Name: high-speed human temporal bone sectioning for the assessment of covid-19-associated middle ear pathology
Uploaded: 2022-05-18T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-Speed Human Temporal Bone Sectioning for the Assessment of COVID-19-Associated Middle Ear Pathology at JoVE.com

Мы благодарим Мохамеда Лехара за его помощь в этом проекте. Эта работа была частично поддержана Национальными институтами здравоохранения (T32DC000027, NSA).

Этот протокол был разработан с одобрения IRB (IRB00250002) и в соответствии с институциональной политикой по использованию тканей человека и инфекционных материалов. Каждый донор височной кости предоставил письменное согласие перед смертью, или согласие было получено посмертно от семьи дон?...

<ol>
	<li>Nogueira, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+brief+history+of+otorhinolaryngology:+Otology,+laryngology+and+rhinology.">A brief history of otorhinolaryngology: Otology, laryngology and rhinology.</a> Brazilian Journal of Otorhinolaryngology. 73 (5), 693-703 (2007).</li><li>Pappas, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Otology+through+the+ages.">Otology through the ages.</a> Otolaryngology-Head and Neck Surgery. 114 (2), 173-196 (1996).</li><li>Schuknecht, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Otopathology:+The+past,+present,+and+future.">Otopathology: The past, present, and future.</a> Auris Nasus Larynx. 23, 43-45 (1996).</li><li>Monsanto, R. D. C., Pauna, H. F., Paparella, M. M., Cureoglu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Otopathology+in+the+United+States:+History,+current+situation,+and+future+perspectives.">Otopathology in the United States: History, current situation, and future perspectives.</a> Otology &amp; Neurotology. 39 (9), 1210-1214 (2018).</li><li>Crowe, S. J., Guild, S. R., Polvogt, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Observations+on+the+pathology+of+high-tone+deafness.">Observations on the pathology of high-tone deafness.</a> Journal of Nervous and Mental Disease. 80, 480 (1934).</li><li>Andresen, N. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+presbycusis+from+the+first+temporal+bone+laboratory+within+the+United+States.">Insights into presbycusis from the first temporal bone laboratory within the United States.</a> Otology &amp; Neurotology. 43 (3), 400-408 (2022).</li><li>Schuknecht, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Pathology of the Ear. , (1993).</li><li>Chole, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Labs+in+crisis:+Protecting+the+science--and+art--of+otopathology.">Labs in crisis: Protecting the science--and art--of otopathology.</a> Otology &amp; Neurotology. 31 (4), 554-556 (2010).</li><li>Nager, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Pathology of the Ear and Temporal Bone. , (1993).</li><li>. COVID-19 Personal Protective Equipment (PPE) Available from: <a target="_blank" href="https://www.cdc.gov/niosh/emres/2019_ncov_ppe.html">https://www.cdc.gov/niosh/emres/2019_ncov_ppe.html</a> (2022)</li><li>Essalmani, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinctive+roles+of+Furin+and+TMPRSS2+in+SARS-CoV-2+infectivity.">Distinctive roles of Furin and TMPRSS2 in SARS-CoV-2 infectivity.</a> Journal of Virology. 96 (8), 0012822 (2022).</li><li>Ueha, R., Kondo, K., Kagoya, R., Shichino, S., Yamasoba, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ACE2,+TMPRSS2,+and+Furin+expression+in+the+nose+and+olfactory+bulb+in+mice+and+humans.">ACE2, TMPRSS2, and Furin expression in the nose and olfactory bulb in mice and humans.</a> Rhinology. 59 (1), 105-109 (2021).</li><li>Frazier, K. M., Hooper, J. E., Mostafa, H. H., Stewart, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SARS-CoV-2+virus+isolated+from+the+mastoid+and+middle+ear:+Implications+for+COVID-19+precautions+during+ear+surgery.">SARS-CoV-2 virus isolated from the mastoid and middle ear: Implications for COVID-19 precautions during ear surgery.</a> JAMA Otolaryngology - Head &amp; Neck Surgery. 146 (10), 964-966 (2020).</li><li>Cunningham, C. D., Schulte, B. A., Bianchi, L. M., Weber, P. C., Schmiedt, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microwave+decalcification+of+human+temporal+bones.">Microwave decalcification of human temporal bones.</a> Laryngoscope. 111 (2), 278-282 (2001).</li><li>Stephenson, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemical+location+of+Na+,+K+-ATPase+&#945;1+subunit+in+the+human+inner+ear.">Immunohistochemical location of Na+, K+-ATPase &#945;1 subunit in the human inner ear.</a> Hearing Research. 400, 108113 (2021).</li><li>McCall, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extralabyrinthine+manifestations+of+DFNA9.">Extralabyrinthine manifestations of DFNA9.</a> Journal of the Association for Research in Otolaryngology. 12 (2), 141-149 (2011).</li><li>Wu, P. Z., O'Malley, J. T., de Gruttola, V., Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-related+hearing+loss+is+dominated+by+damage+to+inner+ear+sensory+cells,+not+the+cellular+battery+that+powers+them.">Age-related hearing loss is dominated by damage to inner ear sensory cells, not the cellular battery that powers them.</a> The Journal of Neuroscience. 40 (33), 6357-6366 (2020).</li><li>Miller, M. E., Lopez, I. A., Linthicum, F. H., Ishiyama, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Connexin+26+immunohistochemistry+in+temporal+bones+with+cochlear+otosclerosis.">Connexin 26 immunohistochemistry in temporal bones with cochlear otosclerosis.</a> Annals of Otology, Rhinology &amp; Laryngology. 127 (8), 536-542 (2018).</li><li>Lopez, I. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemical+techniques+for+the+human+inner+ear.">Immunohistochemical techniques for the human inner ear.</a> Histochemistry and Cell Biology. 146 (4), 367-387 (2016).</li></ol>

