Name: lineage tracing of inducible fluorescently-labeled stem cells in the adult mouse brain
Uploaded: 2022-05-20T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Lineage Tracing of Inducible Fluorescently-Labeled Stem Cells in the Adult Mouse Brain at JoVE.com

Yazarlar Dr. Diana Carlone (Boston Çocuk Hastanesi, Harvard Tıp Fakültesi) ve Dr. Matthew Lynes'e (Joslin Diyabet Merkezi; Maine Tıp Merkezi Araştırma Enstitüsü) mTert-rtTA hayvanlarını kullanarak rehberlik için.

Burada açıklanan tüm yöntemler, Ohio State Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır.
1. Deneysel kohort fareler için Tet-On fare çizgisini izleyen bir soy izleme, üreme stratejileri ve genotipleme oluşturulması
NOT: Burada, Cre rekombinasyonuna tabi tutulan floresan muhabir geni olarak Rosa-mTmG ile bir Tet-On fare sisteminin oluşturulmasını özetliyoruz, ancak Tet-On sistemi ile b...

     

Yetişkin fare beynindeki kök hücreleri in vivo olarak işaretleyen üçlü transgenik soy izleme fare çizgisinin oluşturulması, kullanılması ve analizi için bir yöntem açıklanmaktadır. İmmün boyama veya beyin temizliği ile birleştirildiğinde, beyindeki izlenen floresan hücrelerin tanımlanması ve karakterizasyonu gerçekleştirilebilir. Bu teknik, etiketli kök hücrelerin aktive olurken, göç ederken, farklılaşırken veya çoğalırken plastik / rejeneratif / yeniden şekillenme potansiye...

