Name: high-speed human temporal bone sectioning for the assessment of covid-19-associated middle ear pathology
Uploaded: 2022-05-18T14:00:00
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我々は、このプロジェクトに対するモハメド・レハールの支援に感謝する。この研究は、国立衛生研究所(T32DC000027、NSA)によって部分的に支援されました。

このプロトコルは、IRB(IRB00250002)の承認を得て、ヒト組織および感染性物質の使用に関する制度的方針に従って開発されました。各時間的骨ドナーは、死亡前に書面による同意を提供したか、またはドナーの家族から死後に同意を得た。このプロトコルで使用されるすべての材料、機器、およびソフトウェアの詳細については、 材料の表 を参照してください。
<p class="jove_title"...

<ol>
	<li>Nogueira, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+brief+history+of+otorhinolaryngology:+Otology,+laryngology+and+rhinology.">A brief history of otorhinolaryngology: Otology, laryngology and rhinology.</a> Brazilian Journal of Otorhinolaryngology. 73 (5), 693-703 (2007).</li><li>Pappas, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Otology+through+the+ages.">Otology through the ages.</a> Otolaryngology-Head and Neck Surgery. 114 (2), 173-196 (1996).</li><li>Schuknecht, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Otopathology:+The+past,+present,+and+future.">Otopathology: The past, present, and future.</a> Auris Nasus Larynx. 23, 43-45 (1996).</li><li>Monsanto, R. D. 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COVID-19 Personal Protective Equipment (PPE) Available from: <a target="_blank" href="https://www.cdc.gov/niosh/emres/2019_ncov_ppe.html">https://www.cdc.gov/niosh/emres/2019_ncov_ppe.html</a> (2022)</li><li>Essalmani, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinctive+roles+of+Furin+and+TMPRSS2+in+SARS-CoV-2+infectivity.">Distinctive roles of Furin and TMPRSS2 in SARS-CoV-2 infectivity.</a> Journal of Virology. 96 (8), 0012822 (2022).</li><li>Ueha, R., Kondo, K., Kagoya, R., Shichino, S., Yamasoba, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ACE2,+TMPRSS2,+and+Furin+expression+in+the+nose+and+olfactory+bulb+in+mice+and+humans.">ACE2, TMPRSS2, and Furin expression in the nose and olfactory bulb in mice and humans.</a> Rhinology. 59 (1), 105-109 (2021).</li><li>Frazier, K. M., Hooper, J. E., Mostafa, H. H., Stewart, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SARS-CoV-2+virus+isolated+from+the+mastoid+and+middle+ear:+Implications+for+COVID-19+precautions+during+ear+surgery.">SARS-CoV-2 virus isolated from the mastoid and middle ear: Implications for COVID-19 precautions during ear surgery.</a> JAMA Otolaryngology - Head &amp; Neck Surgery. 146 (10), 964-966 (2020).</li><li>Cunningham, C. D., Schulte, B. A., Bianchi, L. M., Weber, P. C., Schmiedt, B. 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A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extralabyrinthine+manifestations+of+DFNA9.">Extralabyrinthine manifestations of DFNA9.</a> Journal of the Association for Research in Otolaryngology. 12 (2), 141-149 (2011).</li><li>Wu, P. Z., O'Malley, J. T., de Gruttola, V., Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-related+hearing+loss+is+dominated+by+damage+to+inner+ear+sensory+cells,+not+the+cellular+battery+that+powers+them.">Age-related hearing loss is dominated by damage to inner ear sensory cells, not the cellular battery that powers them.</a> The Journal of Neuroscience. 40 (33), 6357-6366 (2020).</li><li>Miller, M. E., Lopez, I. A., Linthicum, F. 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ヒト側頭骨研究は、内耳および中耳の病理学を研究するために不可欠ですが、時間とリソースを大量に消費する努力のままです。この論文では、ダイヤモンドマイクロソーを使用して、組織の収穫から研究までの時間を9〜10ヶ月から10〜14日に短縮できるように、さらなる切片化の前に急速に脱灰することができる厚い側頭骨切片を生成する技術について説明します。この技術は、時間的骨処...