Исследование височной кости человека имеет решающее значение для изучения патологии внутреннего и среднего уха, но остается трудоемким и ресурсоемким делом. В этой статье описывается метод, который использует алмазную микропилу для создания толстых височных участков кости, которые м...

Исследование височной кости человека предоставляет бесценный ресурс для изучения патологии и патофизиологии внутреннего и среднего уха. До 19-го века мало что было известно об отологических заболеваниях 1,2,3. Чтобы лучше понять отологические заболевания и «спасение слуховой хирургии от рук шарлатанов», Джозеф Тойнби (1815-1866) разработал методы изучения гистологических участков височной кости человека3. Эта работа была продолжена Адамом Политцером (1835-1920) в Вене и других странах Европы в течение оставшейся части 19-го века, который использовал срезы височной кости для описания гистопатологии многих распространенных состояний, влияющих на ухо 2,3,4.
Первая лаборатория височной кости человека в США была открыта в 1927 году в больнице Джона Хопкинса, где Стейси Гильд (1890-1966) разработала методыразрезания височной кости 5,6. Методы, разработанные Гильдией, состояли из 9-10-месячного процесса, который включал в себя посмертный сбор, фиксацию, декальцинацию в азотной кислоте, обезвоживание в этаноле, встраивание целлоидина, секционирование, окрашивание и монтаж. Модификации этой техники были позже сделаны Гарольдом Шукнехтом (1917-1996)7; однако основные компоненты этого процесса остаются практически неизменными.
Значительные ресурсы, необходимые для поддержания лаборатории височной кости, представляли собой проблему для исследования височной кости и, вероятно, способствовали снижению ее популярности за последние 30 лет 4,8. Значительная часть лабораторных ресурсов височной кости должна быть направлена на 9-10-месячный процесс подготовки височной кости. Одним из самых трудоемких этапов подготовки является декальцификация височной кости, которая является самой плотной костью в организме человека. Декальцинация обычно выполняется в азотной кислоте или этилендиаминтетрауксусной кислоте (ЭДТА) и занимает от нескольких недель до нескольких месяцев, требуя частой смены растворов 7,9. Кроме того, чувствительные ко времени исследования человеческого уха, такие как те, которые связаны с пандемией COVID-19, могут быть затруднены этим медленным процессом подготовки. В этой статье описывается метод высокоскоростного сечения височной кости, который использует алмазную микропилу для создания толстых участков, которые позволяют быстро декальцинировать и анализировать ткани в течение 10-14 дней после сбора височной кости.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anti-ACE-2 Antibody (1:50 applied dilution)</td>
			<td>Novus Biologicals</td>
			<td>SN0754</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Furin Antibody (1:250 dilution)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>EPR 14674</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-TMPRSS2 Antibody (1:1,000 dilution)</td>
			<td>Novus Biologicals</td>
			<td>NBP1-20984</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BX43 Manual System Microscope</td>
			<td>Olympus Life Science Solutions</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CBN/Diamond Hybrid Wafering Blade</td>
			<td>Pace Technologies</td>
			<td>WB-007GP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collin Mallet - 8&#39;&#39;</td>
			<td>Surgical Mart</td>
			<td>SM1517</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DS-Fi3 Microscope Camera</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual Endogenous Enzyme Block (commercial blocking solution)</td>
			<td>Dako</td>