Soy izleme fare çizgisinin değeri Kök hücrelerin in vivo analizi zor olabilir, çünkü bu tür hücreleri inceleyen birçok tahlil, yalnızca hayvanın ölümü sırasında bu hücreleri karakterize etmeye odaklanır ve bu da zaman içinde bir terminal anlık görüntüsünü temsil eder. Progenitör, ara / geçiş hücre tipleri ve olgun hücrelerin zaman içinde proliferasyon, farklılaşma ve göç süreçlerini daha iyi anlamak için uzunlamasına bir analiz yaklaşımı gereklidir. Bu, kök / progenitör hücrelerin silinmez bir şekilde işaretlendiği ve daha sonra herhangi bir süre boyunca takip edilebileceği soy izleme çalışmaları ile sağlanabilir1.
Yetişkin memeli beyninde, yetişkin doğumlu nöronların kök ve progenitör hücrelerden yaratıldığı nörogenez süreci ilk olarak timidin-H 32,3,4 veya 5-bromo-2'-deoksiüridin (BrdU) ile etiket retansiyonu yoluyla analiz edilmiştir5,6,7,8 . Bu çalışmalarda, proliferatif hücreler, replikasyon ve hücre bölünmesi / proliferasyonu sırasında hücrelerin DNA'sına dahil edilen timin analoğu ile işaretlenmiştir. İşaretli hücre ve onların soyları, bu nedenle, daha sonra ölüm sonrası tanımlanan bu analogu içeriyordu. Bununla birlikte, timidin-H3 ve BrdU, kök hücrelerin yeterince anlaşılmadığı beyin bölgelerinde proliferatif hücrelerin ve soylarının işaretlenmesine izin verirken, bu çalışmalar bu araçların dezavantajları tarafından engellenmiştir. Timidin-H3, hücre döngüsü arresti, apoptozu ve doza bağımlı DNA sentezi inhibisyonunu inhibe 9'a indüklerken, BrdU, uygulama yoluna bağlı olarak hücreleri10 olarak değiştirir ve onarım veya apoptoz sırasında ve ayrıca hücre bölünmesi sırasında hücreler tarafından alınır11. Son zamanlarda 5-etinil-2'-deoksiüridin (EdU) ile etiketleme gibi daha verimli etiketleme yöntemleri kullanılmıştır, ancak BrdU ile aynı sorunların çoğu hala12 olarak kalmaktadır. Bu yaklaşımlar, sadece kök hücreleri değil, herhangi bir proliferatif hücreyi işaretlemeleri açısından da sınırlayıcıdır ve bu nedenle sonuçların yorumlanması karıştırılabilir. Nörojenik soyda, tüm kök ve progenitör hücreler mitotik kapasiteyi korur ve sadece terminal / olgun nöronlar proliferatif değildir. Astrositler ve mikroglia için, ancak oligodendrositler için değil, proliferasyon süresiz olarak korunur13,14,15.
Burada kullandığımız yetişkin kök hücreleri tanımlamak için onaylanan gibi, yalnızca ilgilenilen bir proteini ifade eden hücreleri izlemek için kullanılan transgenik fareler, bu nedenle kök hücreleri ve soylarını araştırırken daha yaygın hale gelmiştir. Fare transgenik yaklaşımlarıyla üretilmesi zor olsa da, soy izleme fare çizgileri beyinde özel olarak işaretlenmiş hücrelerin izlenmesine izin verir ve yalnızca çoğalmaya dayanmaz. Tet-On transgenik fare sisteminde, tetrasiklin veya doksisiklin (bir tetrasiklin türevi) uygulanması, bir ters tetrasiklin transaktivatörü (rtTA) ile tasarlanmış hücrelerde Cre-rekombinaz ekspresyonunu indükler. Tet ile indüklenebilir Cre-driven rekombinasyon, kullanılan Rosa-reporter faresine bağlı olarak, ilgili hücrelerde silinmez bir floresan veya ışıldayan proteinin ekspresyonunu aktive edecektir. Bu silinmez şekilde işaretlenmiş hücreler, bölünme, farklılaşma veya göçten sonra bu muhabiri ifade etmeye devam ederek, bu hücrelerin ve soylarının zaman içinde veya farklı müdahalelerden sonra izlenmesine izin verir16. Transgenik soy izleme yaklaşımlarının avantajları şunlardır: 1) rtTA ile işaretlenmiş belirli bir hücre soyuna veya progenitör / kök hücreye izlemenin özgüllüğü, 2) hücre döngüsüne veya farklılaşmasına rağmen floresan veya ışıldayan proteinin silinmez ifadesi, 3) düşük toksisite, 4) hayvanın yaşam döngüsünün herhangi bir noktasında koşullu aktivasyon ve 5) ortak tahlillerle kullanım kolaylığı, immünoboyama/immünofloresan dahil16.
Farelerde geçici olarak indüklenebilir muhabir araçlarının diğer yöntemleri, ROSA-GFP, ROSA-mTmG veya diğer floresan muhabir transgenleri ile eşleştirilebilen Cre-ERT2 farelerinin kullanımını içerir. Bu hayvanlarda, bir promotör veya arttırıcı bölge gibi hücreye özgü bir düzenleyici unsur, yalnızca tamoksifen uygulaması yoluyla aktive edilebilen Cre rekombinaz üretimini yönlendirir. Cre-ERT2 fare çizgileri, belirli hücre hatlarında Cre'nin indüksiyonuna izin verirken, tamoksifenin yetişkin nörogenezi17,18 üzerindeki etkilerini detaylandıran zengin bir bilgi birikimi vardır. Ek olarak, YFP veya CFP de dahil olmak üzere GFP veya mTmG yerine kullanılabilecek birçok ROSA-güdümlü floresan muhabir geni vardır, bu da diğer floresan dalga boylarında alternatif floresan etiketlemeye izin verecektir. Bu floresan muhabir genleri Tet-On veya Cre-ERT2 sistemleri ile kullanılabilir.
Telomeraz ters transkriptaz (TERT), holoenzim telomerazın hız sınırlayıcı bileşenidir ve hücre bölünmesi19,20 sırasında kısaltıldıktan sonra telomerleri genişletmek için çalışır. TERT, bağırsak 21,22, kemik iliği 21, karaciğer 23, yağ 24, endometriyum25,26 ve kemik 1'deki yetişkin doku kök hücrelerinin bir belirteci olarak tanımlanmıştır. Bu yetişkin kök hücrelerdeki TERT ekspresyonunun sadece telomeraz uzatıcı aktivite için mi yoksa kanonik olmayan TERT rollerini yerine getirmek için mi olduğu hala bilinmemektedir27. TERT eksprese eden sessiz yetişkin kök hücreler (qASC'ler), bu kök hücrelerin çok etkili ve kendini yenileme yeteneğinin yanı sıra aktive etme, çoğalma, farklılaşma ve göç etme potansiyellerini incelemek için transgenik soy izleme fareleri ile vücutta tanımlanmış ve izlenmiştir 1,22,23,28. Tert-rtTA transgeninin oluşturulması daha öncegerçekleştirilmiştir 1. Bu yazıda, yetişkin fare beyninde yeni bir ASC popülasyonu olarak tanımladığımız TERT + qASC'leri incelemek için bir soy izleme TERT fare çizgisinin kullanımını açıklayacağız.
Transgenik bir soy izleme fare çizgisinin oluşturulması Tet-On sistemini kullanarak soy izleme fare çizgisi oluşturmak için, fare çiftleşmesi yoluyla tek bir hayvanda üç transgen birleştirilmelidir. Birincisi, ilgilenilen genin promotörünün kontrolü altında ifade edilen bir rtTA'dır (bizimki TERT-rtTA'dır). Bu ilgi genini ifade eden bir hücrede, rtTA bu nedenle ifade edilecektir. İkincisi, hem rtTA füzyon transkriptinin hem de tetrasiklin veya doksisiklin varlığında Cre rekombinazının transkripsiyonuna izin verecek bir tetrasiklin yanıt elemanı (TRE) içeren bir oTet-Cre genidir. Tetrasiklin veya doksisiklin bir hayvana içme suyu veya chow29 yoluyla uygulanabilir. Son olarak, Cre rekombinaz bölünmesi ile aktive edilecek bir gen olmalıdır. Bu yazıda, tanımlayacağımız etiketleme geni, Cre rekombinasyonuna kadar her yerde mTomato'yu (tüm hücrelerde membran kırmızısı floresan) transkripte edecek olan Rosa26-mTmG genidir. Bununla birlikte, eğer bir hücre rtTA transkriptini ifade ederse ve tetrasiklin veya doksisiklin içeriyorsa, mDomates ve mGFP bölgeleri arasındaki bir dizi lox P bölgesinin Cre rekombinasyonu, R26 bölgesini değiştirecek ve hücrenin membran domates yerine membran EGFP (mGFP veya membran yeşil floresan) üretmesine neden olacaktır. Bu mGFP sinyalinin silinmez doğası, çoğalırken, göç ederken ve farklılaşırken hücrelerin in vivo etiketlenmesine ve izlenmesine izin verecektir. İzi takiben, hücreler standart kriyoseksiyonlarda veya daha kalın optik olarak temizlenmiş beyinlerde immünofloresan yoluyla GFP'nin ekspresyonu için analiz edilebilir.
