kryokonservering"). Hjärnor kan sedan skäras i valfritt antal sagittala, koronala eller tvärgående vävnadssektioner för bearbetning. För både precision och reproducerbarhet måste kalibrerade hjärnblock användas på ett sätt som säkerställer konsekventa bregmaskärningar mellan djur. Den viktigaste faktorn som kan påverka hur hjärnor är sektionerade är hjärnregionerna av intresse. Till exempel, medan ett sagittalt snitt kan möjliggöra att fler hjärnregioner analyseras i en vävnadssektion, kommer detta snitt inte att tillåta analys av neuro/ gliogena regioner i den ventrikulära subventrikulära zonen (V-SVZ) eftersom de laterala och mediala sidorna av lateral ventrikel kommer att vara omöjliga att urskilja i den dimensionen och observeras bättre i koronalplanet. Detta kan vara en viktig skillnad att göra i vuxna neurogenesstudier, eftersom sidosidan av lateral ventrikel innehåller den neurogena V-SVZ, medan den mediala väggen i lateral ventrikel är en mer gliogen nisch37.
Efter att vävnader har delats upp i koronala, sagittala eller tvärgående sektioner kommer de att frysas i block med hjälp av optimal kyltemperatur (OCT) inbäddningslösning. Här fryses hjärnor i detta inbäddningsmaterial, med användning av en blandning av torris och etanol. Om tunn sektionsanalys krävs kommer block att skivas på en kryostat, och beroende på den nedströmsanalys som krävs kan fästas på positivt laddade glasskivor som tunna sektioner (<20 μm). Glasglas som inte är laddade kan också användas, men användningen av oladdade diabilder kan leda till att vävnader lossnar från bilderna38. Om medeltjocka fritt flytande vävnadssektioner (>20 μm) krävs, kommer vävnader att samlas in som fritt flytande sektioner. Om tjocka sektioner (0,5-4 mm) krävs krävs skivning av icke-frusna hjärnsektioner med ett vibratom. Det är viktigt att notera lagringsskillnaderna mellan sektioner på diabilder, som kräver frysning vid -20 till -80 °C och fritt flytande sektioner, som kommer att lagras vid 4 °C.
Hjärnröjning och helmonterad immunofluorescerande konfokalmikroskopi Om en bredare, men mindre detaljerad analys av de härstamningsspårade cellerna i mushjärnan önskas, är en omfattande analys av tjockare segment av hjärnvävnad möjlig med iDISCO-hjärnrensning39 följt av immunfärgning och kaklad z-stack konfokalmikroskopi eller ljusplåtmikroskopi. Här kommer stora delar av mushjärnan att rensas optiskt (en process av delipidering39), vilket bättre möjliggör fluorescerande signalavbildning över en 1 mm vävnadssektion. Nackdelarna med denna process är hög autofluorescens och en minskad förmåga att få högupplösta bilder av cellmorfologi och detaljerad samfärgningsanalys på grund av de ökade arbetsavstånd som krävs jämfört med mer traditionella metoder (tunna kryosektioner eller fritt flytande sektioner). Av denna anledning rekommenderar vi hjärnröjning för att analysera de storskaliga spårningsresultaten i flera hjärnområden, istället för att försöka karakterisera eller analysera enskilda celler.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Antibody diluent</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>S080983-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antigen Retrieval Solution</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>S2367</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-GFP antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A2311</td>
			<td>Use at 1:500-1:000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A18-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B6.Cg-Tg(tet0-cre)1Jaw/J</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>JAX:006234</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B6.129(Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo/J</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>JAX:007676</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blocking Solution (IHC)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>20773</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blunt needle</td>
			<td>BSTEAN</td>
			<td>X0012SYHIV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coronal brain block</td>
			<td>Braintree</td>
			<td>BS-2000C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover slip</td>
			<td>Corning</td>
			<td>2850-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat</td>
			<td>Leica</td>
			<td>CM1900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D564</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dibenzyl ether</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>33630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichloromethane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>270997</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey Serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9663</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Doxycycline Hyclate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9891</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0718</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin Sodium Salt from Porcine Mucosa</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histochoice Molecular Biology Tissue Fixative</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>H120</td>
			<td>This product has since been discontinued, but can be replaced with Glyo-Fixx (Thermo Scientific, 6764265)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen Peroxide Solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>516813</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IHC Select TBS Rinse Buffer</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>20845</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine</td>
			<td>Westward</td>
			<td>0143-95095-10</td>
			<td>This product requires a DEA license for storage and use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A452-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Slides</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milipore Block</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>20773</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting medium</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>5013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optimal Cutting Temperature Solution</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS Solution (10X)</td>
			<td>Teknova</td>
			<td>P0496</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sagittal brain block</td>
			<td>Braintree</td>
			<td>RBM-2000S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saline</td>
			<td>Braun</td>
			<td>S8004-5264</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sudan (Typogen) Black</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>199664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetrahydrofuran</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>186562</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue cartridge</td>
			<td>Simport</td>
			<td>M512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>655205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>AnaSed</td>
			<td>sc-362950Rx</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

