Name: high-speed human temporal bone sectioning for the assessment of covid-19-associated middle ear pathology
Uploaded: 2022-05-18T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-Speed Human Temporal Bone Sectioning for the Assessment of COVID-19-Associated Middle Ear Pathology at JoVE.com

Agradecemos a Mohamed Lehar por sua ajuda com este projeto. Este trabalho foi parcialmente apoiado pelos Institutos Nacionais de Saúde (T32DC0000027, NSA).

Este protocolo foi desenvolvido com aprovação do IRB (IRB00250002) e de acordo com as políticas institucionais de uso de tecido humano e material infeccioso. Cada doador ósseo temporal forneceu consentimento por escrito antes da morte, ou o consentimento foi obtido postumamente da família do doador. Consulte a Tabela de Materiais para obter detalhes sobre todos os materiais, equipamentos e softwares utilizados neste protocolo.
1. Colheita óssea temporal</p...

<ol>
	<li>Nogueira, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+brief+history+of+otorhinolaryngology:+Otology,+laryngology+and+rhinology.">A brief history of otorhinolaryngology: Otology, laryngology and rhinology.</a> Brazilian Journal of Otorhinolaryngology. 73 (5), 693-703 (2007).</li><li>Pappas, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Otology+through+the+ages.">Otology through the ages.</a> Otolaryngology-Head and Neck Surgery. 114 (2), 173-196 (1996).</li><li>Schuknecht, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Otopathology:+The+past,+present,+and+future.">Otopathology: The past, present, and future.</a> Auris Nasus Larynx. 23, 43-45 (1996).</li><li>Monsanto, R. D. C., Pauna, H. F., Paparella, M. M., Cureoglu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Otopathology+in+the+United+States:+History,+current+situation,+and+future+perspectives.">Otopathology in the United States: History, current situation, and future perspectives.</a> Otology &amp; Neurotology. 39 (9), 1210-1214 (2018).</li><li>Crowe, S. J., Guild, S. R., Polvogt, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Observations+on+the+pathology+of+high-tone+deafness.">Observations on the pathology of high-tone deafness.</a> Journal of Nervous and Mental Disease. 80, 480 (1934).</li><li>Andresen, N. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+presbycusis+from+the+first+temporal+bone+laboratory+within+the+United+States.">Insights into presbycusis from the first temporal bone laboratory within the United States.</a> Otology &amp; Neurotology. 43 (3), 400-408 (2022).</li><li>Schuknecht, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Pathology of the Ear. , (1993).</li><li>Chole, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Labs+in+crisis:+Protecting+the+science--and+art--of+otopathology.">Labs in crisis: Protecting the science--and art--of otopathology.</a> Otology &amp; Neurotology. 31 (4), 554-556 (2010).</li><li>Nager, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Pathology of the Ear and Temporal Bone. , (1993).</li><li>. COVID-19 Personal Protective Equipment (PPE) Available from: <a target="_blank" href="https://www.cdc.gov/niosh/emres/2019_ncov_ppe.html">https://www.cdc.gov/niosh/emres/2019_ncov_ppe.html</a> (2022)</li><li>Essalmani, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinctive+roles+of+Furin+and+TMPRSS2+in+SARS-CoV-2+infectivity.">Distinctive roles of Furin and TMPRSS2 in SARS-CoV-2 infectivity.</a> Journal of Virology. 96 (8), 0012822 (2022).</li><li>Ueha, R., Kondo, K., Kagoya, R., Shichino, S., Yamasoba, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ACE2,+TMPRSS2,+and+Furin+expression+in+the+nose+and+olfactory+bulb+in+mice+and+humans.">ACE2, TMPRSS2, and Furin expression in the nose and olfactory bulb in mice and humans.</a> Rhinology. 59 (1), 105-109 (2021).</li><li>Frazier, K. M., Hooper, J. E., Mostafa, H. H., Stewart, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SARS-CoV-2+virus+isolated+from+the+mastoid+and+middle+ear:+Implications+for+COVID-19+precautions+during+ear+surgery.">SARS-CoV-2 virus isolated from the mastoid and middle ear: Implications for COVID-19 precautions during ear surgery.</a> JAMA Otolaryngology - Head &amp; Neck Surgery. 146 (10), 964-966 (2020).</li><li>Cunningham, C. D., Schulte, B. A., Bianchi, L. M., Weber, P. C., Schmiedt, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microwave+decalcification+of+human+temporal+bones.">Microwave decalcification of human temporal bones.</a> Laryngoscope. 111 (2), 278-282 (2001).</li><li>Stephenson, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemical+location+of+Na+,+K+-ATPase+&#945;1+subunit+in+the+human+inner+ear.">Immunohistochemical location of Na+, K+-ATPase &#945;1 subunit in the human inner ear.</a> Hearing Research. 400, 108113 (2021).</li><li>McCall, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extralabyrinthine+manifestations+of+DFNA9.">Extralabyrinthine manifestations of DFNA9.</a> Journal of the Association for Research in Otolaryngology. 12 (2), 141-149 (2011).</li><li>Wu, P. Z., O'Malley, J. T., de Gruttola, V., Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-related+hearing+loss+is+dominated+by+damage+to+inner+ear+sensory+cells,+not+the+cellular+battery+that+powers+them.">Age-related hearing loss is dominated by damage to inner ear sensory cells, not the cellular battery that powers them.</a> The Journal of Neuroscience. 40 (33), 6357-6366 (2020).</li><li>Miller, M. E., Lopez, I. A., Linthicum, F. H., Ishiyama, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Connexin+26+immunohistochemistry+in+temporal+bones+with+cochlear+otosclerosis.">Connexin 26 immunohistochemistry in temporal bones with cochlear otosclerosis.</a> Annals of Otology, Rhinology &amp; Laryngology. 127 (8), 536-542 (2018).</li><li>Lopez, I. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemical+techniques+for+the+human+inner+ear.">Immunohistochemical techniques for the human inner ear.</a> Histochemistry and Cell Biology. 146 (4), 367-387 (2016).</li></ol>