Bu yazıda, belirli fare çizgisi olan mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmG'nin kullanımını açıklayacağız. Bu üçlü transgenik fare hattını oluşturmak için, oTet-Cre hayvanlarını (Jackson Lab suşu #006234) Rosa-mTmG hayvanlarıyla (Jackson Lab suşu #007676) çiftleştirdik ve oTet-Cre::Rosa-mTmG çift transgenik fareler oluşturduk. Bu hayvanlar, Ek Tablo 1 ve 2'de belirtilen primerler ve PCR şablonları ile genotiplendirildi. mTert-rtTA fareleri (David Breault 1 tarafından yaratılmıştır) mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmG fareleri oluşturmak için oTet-Cre::Rosa-mTmG hayvanlarıyla çiftleştirilmiştir (Şekil 1A)1,30. mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmG fare çizgisinin etki mekanizması Şekil 1B'de gösterilmiştir.
Doksisiklin indüksiyonu ve nabız kovalama tasarımı Deneyleri planlarken, hayvanın doksisiklin indüksiyonundaki yaşı, doksisiklin uygulamasının uzunluğu ("nabız" dönemi), doku toplanmasından önce doksisiklin çıkarılmasından sonraki sürenin uzunluğu ("kovalamaca" dönemi) ve bu işlemler sırasında herhangi bir müdahalenin zamanlaması dahil olmak üzere soy izleme deneylerinin sonucunu etkileyecek çeşitli faktörleri göz önünde bulundurmak önemlidir. Bu çalışma tasarımı hususları, etiketli hücreleri ve bunların soylarını deneyin sonunda anlamak için gereklidir. Süreçteki ilk adım, hayvanın ilgi yaşını ve doksisiklin uygulamasının uzunluğunu tanımlamaktır. Daha uzun nabız süreleri, daha fazla hücrenin rtTA'ya bağlı promotörün eksprese edilmesini ve daha fazla ilgi çekici hücrenin silinmez bir şekilde işaretlenmesini sağlayacaktır. İlgilenilen genin geçici ekspresyonunu sergileyen bir hücre tipi, ilgilenilen geni sürekli olarak ifade eden hücrelerden daha uzun bir nabız süresi gerektirebilir. Bununla birlikte, çalışmanın amacı, ilgilenilen hücrenin veya akut bir müdahalenin kısa vadeli etkilerini anlamaksa, nabız periyodu çok uzun olamaz, çünkü bir hücre işaretlendiğinde, nabız periyodunun geri kalanında herhangi bir sayıda değişiklikle izlenecektir. Bazı çalışmalarımızda, TERT için doğrudan muhabiri daha yakından taklit etmek için kovalamaca süresi olmayan 2 günlük bir nabız kullanılmıştır. Bunun nedeni, Rosa-mTmG geninin rekombinasyonu için minimum sürenin 2 gün31 olmasıdır.
Bir nabız kovalama deneyindeki bir sonraki temel dönem, doksisiklin ile hayvanın perfüzyonu arasındaki uzunluktur, aynı zamanda 'kovalamaca' olarak da bilinir. Farelerde doksisiklin yarı ömrü, uygulama yolundan bağımsız olarak yaklaşık 170 dakikadır ve doksisiklin indüksiyonunun çıkarıldıktan birkaç saat sonra32 artık gerçekleşmediği sonucuna varılmasına izin verir. Bununla birlikte, doksisiklin metabolizmasının yaşlı farelerde daha yavaş olduğunu ve bunun da genç hayvanlardan daha uzun etkili 'nabız' dönemlerine yol açabileceğini belirtmek önemlidir33.
Kovalama döneminde, etiketlenmiş hücreler çoğalma, farklılaşma veya göçten sonra bile etiketlenmeye devam edecektir. Bu hücrelerin soyu da etiketlenecektir. Çalışmanın amacı, nabız kovalama paradigmasının uzunluğunu şekillendirecektir. Çalışmanın amacı, bir dokunun ilgilenilen hücrelerle uzun bir süre boyunca yenilenmesini anlamaksa, uzun bir kovalamaca süresi gerekebilir. Son olarak, herhangi bir müdahalenin veya tedavinin zamanlamasına karar verilmelidir. Nabız periyodu sırasında uygulama, bu süre zarfında yaratılan herhangi bir soyu olduğu kadar ilgi genini ifade eden hücreleri de etkileyecektir, oysa kovalamaca döneminde uygulama, çoğunlukla ilgili hücrelerin soyunu etkileyebilir, ancak bu, etiketlenmiş hücrelerin ne kadar hızlı bölündüğüne veya farklılaştığına bağlı olacaktır. Kullandığımız nabız kovalama deneysel tasarımlarının örnekleri Şekil 2A'da özetlenmiştir.
Sızdıran ifade nedeniyle arka plan GFP sinyalinin olasılığının farkında olmak da önemlidir. Sızdıran ekspresyon, doksisiklin yokluğunda rtTA ve Otet dizileri arasındaki doğal bağlanma potansiyelinin ve rtTA'nın yokluğunda Otet transgeninin artık aktivitesinin bir sonucu olarak ortaya çıkar (34'te gözden geçirilmiştir). Sızdıran ifade, Tet sistemlerinin bir zayıflığını temsil eder ve sızıntı genellikle sistem için kabul edilebilir bir dezavantaj olmasına rağmen, sızdıran ifadenin Otet-DTA hayvanlarında dipteri toksini (DTA) gibi toksisiteye ve mortaliteye yol açabileceği durumlar bu sistemlerin kullanımını sınırlayabilir35.
Mikroskopi için ince kesitlerin beyin işlemesi, bölümlenmesi ve immünofloresansı Bir soy izleme deneyinden sonra farelerin beyinlerini analiz etmek için, fareler önce beyinde yüksek otofloresansa yol açabilecek kan ve CSF'yi çıkarmak için transkardiyal perfüzyon yoluyla perfüze edilmelidir. Hayvanın perfüze edilebileceği yaygın olarak kullanılan iki fiksatif vardır: Histochoice Doku Fiksatifi, glioksal fiksatif (GF) veya% 4 paraformaldehit (PFA). Glioksal fiksatörler, PFA'dan daha az çapraz bağlama ile nispeten yumuşak bir fiksasyon işlemine izin verir. Bu, doku sertliğini azaltır, antijen alma ihtiyacını azaltır ve immün boyama sırasında daha az konsantre antikor çözeltilerine izin verir. Bununla birlikte, metanol içeriyorsa, bu otofloresan36'yı arttırmaya hizmet edebilir. Öte yandan, PFA genellikle daha sağlam bir fiksasyona izin verecektir ve immün boyama sırasında antijen geri kazanımı gerekli olsa da, sadece PFA ile sabitlenmiş dokularla çalışacak antikorlar vardır ve% 4 PFA ile perfüzyon daha sonra açıklanan optik temizleme tekniği için gereklidir.
Perfüzyonu takiben, beyinlerin bir gecede perfüzyon sırasında kullanılan aynı fiksatif tipine daldırıldığı bir fiksasyon sonrası adımdır. Bu, perfüzyon sırasında tamamen sabitlenmemiş olabilecek beyin bölgelerinin düzeltilmeye devam etmesini sağlar. Daha sonra, beyinler, doku içinde buz oluşumunu önlemek için donma adımından önce mümkün olduğunca fazla su çıkarmak için fosfat tamponlu salin (PBS) içinde sakkarozda inkübe edilecektir ("kriyo-koruma"). Beyinler daha sonra işlenmek üzere herhangi bir sayıda sagital, koronal veya enine doku bölümüne kesilebilir. Hem hassasiyet hem de tekrarlanabilirlik için, kalibre edilmiş beyin bloklarının hayvanlar arasında tutarlı bregma kesimleri sağlayacak şekilde kullanılması gerekir. Beyinlerin nasıl bölümlendiğini etkileyebilecek en önemli faktör, ilgilenilen beyin bölgeleridir. Örneğin, bir sagital kesim bir doku bölümünde daha fazla beyin bölgesinin analiz edilmesine izin verebilirken, bu kesim ventriküler-subventriküler bölgenin (V-SVZ) nöro / gliojenik bölgelerinin analizine izin vermeyecektir, çünkü lateral ventrikülün lateral ve medial taraflarının bu boyutta ayırt edilmesi imkansız olacaktır ve koronal düzlemde daha iyi gözlenir. Bu, yetişkin nörogenez çalışmalarında yapılması gereken önemli bir ayrım olabilir, çünkü lateral ventrikülün lateral tarafı nörojenik V-SVZ'yi içerirken, lateral ventrikülün medial duvarı daha gliojenik bir niş37'dir.