人間の側頭骨研究は、内耳と中耳の病理学と病態生理学を研究するための非常に貴重なリソースを提供します。19世紀以前は、耳鼻咽喉科疾患1,2,3についてはほとんど知られていなかった。耳鼻咽喉科疾患をよりよく理解し、「うんざりの手から聴覚手術を救う」ために、ジョセフ・トインビー(1815-1866)は、人間の側頭骨の組織学的切片を研究する方法を開発しました3。この研究は、19世紀の残りの期間にウィーンのアダム・ポリッツァー(1835-1920)とヨーロッパ中の他の人々によって促進され、彼らは側頭骨セクションを使用して耳に影響を与える多くの一般的な状態の組織病理学を記述しました2,3,4。
米国で最初のヒト側頭骨研究所は、1927年にジョンズホプキンス病院に開設され、ステイシーギルド(1890-1966)が側頭骨切片化の方法を開発しました5,6。ギルドが開発した方法は、死後の収穫、固定、硝酸中の脱灰、エタノール中の脱水、セロイジン埋め込み、切片化、染色、および取り付けを含む9〜10ヶ月のプロセスで構成されていました。この技術への修正は後にハロルド・シュクネヒト(1917-1996)によって行われました7;ただし、このプロセスの基本コンポーネントは基本的に変更されません。
側頭骨検査室を維持するために必要な重要なリソースは、側頭骨研究の課題を提示し、おそらく過去30年間でその人気の低下に貢献しています4,8。側頭骨検査室のリソースの大部分は、側頭骨準備の9-10ヶ月のプロセスに捧げられなければなりません。準備の最も時間のかかるステップの1つは、人体で最も密度の高い骨である側頭骨の脱灰です。脱灰は、典型的には硝酸またはエチレンジアミン四酢酸(EDTA)中で行われ、溶液7,9の頻繁な交換を必要としながら数週間から数ヶ月かかる。さらに、COVID-19パンデミックに関連するものなど、人間の耳の時間に敏感な研究は、この遅い準備プロセスによって妨げられる可能性があります。この論文では、ダイヤモンドマイクロソーを使用して厚い切片を生成し、時間的骨収穫から10〜14日以内に迅速な脱灰と組織分析を可能にする高速側頭骨切片化の技術について説明します。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anti-ACE-2 Antibody (1:50 applied dilution)</td>
			<td>Novus Biologicals</td>
			<td>SN0754</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Furin Antibody (1:250 dilution)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>EPR 14674</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-TMPRSS2 Antibody (1:1,000 dilution)</td>
			<td>Novus Biologicals</td>
			<td>NBP1-20984</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BX43 Manual System Microscope</td>
			<td>Olympus Life Science Solutions</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CBN/Diamond Hybrid Wafering Blade</td>
			<td>Pace Technologies</td>
			<td>WB-007GP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collin Mallet - 8&#39;&#39;</td>
			<td>Surgical Mart</td>
			<td>SM1517</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DS-Fi3 Microscope Camera</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual Endogenous Enzyme Block (commercial blocking solution)</td>
			<td>Dako</td>
			<td>S2003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eaosin Stain</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>548-24-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formalin solution, neutral buffered 10%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>HT501128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formical-4 Decalcifier (formic acid decalcifying solution)</td>
			<td>StatLab</td>
			<td>1214-1 GAL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin Stain</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H9627</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HRP-Conjugated Anti-Rabbit Secondary Antibody (1:100 dilution)</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>PV6119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImmPRESS HRP Horse Anti-Goat igG Detection Kit, Peroxidase (1:100 dilution)</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>MP-7405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lambotte Osteotome</td>
			<td>Surgical Mart</td>
			<td>SM1553</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metallographic PICO 155P Precision Saw</td>
			<td>Pace Technologies</td>
			<td>PICO 155P</td>
			<td>microsaw</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS Elements Software Version 4.6</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraplast Plus</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3683</td>
			<td>paraffin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Positive Charged Microscope Slides with White Frosted End</td>
			<td>Walter Products</td>
			<td>1140B15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Shandon Crytome FSE Cryostat Microtome</td>
			<td>New Life Scientific Inc.</td>
			<td>A78900104</td>
			<td>cryotome</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triology Pretreatment Solution (commercial pretreatment solution)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>920P-05</td>
			<td></td>
		</tr>		
 <tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>920P-05</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-speed human temporal bone sectioning for the assessment of covid-19-associated middle ear pathology

ヒト側頭骨切片の組織病理学的解析は、内耳および中耳の病理学を研究するための基本的な技術である。側頭骨切片は、死後側頭骨収穫、固定、脱灰、包埋、および染色によって調製される。側頭骨の密度のために、脱灰は時間がかかり、資源集約的なプロセスである。完全な組織調製には、平均して9〜10ヶ月かかることがあります。これは、耳病理学研究を遅らせ、COVID-19パンデミックに関連するような時間に敏感な研究を妨げます。この論文では、組織処理を高速化するために、側頭骨切片の迅速な調製および脱灰のための技術について述べる。
側頭骨を標準的な技術を用いて死後に採取し、10%ホルマリンで固定した。ツインダイヤモンドブレードを備えた精密マイクロソーを使用して、各セクションを3つの厚いセクションに切断しました。次いで、厚い側頭骨切片を脱灰溶液中で7〜10日間脱灰してからパラフィンに包埋し、凍結トームを用いて薄い(10μm)切片に切片化し、荷電していないスライドに取り付けた。次いで、組織サンプルを脱パラフィン処理し、抗体染色のために再水和し(ACE2、TMPRSS2、フューリン)、画像化した。この技術により、収穫から組織分析までの時間が9〜10ヶ月から10〜14日に短縮されました。高速の側頭骨切片化は、COVID-19に関連するような時間に敏感な研究を促進しながら、耳病理研究のスピードを高め、組織調製に必要なリソースを減らす可能性があります。

中耳粘膜および耳管のヘマトキシリンおよびエオジン染色は、以下の処理で中耳粘膜および中耳下組織の保存を示した(図1)。免疫組織化学的画像は、中耳粘膜および耳管内でのACE2、TMPRSS2、およびFurinタンパク質の発現を示した(図1)。中耳内のこれらのタンパク質の存在は、SARS−CoV−2が中耳内の呼吸上皮に感染し得る経路を提供する1...