			<td>S2003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eaosin Stain</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>548-24-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formalin solution, neutral buffered 10%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>HT501128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formical-4 Decalcifier (formic acid decalcifying solution)</td>
			<td>StatLab</td>
			<td>1214-1 GAL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin Stain</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H9627</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HRP-Conjugated Anti-Rabbit Secondary Antibody (1:100 dilution)</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>PV6119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImmPRESS HRP Horse Anti-Goat igG Detection Kit, Peroxidase (1:100 dilution)</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>MP-7405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lambotte Osteotome</td>
			<td>Surgical Mart</td>
			<td>SM1553</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metallographic PICO 155P Precision Saw</td>
			<td>Pace Technologies</td>
			<td>PICO 155P</td>
			<td>microsaw</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS Elements Software Version 4.6</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraplast Plus</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3683</td>
			<td>paraffin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Positive Charged Microscope Slides with White Frosted End</td>
			<td>Walter Products</td>
			<td>1140B15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Shandon Crytome FSE Cryostat Microtome</td>
			<td>New Life Scientific Inc.</td>
			<td>A78900104</td>
			<td>cryotome</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triology Pretreatment Solution (commercial pretreatment solution)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>920P-05</td>
			<td></td>
		</tr>		
 <tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>920P-05</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-speed human temporal bone sectioning for the assessment of covid-19-associated middle ear pathology

Гистопатологический анализ височных костных отделов человека является фундаментальной методикой изучения патологии внутреннего и среднего уха. Срезы височной кости получают путем посмертного забора височной кости, фиксации, декальцификации, встраивания и окрашивания. Из-за плотности височной кости декальцинация является трудоемким и ресурсоемким процессом; полная подготовка тканей может занять в среднем 9-10 месяцев. Это замедляет исследования отопатологии и препятствует чувствительным ко времени исследованиям, таким как те, которые имеют отношение к пандемии COVID-19. В данной работе описывается методика быстрой подготовки и декальцификации височных костных срезов для ускорения обработки тканей.
Височные кости были собраны посмертно с использованием стандартных методов и зафиксированы в 10% формалине. Прецизионная микропила со сдвоенными алмазными лезвиями использовалась для резки каждой секции на три толстых участка. Толстые висовидные участки кости затем декальцифицировали в декальцифицирующем растворе в течение 7-10 дней, прежде чем были встроены в парафин, разделены на тонкие (10 мкм) участки с использованием криотома и установлены на незаряженных слайдах. Затем образцы тканей депарафинизировали и регидратировали для окрашивания антителами (ACE2, TMPRSS2, Furin) и визуализировали. Эта методика сократила время от сбора урожая до анализа тканей с 9-10 месяцев до 10-14 дней. Высокоскоростное срезание височной кости может увеличить скорость исследований отопатологии и уменьшить ресурсы, необходимые для подготовки тканей, а также облегчить чувствительные ко времени исследования, такие как те, которые связаны с COVID-19.