Dokular koronal, sagital veya enine bölümlere ayrıldıktan sonra, Optimum Soğutma Sıcaklığı (OCT) gömme çözeltisi kullanılarak bloklar halinde dondurulacaktır. Burada, beyinler kuru buz ve etanol karışımı kullanılarak bu gömme malzemesi içinde dondurulur. İnce kesit analizi gerekiyorsa, bloklar bir kriyostat üzerinde dilimlenir ve gerekli aşağı akış analizine bağlı olarak pozitif yüklü cam slaytlara ince kesitler (<20 μm) olarak yapıştırılabilir. Şarj edilmemiş cam slaytlar da kullanılabilir, ancak yüksüz slaytların kullanılması, dokuların slaytlardan yapışmasına neden olabilir38. Orta kalınlıkta serbest yüzen doku kesitleri (>20 μm) gerekiyorsa, dokular serbest yüzen kesitler halinde toplanacaktır. Kalın kesitler (0.5-4 mm) gerekiyorsa, dondurulmamış beyin bölümlerinin bir vibratom ile dilimlenmesi gerekir. Slaytlardaki -20 ila -80 °C'de donma gerektiren bölümler ile 4 °C'de saklanacak serbest yüzen bölümler arasındaki depolama farklılıklarına dikkat etmek önemlidir.
Beyin temizleme ve tüm montaj immünofloresan konfokal mikroskopi Fare beynindeki soy izlenen hücrelerin daha geniş, ancak daha az ayrıntılı bir analizi istenirse, iDISCO beyin temizleme39 ve ardından immün boyama ve fayanslı z-yığını konfokal mikroskopi veya ışık tabakası mikroskobu ile beyin dokusunun daha kalın segmentlerinin kapsamlı bir analizi mümkündür. Burada, fare beyninin büyük bölümleri optik olarak temizlenecek (bir delipidasyon süreci39), bu da 1 mm'lik bir doku bölümünde floresan sinyal görüntülemeye daha iyi izin verecektir. Bu işlemin dezavantajları, yüksek otofloresan ve daha geleneksel yöntemlerle (ince kriyozasyonlar veya serbest yüzen kesitler) karşılaştırıldığında gereken artan çalışma mesafeleri nedeniyle hücre morfolojisinin yüksek çözünürlüklü görüntülerini elde etme yeteneğinin azalması ve ayrıntılı birlikte boyama analizidir. Bu nedenle, tek tek hücreleri karakterize etmeye veya analiz etmeye çalışmak yerine, birden fazla beyin bölgesinde büyük ölçekli soy izleme sonuçlarını analiz etmek için beyin temizlemeyi öneriyoruz.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Antibody diluent</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>S080983-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antigen Retrieval Solution</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>S2367</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-GFP antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A2311</td>
			<td>Use at 1:500-1:000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A18-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B6.Cg-Tg(tet0-cre)1Jaw/J</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>JAX:006234</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B6.129(Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo/J</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>JAX:007676</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blocking Solution (IHC)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>20773</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blunt needle</td>
			<td>BSTEAN</td>
			<td>X0012SYHIV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coronal brain block</td>
			<td>Braintree</td>
			<td>BS-2000C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover slip</td>
			<td>Corning</td>
			<td>2850-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat</td>
			<td>Leica</td>
			<td>CM1900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D564</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dibenzyl ether</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>33630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichloromethane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>270997</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey Serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9663</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Doxycycline Hyclate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9891</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0718</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin Sodium Salt from Porcine Mucosa</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histochoice Molecular Biology Tissue Fixative</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>H120</td>
			<td>This product has since been discontinued, but can be replaced with Glyo-Fixx (Thermo Scientific, 6764265)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen Peroxide Solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>516813</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IHC Select TBS Rinse Buffer</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>20845</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine</td>
			<td>Westward</td>
			<td>0143-95095-10</td>
			<td>This product requires a DEA license for storage and use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A452-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Slides</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milipore Block</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>20773</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting medium</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>5013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optimal Cutting Temperature Solution</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS Solution (10X)</td>
			<td>Teknova</td>
			<td>P0496</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sagittal brain block</td>
			<td>Braintree</td>
			<td>RBM-2000S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saline</td>
			<td>Braun</td>
			<td>S8004-5264</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sudan (Typogen) Black</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>199664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetrahydrofuran</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>186562</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue cartridge</td>
			<td>Simport</td>
			<td>M512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>655205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>AnaSed</td>
			<td>sc-362950Rx</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