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High-Speed Human Temporal Bone Sectioning for the Assessment of COVID-19-Associated Middle Ear Pathology

この記事では、ツインダイヤモンドブレードを備えたマイクロソーを使用して薄いスライスを生成し、迅速な脱灰と時間的骨免疫組織化学の分析を行う、迅速なヒト側頭骨切片化の技術について説明します。

COVID-19関連中耳病理の評価のための高速ヒト側頭骨切片化

Histopathologic analysis of human temporal bone sections is a fundamental technique for studying inner and middle ear pathology. Temporal bone sections ...

このプロトコルは、時間的骨処理の時間を9〜10ヶ月から10〜14日に短縮します。この技術の主な利点は、耳病理の迅速な評価を可能にすることであり、私たちの場合、COVID-19関連中耳病理の評価に関連する。この技術は、側頭骨の時間的感受性研究に特に有用であり得る。将来的には、内耳病理学を研究するためにさらに最適化されるかもしれない。剖検中に収穫を開始し、脳神経を内耳道に鋭く分割する。骨切り術を側頭骨の扁平上皮部分と平行に、そしてちょうど内側に骨切り込みを入れます。次いで、側頭骨の内側境界において第1に平行な第2の骨切開を行う。3回目の切開を3〜4センチメートル前部で、ペトロス隆起に平行にする。次に、第4の切開を第3の切開とほぼ平行に、ペトロス隆起の後方2センチメートルで行う。鋭い解剖を使用して、標本の下縁に沿って付着した軟部組織を解放し、側頭骨を除去する。収穫後、直ちに組織を200〜300ミリリットルの10%緩衝ホルマリンに浸す。次に、ツインダイヤモンドブレードを備えた精密マイクロソーを5ミリメートルの距離にセットします。迅速な組織脱灰のために、側頭骨の中央部が5ミリメートルの厚さであり、両端のものが3〜5ミリメートルの厚さになるように、各標本を3つの部分に切断する。切片を200〜300ミリリットルの0.37モルEDTAに入れ、軟化のために室温で7〜10日間置く。中耳粘膜および耳管のヘマトキシリンおよびエオジン染色は、このプロトコールを用いた処理後に組織が保存されることを示した。免疫組織化学的分析は、これらの組織内にACE2、膜貫通プロテアーゼセリン、およびフューリンタンパク質の存在を示し、中耳の呼吸器上皮におけるSARS-CoV2感染の可能性のある根を提供する。ダイヤモンドソー内の側頭骨組織を適切に配置することが重要です。この方法と組み合わせることができる代替技術には、異なるタンパク質、異なる組織染色、およびトランスクリプトミクスに対する免疫組織化学が含まれる。この技術により、COVID-19パンデミック中に中耳内のSARS-CoV2感染に関与するタンパク質の存在を迅速に評価することができました。

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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ヒト白血球と血小板の単離と評価のためのプロトコル：生体エネルギーと酸化バースト

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免疫・感染学

A Novel In vitro Model for Studying the Interactions Between Human Whole Blood and Endothelium

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小説<em&gt;インビトロ</em&gt;ヒト全血と内皮の間の相互作用を研究するためのモデル

The majority of all known diseases are accompanied by disorders of the cardiovascular system. Studies into the complexity of the interacting pathways ...

Super-resolution Imaging of the Natural Killer Cell Immunological Synapse on a Glass-supported Planar Lipid Bilayer

グラスサポート平面脂質二重層上のナチュラルキラー細胞免疫シナプスの超解像イメージング

The glass-supported planar lipid bilayer system has been utilized in a variety of disciplines. One of the most useful applications of this technique has ...

Assessment of the Immunomodulatory Properties of Human Mesenchymal Stem Cells (MSCs)

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ヒト間葉系幹細胞（MSC）の免疫調節特性の評価

The immunomodulatory properties of multilineage human mesenchymal stem cells (MSCs) appear to be highly relevant for clinical use towards a wide-range of ...

Magnetic Stirrer Method for the Detection of Trichinella Larvae in Muscle Samples

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Assessment of the Synaptic Interface of Primary Human T Cells from Peripheral Blood and Lymphoid Tissue

末梢血およびリンパ組織から主な人間の T 細胞のシナプスのインタ フェースの評価

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Confocal Imaging of Double-Stranded RNA and Pattern Recognition Receptors in Negative-Sense RNA Virus Infection

二本鎖 RNA と否定的な感覚の RNA のウイルス感染におけるパターン認識受容体の共焦点レーザー顕微鏡

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