lineage tracing of inducible fluorescently-labeled stem cells in the adult mouse brain

En telomeras omvänd transkriptas (Tert) härstamningsspårningsmuslinje utvecklades för att undersöka beteendet och ödet hos vuxna vävnadsstamceller genom att korsa "Tet-On" -systemet oTet-Cre-mus med en ny transgen för omvänd tetracyklintransaktivator (rtTA) kopplad till Tert-promotorn, som vi har visat markerar en ny population av vuxna hjärnstamceller. Här kommer administrering av tetracyklinderivatet doxycyklin till mTert-rtTA::oTet-Cre-möss outplånligt att markera en population av celler som uttrycker ett 4,4 kb fragment av promotorregionen för genen Tert. När de kombineras med Rosa-mTmG-reportern kommer mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmG-möss att uttrycka membran tdTomato (mTomato) tills doxycyklinbehandling inducerar ersättning av mTomato-uttryck med membran EGFP (mGFP) i celler som också uttrycker Tert. Därför, när dessa trippel-transgena härstamningsspårningsmöss får doxycyklin ("puls" -perioden under vilken TERT-uttryckande celler markeras), kommer dessa celler att bli outplånligt märkta mGFP + -celler, som kan spåras under vilken önskvärd tid som helst efter avlägsnande av doxycyklin ("jakt" -perioden), även om Tert-uttryck senare går förlorat. Hjärnor fixeras sedan perfusionsfixerade och bearbetas för immunofluorescens och andra nedströmsapplikationer för att tolka förändringar i stamcellsaktivering, proliferation, härstamningsengagemang, migration till olika hjärnnischer och differentiering till mogna celltyper. Med hjälp av detta system kan vilken rtTA-mus som helst paras med oTet-Cre och en Rosa-reporter för att genomföra doxycyklininducerbara "pulsjakt" -spårningsexperiment med hjälp av markörer för stamceller.

Medan den fluorescerande signalen som härrör från ett Tet-On-system med en fluorescerande reporter kommer att variera beroende på den arrangör av intresse och fluorofor (er) som används, kommer vi att beskriva hur resultaten analyserades med mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmG-djur. Analys av vuxna hjärnor efter en pulsjakt resulterade i membran GFP-uttryckande celler genom olika anatomiska nischer. Skillnaden i fluorescerande intensitet mellan olika celltyper måste noteras. En variabel avseende fluorescerande intens...

Watch this Scientific Journal Video about Lineage Tracing of Inducible Fluorescently-Labeled Stem Cells in the Adult Mouse Brain at JoVE.com

Lineage Tracing of Inducible Fluorescently-Labeled Stem Cells in the Adult Mouse Brain

Förmågan att permanent markera stamceller och deras avkomma med en fluorofor med hjälp av en inducerbar transgen härstamning som spårar muslinjen möjliggör rumslig och tidsmässig analys av aktivering, proliferation, migration och / eller differentiering in vivo. Härstamningsspårning kan avslöja ny information om härstamningsengagemang, svar på interventioner och multipotens.