lineage tracing of inducible fluorescently-labeled stem cells in the adult mouse brain

Yetişkin doku kök hücrelerinin davranışını ve kaderini araştırmak için bir telomeraz ters transkriptaz (Tert) soy izleme fare çizgisi, 'Tet-On' sistemi oTet-Cre faresini, Tert promotörüne bağlı yeni bir ters tetrasiklin transaktivatörü (rtTA) transgeni ile geçerek geliştirilmiştir. yetişkin beyin kök hücrelerinin yeni bir popülasyonunu işaret ediyor. Burada, tetrasiklin türevi doksisiklinin mTert-rtTA::oTet-Cre farelere uygulanması, Tert geninin promotör bölgesinin 4.4 kb'lik bir parçasını ifade eden bir hücre popülasyonunu silinmez bir şekilde işaretleyecektir. Rosa-mTmG muhabiri birleştirildiğinde, mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmG fareleri, doksisiklin tedavisi, Tert'i de ifade eden hücrelerde mDomates ekspresyonunun membran EGFP (mGFP) ile değiştirilmesine neden olana kadar membran tdTomato'yu (mTomato) eksprese edecektir. Bu nedenle, bu üçlü-transgenik soy izleme fareleri doksisiklin (TERT eksprese eden hücrelerin işaretlendiği "nabız" dönemi) aldığında, bu hücreler, Tert ekspresyonu daha sonra kaybolsa bile, doksisiklin çıkarılmasından ("kovalamaca" periyodu) sonra istenen herhangi bir süre boyunca izlenebilen, silinmez bir şekilde işaretlenmiş mGFP + hücreleri haline gelecektir. Beyinler daha sonra kök hücre aktivasyonu, proliferasyon, soy bağlılığı, çeşitli beyin nişlerine göç ve olgun hücre tiplerine farklılaşmadaki değişiklikleri yorumlamak için immünofloresan ve diğer aşağı akış uygulamaları için perfüzyonla sabitlenir ve işlenir. Bu sistemi kullanarak, herhangi bir rtTA faresi, kök hücre belirteçlerini kullanarak doksisiklin ile indüklenebilir "nabız kovalamaca" soy izleme deneyleri yapmak için oTet-Cre ve bir Rosa muhabiri ile eşleştirilebilir.

