Name: high-speed human temporal bone sectioning for the assessment of covid-19-associated middle ear pathology
Uploaded: 2022-05-18T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-Speed Human Temporal Bone Sectioning for the Assessment of COVID-19-Associated Middle Ear Pathology at JoVE.com

Nous remercions Mohamed Lehar pour son aide dans ce projet. Ce travail a été partiellement soutenu par les National Institutes of Health (T32DC000027, NSA).

Ce protocole a été élaboré avec l’approbation de la CISR (IRB00250002) et conformément aux politiques institutionnelles relatives à l’utilisation de tissus humains et de matières infectieuses. Chaque donneur d’os temporel a donné son consentement écrit avant son décès, ou le consentement a été obtenu à titre posthume de la famille du donneur. Consultez le Tableau des matériaux pour plus de détails sur tous les matériaux, équipements et logiciels utilisés dans ce protocole.
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	<li>Nogueira, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+brief+history+of+otorhinolaryngology:+Otology,+laryngology+and+rhinology.">A brief history of otorhinolaryngology: Otology, laryngology and rhinology.</a> Brazilian Journal of Otorhinolaryngology. 73 (5), 693-703 (2007).</li><li>Pappas, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Otology+through+the+ages.">Otology through the ages.</a> Otolaryngology-Head and Neck Surgery. 114 (2), 173-196 (1996).</li><li>Schuknecht, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Otopathology:+The+past,+present,+and+future.">Otopathology: The past, present, and future.</a> Auris Nasus Larynx. 23, 43-45 (1996).</li><li>Monsanto, R. D. 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M., Hooper, J. E., Mostafa, H. H., Stewart, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SARS-CoV-2+virus+isolated+from+the+mastoid+and+middle+ear:+Implications+for+COVID-19+precautions+during+ear+surgery.">SARS-CoV-2 virus isolated from the mastoid and middle ear: Implications for COVID-19 precautions during ear surgery.</a> JAMA Otolaryngology - Head &amp; Neck Surgery. 146 (10), 964-966 (2020).</li><li>Cunningham, C. D., Schulte, B. A., Bianchi, L. M., Weber, P. C., Schmiedt, B. 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A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extralabyrinthine+manifestations+of+DFNA9.">Extralabyrinthine manifestations of DFNA9.</a> Journal of the Association for Research in Otolaryngology. 12 (2), 141-149 (2011).</li><li>Wu, P. Z., O'Malley, J. T., de Gruttola, V., Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-related+hearing+loss+is+dominated+by+damage+to+inner+ear+sensory+cells,+not+the+cellular+battery+that+powers+them.">Age-related hearing loss is dominated by damage to inner ear sensory cells, not the cellular battery that powers them.</a> The Journal of Neuroscience. 40 (33), 6357-6366 (2020).</li><li>Miller, M. E., Lopez, I. A., Linthicum, F. H., Ishiyama, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Connexin+26+immunohistochemistry+in+temporal+bones+with+cochlear+otosclerosis.">Connexin 26 immunohistochemistry in temporal bones with cochlear otosclerosis.</a> Annals of Otology, Rhinology &amp; Laryngology. 127 (8), 536-542 (2018).</li><li>Lopez, I. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemical+techniques+for+the+human+inner+ear.">Immunohistochemical techniques for the human inner ear.</a> Histochemistry and Cell Biology. 146 (4), 367-387 (2016).</li></ol>

La recherche sur les os temporaux humains est essentielle pour étudier la pathologie de l’oreille interne et moyenne, mais reste une entreprise exigeante en temps et en ressources. Cet article décrit une technique qui utilise une microse à diamant pour générer des coupes osseuses temporales épaisses qui peuvent être rapidement décalcifiées avant d’autres coupes afin que le temps entre la récolte des tissus et l’étude puisse être réduit de 9-10 mois à 10-14 jours. Cette technique peut réduire les ress...