Härstamningsspårning av inducerbara fluorescerande märkta stamceller i den vuxna mushjärnan

A telomerase reverse transcriptase (Tert) lineage-tracing mouse line was developed to investigate the behavior and fate of adult tissue stem cells, by ...

Märkning av stamceller och deras avkomma med en inducerbar transgen härstamning som spårar muslinjen möjliggör rumslig och tidsmässig analys av aktivering, spridning, migration och/eller differentiering av vuxna stamceller i hjärnan in vivo. Härstamningsspårning kan avslöja ny information om härstamningsengagemang, svar på interventioner och multipotens. Fördelarna med transgena härstamningsmetoder inkluderar specificitet för att spåra en viss celllinje, outplånligt uttryck av det fluorescerande proteinet oavsett cellomsättning eller differentiering, låg toxicitet för doxycylin, villkorlig aktivering och användarvänlighet med vanliga nedströmsanalyser på spårvävnader av härstamning inklusive immunfärgning och immunofluorescens.På grund av den breda implikationen av plasticitet och cell i den vuxna hjärnan kommer karakteriseringen och analysen av vuxna stamceller att hjälpa till att informera om studien av neurodegenerativa sjukdomar, metaboliska effekter på hjärnans plasticitet, åldrande och andra relaterade tillstånd. Till att börja med, varma glider till rumstemperatur och efterfix med iskall aceton i 15 minuter. Tvätta diabilder i fem minuter i 1X sköljbuffert, skaka med 60 rotationer per minut vid rumstemperatur mellan varje steg.Permeabilisera för stående nukleära antigener med 0,3% Triton X-100 i 10 minuter vid rumstemperatur. Permeabilize för stående cytoplasmatiska antigener med 0,3% Tween-20 i 10 minuter vid rumstemperatur. Utför antigenhämtning genom att mikrovågsugna objektglas i 50 till 100 ml 1x DAKO Antigen Retrieval Solution på låg i 10 minuter, två gånger.Skölj sedan med buffert i fem minuter vid rumstemperatur. inkubera diabilder i 0,3% Typogen Black i 70% etanol i 20 minuter vid rumstemperatur och tvätta sedan med sköljbuffert. Rita hydrofob barriär runt vävnad.Blockera i 20 minuter vid 37 grader Celsius med blockerande reagens. Och inkubera med primär antikropp utspädd i antikroppsutspädningsmedel över natten vid fyra grader Celsius. Tvätta diabilder i 10 minuter vid rumstemperatur.Nästa dag inkuberar du sektioner i Alexa Fluor sekundära antikroppar i 10 minuter vid rumstemperatur. Tvätta sedan diabilder två gånger i sköljbuffert i 10 minuter. Täck hjärnsektioner i 100 mikroliter av en till 500 anti-GFP-antikropp konjugerad till AlexaFluor 488 och inkubera över natten vid fyra grader Celsius för att öka den endogena Fluor4, vilket markerar de spårade cellerna.Nästa dag, tvätta med sköljbuffert två gånger. Och tvätta sedan i rinnande DI-vatten i fem minuter. Motfärg med 100 nanogram per milliliter 4'6-diamidino-2-fenylindol i fem minuter.Tvätta sedan i rinnande DI-vatten i fem minuter. Lägg till en droppe fluorescerande säkert monteringsmedium ovanpå varje vävnadssektion och försegla med en täckglas på 22 millimeter x 22 millimeter. Avbildning rekommenderas på monteringsdagen för att säkerställa optimal signal.Att börja fixering och sektionering efter transkardiell perfusion post-fix hjärnor i 4% PFA över natten vid fyra grader Celsius. Och sedan igen i en timme vid rumstemperatur. Tvätta hjärnor i 1x PBS i en timme två gånger vid rumstemperatur.Skär hjärnan i en millimeter tjocka sektioner med hjälp av sagittal hjärnblock och placera i fem milliliter mikrocentrifugrör som innehåller 1x PBS. För metanolförbehandling, börja med att tvätta med 1x PBS i en timme två gånger vid rumstemperatur. Tvätta i 50% metanol i en timme vid rumstemperatur.Tvätta i 80% metanol i en timme vid rumstemperatur. Tvätta i 100% metanol i en timme, två gånger, vid rumstemperatur. Blekprover med 5% väteperoxid i 20% dimetylsulfoxid och metanol vid fyra grader Celsius över natten.Tvätta proverna i metanol i en timme två gånger vid rumstemperatur efter