A pesquisa óssea temporal humana é fundamental para estudar a patologia do ouvido interno e médio, mas continua sendo um esforço intensivo de tempo e recursos. Este artigo descreve uma técnica que usa uma microsserra de diamante para gerar seções ósseas temporais espessas que podem ser rapidamente descalcificadas antes de se separarem para que o tempo da colheita de tecidos para o estudo possa ser reduzido de 9-10 meses para 10-14 dias. Essa técnica pode reduzir os recursos necessários para o processamento óss...

A pesquisa óssea temporal humana fornece um recurso inestimável para estudar a patologia e a fisiopatologia do ouvido interno e médio. Antes do século XIX, pouco se sabia sobre a doença otológica 1,2,3. Para entender melhor a doença otológica e "resgatar cirurgias aurais das mãos de charlatões", Joseph Toynbee (1815-1866) desenvolveu métodos para estudar seções histológicas do osso temporal humano3. Este trabalho foi apresentado por Adam Politzer (1835-1920) em Viena e outros em toda a Europa durante o restante do século XIX, que usou seções ósseas temporais para descrever a histopatologia de muitas condições comuns que afetam o ouvido 2,3,4.
O primeiro laboratório de osso temporal humano nos Estados Unidos foi aberto em 1927 no Hospital Johns Hopkins, onde Stacy Guild (1890-1966) desenvolveu métodos para seçãoóssea temporal 5,6. Os métodos desenvolvidos pela Guild consistia em um processo de 9 a 10 meses que incluía colheita pós-morte, fixação, decalcificação no ácido nítrico, desidratação no etanol, incorporação de celoidina, secção, coloração e montagem. Modificações nesta técnica foram posteriormente feitas por Harold Schuknecht (1917-1996)7; no entanto, os componentes básicos desse processo permanecem essencialmente inalterados.
Os recursos significativos necessários para a manutenção de um laboratório ósseo temporal apresentaram um desafio para a pesquisa óssea temporal e provavelmente contribuíram para sua popularidade em declínio nos últimos 30 anos 4,8. Uma parcela significativa dos recursos do laboratório ósseo temporal deve ser dedicada ao processo de 9-10 meses de preparação óssea temporal. Um dos passos mais demorados na preparação é a decalcificação do osso temporal, que é o osso mais denso do corpo humano. A decalcificação é tipicamente realizada em ácido nítrico ou ácido etilenodiaminetetraacético (EDTA) e leva semanas a meses, exigindo a mudança frequente das soluções 7,9. Além disso, estudos sensíveis ao tempo do ouvido humano, como os relacionados à pandemia COVID-19, podem ser dificultados por esse lento processo de preparação. Este artigo descreve uma técnica para seção óssea temporal de alta velocidade que usa uma microsaw de diamante para gerar seções grossas que permitem descalcificação rápida e análise de tecidos dentro de 10-14 dias após a colheita óssea temporal.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anti-ACE-2 Antibody (1:50 applied dilution)</td>
			<td>Novus Biologicals</td>
			<td>SN0754</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Furin Antibody (1:250 dilution)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>EPR 14674</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-TMPRSS2 Antibody (1:1,000 dilution)</td>
			<td>Novus Biologicals</td>
			<td>NBP1-20984</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BX43 Manual System Microscope</td>
			<td>Olympus Life Science Solutions</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CBN/Diamond Hybrid Wafering Blade</td>
			<td>Pace Technologies</td>
			<td>WB-007GP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collin Mallet - 8&#39;&#39;</td>
			<td>Surgical Mart</td>
			<td>SM1517</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DS-Fi3 Microscope Camera</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual Endogenous Enzyme Block (commercial blocking solution)</td>