Bir floresan muhabiri olan bir Tet-On sisteminden kaynaklanan floresan sinyali, ilginin destekleyicisine ve kullanılan florofor (lar) a bağlı olarak değişmekle birlikte, bulguların mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmG hayvanlarıyla nasıl analiz edildiğini açıklayacağız. Bir nabız kovalamacasından sonra yetişkin beyinlerinin analizi, çeşitli anatomik nişler boyunca membran GFP eksprese eden hücrelerle sonuçlandı. Çeşitli hücre tipleri arasındaki floresan yoğunluğundaki fark not edilmelidir. Floresan...

Watch this Scientific Journal Video about Lineage Tracing of Inducible Fluorescently-Labeled Stem Cells in the Adult Mouse Brain at JoVE.com

Lineage Tracing of Inducible Fluorescently-Labeled Stem Cells in the Adult Mouse Brain

İndüklenebilir bir transgenik soy izleme fare çizgisi kullanarak kök hücreleri ve soylarını bir florofor ile kalıcı olarak işaretleme yeteneği, in vivo aktivasyon, proliferasyon, göç ve / veya farklılaşmanın mekansal ve zamansal analizine izin verir. Soy izleme, soy bağlılığı, müdahaleye yanıt ve çok potansiyelli hakkında yeni bilgiler ortaya çıkarabilir.

Yetişkin Fare Beynindeki İndüklenebilir Floresan Etiketli Kök Hücrelerin Soy İzi

A telomerase reverse transcriptase (Tert) lineage-tracing mouse line was developed to investigate the behavior and fate of adult tissue stem cells, by ...