La recherche sur les os temporaux humains fournit une ressource inestimable pour étudier la pathologie et la physiopathologie de l’oreille interne et moyenne. Avant le 19ème siècle, on savait peu de choses sur les maladies otologiques 1,2,3. Pour mieux comprendre les maladies otologiques et « sauver la chirurgie auditive des mains des charlatans », Joseph Toynbee (1815-1866) a développé des méthodes pour étudier les sections histologiques de l’os temporal humain3. Ce travail a été poursuivi par Adam Politzer (1835-1920) à Vienne et dans d’autres à travers l’Europe pendant le reste du 19ème siècle, qui a utilisé des sections osseuses temporales pour décrire l’histopathologie de nombreuses conditions courantes affectant l’oreille 2,3,4.
Le premier laboratoire d’os temporaux humains aux États-Unis a été ouvert en 1927 à l’hôpital Johns Hopkins, où Stacy Guild (1890-1966) a développé des méthodes de section osseuse temporale 5,6. Les méthodes développées par Guild consistaient en un processus de 9 à 10 mois qui comprenait la récolte post-mortem, la fixation, la décalcification dans l’acide nitrique, la déshydratation dans l’éthanol, l’incorporation de celloïdine, le sectionnement, la coloration et le montage. Des modifications à cette technique ont ensuite été apportées par Harold Schuknecht (1917-1996)7; toutefois, les éléments de base de ce processus demeurent essentiellement inchangés.
Les ressources importantes nécessaires pour maintenir un laboratoire d’os temporal ont représenté un défi pour la recherche sur les os temporaux et ont probablement contribué à sa popularité déclinante au cours des 30 dernières années 4,8. Une partie importante des ressources du laboratoire osseux temporal doit être consacrée au processus de préparation osseuse temporale de 9 à 10 mois. L’une des étapes les plus longues de la préparation est la décalcification de l’os temporal, qui est l’os le plus dense du corps humain. La décalcification est généralement effectuée dans l’acide nitrique ou l’acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) et prend des semaines à des mois tout en nécessitant le changement fréquent de solutions 7,9. De plus, les études urgentes de l’oreille humaine, telles que celles liées à la pandémie de COVID-19, peuvent être entravées par ce lent processus de préparation. Cet article décrit une technique de section osseuse temporale à grande vitesse qui utilise une microsevis diamantée pour générer des sections épaisses qui permettent une décalcification rapide et une analyse tissulaire dans les 10 à 14 jours suivant la récolte osseuse temporale.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anti-ACE-2 Antibody (1:50 applied dilution)</td>
			<td>Novus Biologicals</td>
			<td>SN0754</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Furin Antibody (1:250 dilution)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>EPR 14674</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-TMPRSS2 Antibody (1:1,000 dilution)</td>
			<td>Novus Biologicals</td>
			<td>NBP1-20984</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BX43 Manual System Microscope</td>
			<td>Olympus Life Science Solutions</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CBN/Diamond Hybrid Wafering Blade</td>
			<td>Pace Technologies</td>
			<td>WB-007GP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collin Mallet - 8&#39;&#39;</td>
			<td>Surgical Mart</td>
			<td>SM1517</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DS-Fi3 Microscope Camera</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual Endogenous Enzyme Block (commercial blocking solution)</td>
			<td>Dako</td>
			<td>S2003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eaosin Stain</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>548-24-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formalin solution, neutral buffered 10%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>HT501128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formical-4 Decalcifier (formic acid decalcifying solution)</td>
			<td>StatLab</td>
			<td>1214-1 GAL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin Stain</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H9627</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HRP-Conjugated Anti-Rabbit Secondary Antibody (1:100 dilution)</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>PV6119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImmPRESS HRP Horse Anti-Goat igG Detection Kit, Peroxidase (1:100 dilution)</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>MP-7405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lambotte Osteotome</td>
			<td>Surgical Mart</td>
			<td>SM1553</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metallographic PICO 155P Precision Saw</td>
			<td>Pace Technologies</td>
			<td>PICO 155P</td>
			<td>microsaw</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS Elements Software Version 4.6</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraplast Plus</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3683</td>
			<td>paraffin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Positive Charged Microscope Slides with White Frosted End</td>
			<td>Walter Products</td>
			<td>1140B15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Shandon Crytome FSE Cryostat Microtome</td>
			<td>New Life Scientific Inc.</td>
			<td>A78900104</td>
			<td>cryotome</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triology Pretreatment Solution (commercial pretreatment solution)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>920P-05</td>
			<td></td>
		</tr>		
 <tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>920P-05</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-speed human temporal bone sectioning for the assessment of covid-19-associated middle ear pathology