			<td>Dako</td>
			<td>S2003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eaosin Stain</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>548-24-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formalin solution, neutral buffered 10%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>HT501128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formical-4 Decalcifier (formic acid decalcifying solution)</td>
			<td>StatLab</td>
			<td>1214-1 GAL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin Stain</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H9627</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HRP-Conjugated Anti-Rabbit Secondary Antibody (1:100 dilution)</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>PV6119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImmPRESS HRP Horse Anti-Goat igG Detection Kit, Peroxidase (1:100 dilution)</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>MP-7405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lambotte Osteotome</td>
			<td>Surgical Mart</td>
			<td>SM1553</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metallographic PICO 155P Precision Saw</td>
			<td>Pace Technologies</td>
			<td>PICO 155P</td>
			<td>microsaw</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS Elements Software Version 4.6</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraplast Plus</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3683</td>
			<td>paraffin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Positive Charged Microscope Slides with White Frosted End</td>
			<td>Walter Products</td>
			<td>1140B15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Shandon Crytome FSE Cryostat Microtome</td>
			<td>New Life Scientific Inc.</td>
			<td>A78900104</td>
			<td>cryotome</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triology Pretreatment Solution (commercial pretreatment solution)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>920P-05</td>
			<td></td>
		</tr>		
 <tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>920P-05</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-speed human temporal bone sectioning for the assessment of covid-19-associated middle ear pathology

A análise histopatológica das seções ósseas temporais humanas é uma técnica fundamental para estudar a patologia do ouvido interno e médio. As seções ósseas temporais são preparadas pela colheita óssea temporal pós-morte, fixação, decalcificação, incorporação e coloração. Devido à densidade do osso temporal, a decalcificação é um processo demorado e intensivo em recursos; a preparação completa do tecido pode levar de 9 a 10 meses em média. Isso retarda a pesquisa de otopatologia e dificulta estudos sensíveis ao tempo, como os relevantes para a pandemia COVID-19. Este artigo descreve uma técnica para a rápida preparação e descalcificação das seções ósseas temporais para acelerar o processamento tecidual.
Os ossos temporais foram colhidos após a morte usando técnicas padrão e fixados em 10% de formalina. Uma microsserra de precisão com lâminas de diamante gêmeo foi usada para cortar cada seção em três seções grossas. Seções ósseas temporais espessas foram então descalcificadas em solução decalcificante por 7-10 dias antes de serem incorporadas em parafina, seccionadas em seções finas (10 μm) usando um criotome, e montadas em slides não sobrecarregados. As amostras de tecido foram então desparafinadas e rehidratadas para coloração de anticorpos (ACE2, TMPRSS2, Furin) e imagens. Esta técnica reduziu o tempo da colheita para a análise tecidual de 9-10 meses para 10-14 dias. A seção óssea temporal de alta velocidade pode aumentar a velocidade da pesquisa de otopatologia e reduzir os recursos necessários para a preparação de tecidos, ao mesmo tempo em que facilita estudos sensíveis ao tempo, como os relacionados ao COVID-19.