blekning. Tvätta i 20% dimetylsulfoxid och metanol i en timme två gånger vid rumstemperatur. Tvätta i 80% metanol i en timme vid rumstemperatur.Tvätta i 50% metanol i en timme vid rumstemperatur. Tvätta i PBS i en timme två gånger vid rumstemperatur. Tvätta i PBS 0,2% Triton X-100 i en timme två gånger vid rumstemperatur.För immunfärg av clearinghjärnor, börja med att inkubera prover i 1x PBS, 0,2% Triton X-100, 20% DMSO, 0,3 molar glycin, vid 37 grader Celsius över natten på en orbital shaker. Blockera i 1x PBS, 0,2% Triton X-100, 10% DMSO, 6% getserum vid 37 grader Celsius i tre dagar på en orbital shaker. Tvätta prover i 1x PBS, 0,2% Tween-20, 10 mikrogram per milliliter heparinnatriumsalt från svinslemhinnan i en timme två gånger vid 37 grader Celsius.Inkubera sedan i 1x PBS, 0,2% Tween-20, 10 mikrogram per milliliter heparin, 5% DMSO, 3% getserum innehållande en till 500 koncentration av kanin anti GFP AlexaFluor 488 vid 37 grader Celsius på en orbital shaker i två dagar. Tvätta prover i 1x PBS, 0,2% Tween-20 med 10 mikrogram per milliliter heparin i en timme vid 37 grader Celsius på en orbital shaker tre gånger och sedan en gång om dagen i två dagar. Inkubera prover över natten i en milliliter 50% Tetrahydrofuran och vatten.Inkubera prover i en timme i en milliliter 80% THF Tetrahydrofuran och vatten. Inkubera prover två gånger i en timme i 100% Tetrahydrofuran. Torka proverna med en steril torkduk och inkubera i diklormetan tills de sjunker till botten av injektionsflaskan.Inkubera inte i mer än 60 minuter. Inkubera prover i en milliliter dibensyleter tills de är klara. Förvara proverna i dibensyleter vid rumstemperatur tills de är klara att avbildas.För att avbilda immunstinna hjärnsektioner, analysera bilder via konfokalmikroskopi, där samuttryck av flera antikroppar kan bekräftas. Vi använder ett Leica Stellaris femmikroskop med HyD S hybriddetektorer. För att avbilda rensade hjärnor, använd ett inverterat konfokalmikroskop med ett automatiserat stadium och automatiserad plattsättningsfunktion.Börja med att lägga en rensad hjärnsektion platt mot en glasskål i nedsänkning i dibensyleter. En märkbar skillnad i fluorescerande intensitet mellan olika hjärnregioner och olika celltyper observerades efter en pulsjaktperiod i de härstamningsspårade hjärnorna. Choroidepitelceller i choroid plexus hade ett tjockt cellmembran och stark grön fluorescerande signal som indikerade att de härrörde från Tert-positiva celler som lätt kunde särskiljas från de omgivande cellerna.De andra mindre celltyperna i choroid plexus stroma hade en svagare GFP-signal. I lillhjärnan uttryckte Bergmanns gliaceller högre nivåer av GFP än korgceller, och variation i GFP-uttryck fanns också mellan enskilda korgceller. För fabrikssensoriska neuronaxoner inom det glomerulära skiktet i luktlampan uttrycktes också höga nivåer av GFP Olfactory sensoriska neuronaxoner som fyller det glomerulära skiktet i luktlampan uttryckte höga nivåer av membrantomat eller röd fluorescens jämfört med de flesta andra hjärnregioner även när samma neuroner är GFP-positiva vilket indikerar att vissa celler tycktes förlora mTomato-signalen långsammare under spårning av härstamning.Däremot uttryckte GFP-positiva celler i choroid plexus låga mTomato. I de flesta andra hjärnregioner uttrycktes tomatsignaler på låg nivå över de flesta celltyper med endotelceller som några av de enda cellerna vars fluorescerande signal var tillräckligt ljus för att sticka ut tydligt från hjärnvävnadens röda fluorescerande bakgrund. Det viktigaste att komma ihåg är att den fluorescerande signalen i rensade hjärnor bleknar snabbare än de flesta andra immunanalyser.Kom ihåg att avbilda dina prover så snart som möjligt och inom sju dagar. Därefter kan avbildning av hjärnskivorna eller klara hjärnor, färgläggning av markörer med GFP-signalerna och vår kvantifiering av Fluorence utföras med hjälp av program.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay

Isolering och utvidgning av den vuxna Mouse neurala stamceller Använda Neurosphere analys

Isolation and expansion of the putative neural stem cells (NSCs) from the adult murine brain was first described by Reynolds and Weiss in 1992 employing a ...

Growing Neural Stem Cells from Conventional and Nonconventional Regions of the Adult Rodent Brain

Växande neurala stamceller från konventionella och icke-konventionella Regioner av vuxen Gnagare Brain

Recent work demonstrates that central nervous system (CNS) regeneration and tumorigenesis involves populations of stem cells (SCs) resident within the ...

Electrophysiological Recording in the Brain of Intact Adult Zebrafish

Elektrofysiologiska inspelning i hjärnan i Intact vuxna zebrafisk

Previously, electrophysiological studies in adult zebrafish have been limited to slice preparations or to eye cup preparations and electrorentinogram ...

Assessing Cell Cycle Progression of Neural Stem and Progenitor Cells in the Mouse Developing Brain after Genotoxic Stress

Uppskatta cellcykelprogression av neurala stam och progenitorceller i musen framkallande hjärnan efter genotoxisk stress

Neurons of the cerebral cortex are generated during brain development from different types of neural stem and progenitor cells (NSPC), which form a ...

Lineage-reprogramming of Pericyte-derived Cells of the Adult Human Brain into Induced Neurons

Lineage-omprogrammering av Pericyte-härledda celler i den vuxna mänskliga hjärnan i inducerade Nervceller

Direct lineage-reprogramming of non-neuronal cells into induced neurons (iNs) may provide insights into the molecular mechanisms underlying neurogenesis ...

Conditional Genetic Transsynaptic Tracing in the Embryonic Mouse Brain

Villkorlig Genetisk transsynaptisk Tracing i embryonal Mouse Brain

Anatomical path tracing is of pivotal importance to decipher the relationship between brain and behavior. Unraveling the formation of neural circuits ...

Laser-guided Neuronal Tracing In Brain Explants

Laserstyrda Neuronal spårning i Brain Explantat

We present a technique which combines an in vitro tracer injection protocol, which uses a series of electrical and pressure pulses to increase dye uptake ...

Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Mouse Subcallosal Zone

Isolering och kultur av vuxna neurala stamceller från mus Subcallosal Zone

Adult neural stem cells (aNSCs) can be used for the regeneration of damaged brain tissue. NSCs have the potential for differentiation and proliferation ...

An In Vivo Blood-brain Barrier Permeability Assay in Mice Using Fluorescently Labeled Tracers

An In Vivo Blood-brain Barrier Permeability Assay in Mice Using Fluorescently Labeled Tracers

En In Vivo blod - hjärnbarriären permeabilitet test på möss med Fluorescently märkt spårämnen

Blood-brain barrier (BBB) is a specialized barrier that protects the brain microenvironment from toxins and pathogens in the circulation and maintains ...

Intra-Arterial Delivery of Neural Stem Cells to the Rat and Mouse Brain: Application to Cerebral Ischemia

Intra-arteriell leverans av neurala stamceller till råtta och mus hjärnan: Ansökan till cerebral ischemi

Neural stem cell (NSC) therapy is an emerging innovative treatment for stroke, traumatic brain injury and neurodegenerative disorders. As compared to ...