Kök hücrelerin ve soylarının indüklenebilir bir transgenik soy izleme fare çizgisi ile işaretlenmesi, beyindeki yetişkin kök hücrelerin in vivo aktivasyonunun, çoğalmasının, göçünün ve / veya farklılaşmasının mekansal ve zamansal analizine izin verir. Soy izleme, soy bağlılığı, müdahalelere yanıt ve çoklu potens hakkında yeni bilgiler ortaya çıkarabilir. Transgenik soy izleme yaklaşımlarının avantajları, belirli bir hücre soyunun izlenmesinin özgüllüğünü, hücre döngüsü veya farklılaşmasından bağımsız olarak floresan proteinin silinmez ekspresyonunu, doksisilin düşük toksisitesini, koşullu aktivasyonu ve immünoboyama ve immünofloresan dahil olmak üzere soy izi dokuları üzerinde yaygın aşağı akış analizleri ile kullanım kolaylığını içerir.Yetişkin beynindeki plastisite ve hücrenin geniş anlamı nedeniyle, yetişkin kök hücrelerin karakterizasyonu ve analizi, nörodejeneratif hastalıkların, beyin plastisitesi üzerindeki metabolik etkilerin, yaşlanmanın ve diğer ilgili koşulların incelenmesi hakkında bilgi vermeye yardımcı olacaktır. Başlamak için, ılık oda sıcaklığına kaydırır ve 15 dakika boyunca buz gibi soğuk asetonla sabitler. Slaytları 1X durulama tamponunda beş dakika boyunca yıkayın, her adım arasında oda sıcaklığında dakikada 60 dönüşte çalkalayın.Nükleer antijenlerin oda sıcaklığında 10 dakika boyunca% 0.3 Triton X-100 ile ayakta durması için geçirgenleştirin. Sitoplazmik antijenlerin oda sıcaklığında 10 dakika boyunca% 0.3 Tween-20 ile ayakta durması için geçirgenleştirin. 50 ila 100 mililitre 1x DAKO Antijen Retrieval Solution içindeki slaytları 10 dakika boyunca iki kez düşük dalgada dalgalandırarak antijen alımı gerçekleştirin.Daha sonra, oda sıcaklığında beş dakika tamponla durulayın. Slaytları% 0.3 içinde inkübe edin% 70 etanol içinde% 70 etanol içinde tifojen siyahı oda sıcaklığında 20 dakika ve daha sonra durulama tamponu ile yıkayın. Doku etrafında hidrofobik bariyer çizin.Bloke edici reaktif ile 37 santigrat derecede 20 dakika boyunca bloke edin. Ve dört santigrat derecede gece boyunca antikor seyrelticisinde seyreltilmiş birincil antikor ile inkübe edin. Slaytları oda sıcaklığında 10 dakika yıkayın.Ertesi gün, Alexa Fluor sekonder antikorlarındaki bölümleri oda sıcaklığında 10 dakika boyunca inkübe edin. Daha sonra slaytları 10 dakika boyunca durulama tamponunda iki kez yıkayın. AlexaFluor 488'e konjuge edilmiş bir ila 500 anti-GFP antikorunun 100 mikrolitresinde beyin bölümlerini örtün ve endojen Fluor4'ü artırmak için gece boyunca dört santigrat derecede inkübe ederek izlenen hücreleri işaretleyin.Ertesi gün, iki kez durulama tamponu ile yıkayın. Ve sonra beş dakika boyunca akan DI suyunda yıkayın. Beş dakika boyunca mililitre 4'6-diamidino-2-fenilindol başına 100 nanogram ile karşı boyama.Daha sonra akan DI suyunda beş dakika yıkayın. Her doku bölümünün üzerine bir damla floresan güvenli montaj ortamı ekleyin ve 22 milimetre x 22 milimetrelik bir kapak kayması ile kapatın. Optimum sinyal sağlamak için montaj gününde görüntüleme önerilir.Transkardiyal perfüzyonu takiben fiksasyon ve kesitlemeye başlamak için, dört santigrat derecede gecede% 4 PFA'da sabitlenmiş beyinler. Ve sonra tekrar oda sıcaklığında bir saat boyunca. Beyinleri oda sıcaklığında iki kez bir saat boyunca 1x PBS'de yıkayın.Sagital beyin bloğunu kullanarak beyni bir milimetre kalınlığında bölümlere ayırın ve 1x PBS içeren beş mililitrelik mikro santrifüj tüplerine yerleştirin. Metanol ön işlemi için, oda sıcaklığında iki kez bir saat boyunca 1x PBS ile yıkayarak başlayın. Oda sıcaklığında bir saat boyunca% 50 metanol içinde yıkayın.Oda sıcaklığında bir saat boyunca% 80 metanol içinde yıkayın. Oda sıcaklığında bir saat, iki kez% 100 metanol içinde yıkayın. Bir gecede %20 dimetil sülfoksit ve metanol içinde %5 hidrojen peroksit ve dört santigrat derecede metanol içeren ağartıcı numuneleri.Ağartmadan sonra, numuneleri oda sıcaklığında iki kez bir saat boyunca metanol içinde yıkayın. Oda sıcaklığında iki kez% 20 dimetil sülfoksit ve metanol içinde bir saat yıkayın. Oda sıcaklığında bir saat boyunca% 80 metanol içinde yıkayın.Oda sıcaklığında bir saat boyunca% 50 metanol içinde yıkayın. PBS'de oda sıcaklığında iki kez bir saat yıkayın. PBS% 0.2Triton X-100'de oda sıcaklığında iki kez bir saat boyunca yıkayın.Temizleme beyinlerinin immünoboyaması için, numuneleri 1x PBS,% 0.2 Triton X-100,% 20 DMSO,% 20 DMSO, 0.3 molar glisin, yörüngesel bir çalkalayıcıda gece boyunca 37 santigrat derecede inkübe ederek başlayın. 1x PBS,% 0.2Triton X-100,% 10 DMSO,% 6 keçi serumunu yörüngesel bir çalkalayıcıda üç gün boyunca 37 santigrat derecede bloke edin. Numuneleri 1x PBS,% 0.2 Ara-20, mililitre başına 10 mikrogram halinde domuz mukozasından 10 mikrogram halinde 37 santigrat derecede iki kez bir saat boyunca yıkayın.Daha sonra, iki gün boyunca yörüngesel bir çalkalayıcıda 37 santigrat derecede bir ila 500 konsantrasyonda tavşan anti GFP AlexaFluor 488 içeren 1x PBS,% 0.2 Ara-20,% mililitre başına 10 mikrogram heparin,% 5 DMSO,% 3 keçi serumunda inkübe edin. Numuneleri 1x PBS,% 0.2 Tween-20'de, mililitre heparin başına 10 mikrogram ile 37 santigrat derecede bir saat boyunca yörüngesel bir çalkalayıcıda üç kez ve daha sonra iki gün boyunca günde bir kez yıkayın. Numuneleri bir mililitre% 50 Tetrahidrofuran ve suda gece boyunca inkübe edin.Numuneleri bir mililitre% 80 THF Tetrahidrofuran ve suda bir saat boyunca inkübe edin. Numuneleri% 100 Tetrahidrofuran'da bir saat boyunca iki kez inkübe edin. Numuneleri steril bir mendille kurutun ve şişenin dibine batana kadar diklorometan içinde inkübe edin.60 dakikadan fazla kuluçkaya yatmayın. Numuneleri temizlenene kadar bir mililitre dibenzil eter içinde inkübe edin. Numuneleri görüntüye hazır olana kadar oda sıcaklığında dibenzil eter içinde saklayın.İmmünoboyalı beyin bölümlerini görüntülemek için, çoklu antikorların birlikte ekspresyonunun doğrulanabileceği konfokal mikroskopi yoluyla slaytları analiz edin. HyD S hibrit dedektörlü bir Leica Stellaris beş mikroskop kullanıyoruz. Temizlenmiş beyinleri görüntülemek için, otomatik bir aşama ve otomatik döşeme işlevine sahip ters çevrilmiş bir konfokal mikroskop kullanın.Temizlenmiş bir beyin bölümünü, dibenzil etere batırılmış bir cam alt kaba düz bir şekilde yerleştirerek başlayın. Farklı beyin bölgeleri ve çeşitli hücre tipleri arasında floresan yoğunluğunda gözle görülür bir fark, soy izlenen beyinlerde bir nabız kovalama periyodunu takiben gözlenmiştir. Koroid pleksustaki koroid epitel hücreleri, kalın bir hücre zarına ve çevredeki hücrelerden kolayca ayırt edilebilen Tert pozitif hücrelerden türediklerini gösteren güçlü yeşil floresan sinyaline sahipti.Koroid pleksus stromasındaki diğer küçük hücre tipleri daha zayıf bir GFP sinyaline sahipti. Beyincikte, Bergmann glial hücreleri sepet hücrelerinden daha yüksek GFP seviyeleri ifade etti ve GFP ekspresyonundaki varyasyon da bireysel sepet hücreleri arasında mevcuttu. Koku alma ampulünün glomerüler tabakası içindeki fabrika duyusal nöron aksonları için, koku alma ampulünün glomerüler tabakasını dolduran yüksek seviyelerde GFP Koku duyusal nöron aksonları, aynı nöronlar GFP pozitif olsa bile, diğer beyin bölgelerinin çoğuna kıyasla yüksek seviyelerde membran domates veya kırmızı floresan ifade etti.Buna karşılık, koroid pleksusta GFP pozitif hücreler düşük mdomates eksprese etti. Diğer beyin bölgelerinin çoğunda, domates sinyalleri çoğu hücre tipinde düşük seviyede ifade edilir ve endotel hücreleri, floresan sinyali beyin dokusunun kırmızı floresan arka planından belirgin bir şekilde öne çıkacak kadar parlak olan tek hücrelerden bazılarıdır. Hatırlanması gereken en önemli şey, temizlenmiş beyinlerdeki floresan sinyalinin diğer immün testlerin çoğundan daha hızlı kaybolmasıdır.Numunelerinizi mümkün olan en kısa sürede ve yedi gün içinde görüntülemeyi unutmayın. Bunu takiben, beyin dilimlerinin veya berrak beyinlerin görüntülenmesi, belirteçlerin GFP sinyalleri ile renklendirilmesi ve Florans miktarımız yazılım programları kullanılarak gerçekleştirilebilir.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay

Neurosphere Testi Yetişkin Fare Nöral Kök Hücre İzolasyonu ve Genişleme

Isolation and expansion of the putative neural stem cells (NSCs) from the adult murine brain was first described by Reynolds and Weiss in 1992 employing a ...

Growing Neural Stem Cells from Conventional and Nonconventional Regions of the Adult Rodent Brain

Yetişkin Kemirgen Beyin konvansiyonel ve konvansiyonel olmayan Bölgelerinden Nöral Kök Hücreler Büyüyen

Recent work demonstrates that central nervous system (CNS) regeneration and tumorigenesis involves populations of stem cells (SCs) resident within the ...

Electrophysiological Recording in the Brain of Intact Adult Zebrafish

Sağlam Yetişkin Zebra balığı Beyin Elektrofizyolojik Kayıt

Previously, electrophysiological studies in adult zebrafish have been limited to slice preparations or to eye cup preparations and electrorentinogram ...

Assessing Cell Cycle Progression of Neural Stem and Progenitor Cells in the Mouse Developing Brain after Genotoxic Stress

Genotoksik Stres sonrası nöral kök ve Fare Gelişmekte Beyin Progenitör Hücrelerinin Değerlendirilmesi Hücre Döngüsü İlerlemesi

Neurons of the cerebral cortex are generated during brain development from different types of neural stem and progenitor cells (NSPC), which form a ...

Lineage-reprogramming of Pericyte-derived Cells of the Adult Human Brain into Induced Neurons

Kaynaklı Nöronlar içine Yetişkin İnsan Beyninin perisit türetilmiş Hücreler Lineage yeniden programlama

Direct lineage-reprogramming of non-neuronal cells into induced neurons (iNs) may provide insights into the molecular mechanisms underlying neurogenesis ...

Conditional Genetic Transsynaptic Tracing in the Embryonic Mouse Brain

Embriyonik Fare beyninde İzleme Koşullu Genetik transsinaptik

Anatomical path tracing is of pivotal importance to decipher the relationship between brain and behavior. Unraveling the formation of neural circuits ...

Laser-guided Neuronal Tracing In Brain Explants

Lazer güdümlü Nöronal İzleme Beyin Eksplantlarındaki

We present a technique which combines an in vitro tracer injection protocol, which uses a series of electrical and pressure pulses to increase dye uptake ...

Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Mouse Subcallosal Zone

Fare Subcallosal Zone İzolasyon ve Yetişkin Nöral Kök Hücre Kültürü

Adult neural stem cells (aNSCs) can be used for the regeneration of damaged brain tissue. NSCs have the potential for differentiation and proliferation ...

An In Vivo Blood-brain Barrier Permeability Assay in Mice Using Fluorescently Labeled Tracers

An In Vivo Blood-brain Barrier Permeability Assay in Mice Using Fluorescently Labeled Tracers

Vivo kan - beyin bariyerini geçirgenliği tahlil Fluorescently kullanarak farelerde izleyiciler etiketli

Blood-brain barrier (BBB) is a specialized barrier that protects the brain microenvironment from toxins and pathogens in the circulation and maintains ...

Intra-Arterial Delivery of Neural Stem Cells to the Rat and Mouse Brain: Application to Cerebral Ischemia

Nöral Kök Hücrelerin Sıçan ve Fare Beynine İntra-Arteriyel Teslimatı: Serebral İskemiye Uygulama

Neural stem cell (NSC) therapy is an emerging innovative treatment for stroke, traumatic brain injury and neurodegenerative disorders. As compared to ...