A hematoxilina e a coloração de eosina da mucosa do ouvido médio e do tubo eustáquio mostraram preservação da mucosa do ouvido médio e do tecido médio submucosal após o processamento (Figura 1). Imagens imunohistoquímicas mostraram expressão das proteínas ACE2, TMPRSS2 e Furin dentro da mucosa do ouvido médio e do tubo eustáquio (Figura 1). A presença dessas proteínas dentro do ouvido médio fornece uma possível rota pela qual o SARS-CoV-2 pode ...

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High-Speed Human Temporal Bone Sectioning for the Assessment of COVID-19-Associated Middle Ear Pathology

Este artigo descreve uma técnica para seção óssea temporal humana rápida que utiliza uma microsaw com lâminas de diamante gêmeos para gerar fatias finas para descalcificação rápida e análise da imunohistoquímica óssea temporal.

Secção óssea temporal humana de alta velocidade para a avaliação da patologia do ouvido médio associada ao COVID-19

Histopathologic analysis of human temporal bone sections is a fundamental technique for studying inner and middle ear pathology. Temporal bone sections ...

Este protocolo reduz o tempo para processamento temporal ósseo de 9 para 10 meses para 10 a 14 dias. A principal vantagem dessa técnica é que permite a rápida avaliação da otopatologia, que no nosso caso é relevante para a avaliação da patologia do ouvido médio associada ao COVID-19. Esta técnica pode ser particularmente útil para estudos sensíveis ao tempo do osso temporal.No futuro, pode ser ainda mais otimizado para uso no estudo da patologia do ouvido interno. Comece a colheita durante a autópsia e divida os nervos cranianos bruscamente para o canal auditivo interno. Faça a primeira incisão óssea com o osteotome paralelo e apenas medial à porção escânica do osso temporal.Em seguida, realize a segunda incisão óssea paralela à primeira na borda medial do osso temporal. Faça a terceira incisão de três a quatro centímetros anterior e paralela à cordilheira petrosa. Em seguida, faça a quarta incisão aproximadamente paralela à terceira a dois centímetros posteriores ao cume do petroo.Use dissecção afiada para liberar o tecido mole preso ao longo da borda inferior da amostra e remover o osso temporal. Após a colheita, submerga imediatamente o tecido em 200 a 300 mililitros de formalina 10%. Em seguida, coloque uma microsserra de precisão com lâminas de diamante dupla a uma distância de cinco milímetros.Para descalcificação rápida do tecido, corte cada amostra em três seções de tal forma que a seção central do osso temporal tem cinco milímetros de espessura e as de cada extremidade têm de três a cinco milímetros de espessura. Coloque as seções em 200 a 300 mililitros de 0,37-molar EDTA por sete a 10 dias em temperatura ambiente para amaciamento. A hematoxilina e a coloração de eosina da mucosa do ouvido médio e do tubo eustáquio mostraram que o tecido é preservado após o processamento usando este protocolo.Análises imunohistoquímicas mostraram a presença de proteínas ACE2, transmembrana protease e furina dentro desses tecidos, fornecendo uma possível raiz para a infecção por SARS-CoV2 no epitélio respiratório do ouvido médio. É importante posicionar adequadamente o tecido ósseo temporal dentro da serra de diamante. Técnicas alternativas que podem ser combinadas com este método incluem imunohistoquímica para diferentes proteínas, diferentes manchas de tecido e transcriptômica.Esta técnica nos permitiu avaliar rapidamente a presença das proteínas envolvidas na infecção pelo SARS-CoV2 no ouvido médio durante a pandemia COVID-19.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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