L’analyse histopathologique des sections osseuses temporales humaines est une technique fondamentale pour étudier la pathologie de l’oreille interne et moyenne. Les coupes osseuses temporales sont préparées par prélèvement osseux temporal post-mortem, fixation, décalcification, encastrement et coloration. En raison de la densité de l’os temporal, la décalcification est un processus long et gourmand en ressources; la préparation complète des tissus peut prendre de 9 à 10 mois en moyenne. Cela ralentit la recherche en otopathologie et entrave les études urgentes, telles que celles pertinentes pour la pandémie de COVID-19. Cet article décrit une technique de préparation et de décalcification rapides des coupes osseuses temporales pour accélérer le traitement des tissus.
Les os temporaux ont été récoltés après l’autopsie à l’aide de techniques standard et fixés dans 10% de formol. Une micro scie de précision avec deux lames diamantées a été utilisée pour couper chaque section en trois sections épaisses. Les coupes osseuses temporales épaisses ont ensuite été décalcifiées dans une solution décalcifiante pendant 7 à 10 jours avant d’être incorporées dans de la paraffine, sectionnées en sections minces (10 μm) à l’aide d’un cryotome et montées sur des lames non chargées. Les échantillons de tissus ont ensuite été déparaffinisés et réhydratés pour la coloration des anticorps (ACE2, TMPRSS2, Furin) et imagés. Cette technique a réduit le temps entre la récolte et l’analyse des tissus de 9-10 mois à 10-14 jours. La section osseuse temporale à grande vitesse peut augmenter la vitesse de la recherche en otopathologie et réduire les ressources nécessaires à la préparation des tissus, tout en facilitant les études urgentes telles que celles liées à la COVID-19.

La coloration à l’hématoxyline et à l’éosine de la muqueuse de l’oreille moyenne et de la trompe d’Eustache a montré une préservation de la muqueuse de l’oreille moyenne et du tissu sous-muqueux de l’oreille moyenne après traitement (figure 1). Les images immunohistochimiques ont montré l’expression des protéines ACE2, TMPRSS2 et Furin dans la muqueuse de l’oreille moyenne et la trompe d’Eustache (Figure 1). La présence de ces protéi...

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High-Speed Human Temporal Bone Sectioning for the Assessment of COVID-19-Associated Middle Ear Pathology

Cet article décrit une technique de section osseuse temporale humaine rapide qui utilise une micro scie à lames de diamant jumelles pour générer de fines tranches de décalcification rapide et l’analyse de l’immunohistochimie osseuse temporale.

Sectionnement osseux temporal humain à grande vitesse pour l’évaluation de la pathologie de l’oreille moyenne associée à la COVID-19

Histopathologic analysis of human temporal bone sections is a fundamental technique for studying inner and middle ear pathology. Temporal bone sections ...

Ce protocole réduit le temps de traitement osseux temporal de 9 à 10 mois à 10 à 14 jours. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet l’évaluation rapide de l’otopathologie, ce qui, dans notre cas, est pertinent pour l’évaluation de la pathologie de l’oreille moyenne associée à la COVID-19. Cette technique peut être particulièrement utile pour les études sensibles au temps de l’os temporal.À l’avenir, il pourrait être optimisé davantage pour l’étude de la pathologie de l’oreille interne. Commencez la récolte pendant l’autopsie et divisez brusquement les nerfs crâniens dans le conduit auditif interne. Faites la première incision osseuse avec l’ostéotomie parallèle et juste médiale à la partie squameuse de l’os temporal.Ensuite, effectuez la deuxième incision osseuse parallèle à la première à la bordure médiale de l’os temporal. Faites la troisième incision à trois à quatre centimètres avant et parallèlement à la crête pétreuse. Ensuite, faites la quatrième incision à peu près parallèle à la troisième à deux centimètres postérieur à la crête pétreuse.Utilisez une dissection tranchante pour libérer les tissus mous attachés le long du bord inférieur de l’échantillon et enlever l’os temporal. Après la récolte, immergez immédiatement le tissu dans 200 à 300 millilitres de formol tamponné à 10%. Ensuite, réglez une micro scie de précision avec deux lames diamantées à une distance de cinq millimètres.Pour une décalcification rapide des tissus, coupez chaque échantillon en trois sections de sorte que la section centrale de l’os temporal ait cinq millimètres d’épaisseur et que celles de chaque extrémité aient une épaisseur de trois à cinq millimètres. Placer les sections dans 200 à 300 millilitres d’EDTA de 0,37 molaire pendant sept à 10 jours à température ambiante pour le ramollissement. La coloration à l’hématoxyline et à l’éosine de la muqueuse de l’oreille moyenne et de la trompe d’Eustache a montré que le tissu est préservé après traitement à l’aide de ce protocole.Les analyses immunohistochimiques ont montré la présence d’ACE2, de sérine protéase transmembranaire et de protéines furine dans ces tissus, fournissant une racine possible pour l’infection par le SRAS-CoV2 dans l’épithélium respiratoire de l’oreille moyenne. Il est important de positionner correctement le tissu osseux temporal dans la scie à diamant. Les techniques alternatives qui peuvent être combinées avec cette méthode comprennent l’immunohistochimie pour différentes protéines, différentes taches tissulaires et la transcriptomique.Cette technique nous a permis d’évaluer rapidement la présence des protéines impliquées dans l’infection par le SRAS-CoV2 dans l’oreille moyenne pendant la pandémie de COVID-19.

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