Окрашивание гематоксилином и эозином слизистой оболочки среднего уха и евстахиевой трубы показало сохранение слизистой оболочки среднего уха и подслизистой ткани среднего уха после обработки (рисунок 1). Иммуногистохимические изображения показали экспрессию белков A...

Watch this Scientific Journal Video about High-Speed Human Temporal Bone Sectioning for the Assessment of COVID-19-Associated Middle Ear Pathology at JoVE.com

High-Speed Human Temporal Bone Sectioning for the Assessment of COVID-19-Associated Middle Ear Pathology

В этой статье описывается метод быстрого среза височной кости человека, который использует микропилу с двумя алмазными лезвиями для создания тонких срезов для быстрой декальцинации и анализа иммуногистохимии височной кости.

Высокоскоростное сечение височной кости человека для оценки COVID-19-ассоциированной патологии среднего уха

Histopathologic analysis of human temporal bone sections is a fundamental technique for studying inner and middle ear pathology. Temporal bone sections ...

Этот протокол сокращает время обработки височной кости с 9 до 10 месяцев до 10-14 дней. Основным преимуществом данной методики является то, что она позволяет быстро оценить отопатологию, которая в нашем случае актуальна для оценки COVID-19-ассоциированной патологии среднего уха. Этот метод может быть особенно полезен для чувствительных ко времени исследований височной кости.В дальнейшем он может быть дополнительно оптимизирован для использования при изучении патологии внутреннего уха. Начинают сбор урожая во время вскрытия и резко делят черепные нервы на внутренний слуховой проход. Сделайте первый костный разрез с остеотомом параллельно и просто медиально плоской части височной кости.Затем выполняют второй костный разрез параллельно первому на медиальной границе височной кости. Сделайте третий разрез на три-четыре сантиметра спереди и параллельно петроусному гребню. Далее сделаем четвертый разрез примерно параллельно третьему на два сантиметра кзади петрового гребня.Используйте острое рассечение, чтобы освободить мягкие ткани, прикрепленные вдоль нижнего края образца, и удалить височную кость. После сбора урожая немедленно погружают ткань в 200-300 миллилитров 10% буферизованного формалина. Затем установите прецизионную микропилу с двумя алмазными лезвиями на расстояние до пяти миллиметров.Для быстрой декальцификации тканей разрежьте каждый образец на три части таким образом, чтобы центральная часть височной кости имела толщину пять миллиметров, а те, что на обоих концах, имели толщину от трех до пяти миллиметров. Поместите срезы в 200-300 миллилитров 0,37-молярной ЭДТА на семь-10 дней при комнатной температуре для размягчения. Окрашивание гематоксилином и эозином слизистой оболочки среднего уха и евстахиевой трубы показало, что ткань сохраняется после обработки с использованием этого протокола.Иммуногистохимические анализы показали наличие ACE2, трансмембранной протеазы серина и белков фурина в этих тканях, обеспечивая возможный корень инфекции SARS-CoV2 в респираторном эпителии среднего уха. Важно правильно расположить височную костную ткань внутри алмазной пилы. Альтернативные методы, которые могут быть объединены с этим методом, включают иммуногистохимию для различных белков, различных тканевых пятен и транскриптомики.Этот метод позволил нам быстро оценить наличие белков, участвующих в инфекции SARS-CoV2 в среднем ухе во время пандемии COVID-19.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Bioenergetics and the Oxidative Burst: Protocols for the Isolation and Evaluation of Human Leukocytes and Platelets

Биоэнергетика и окислительного: протоколах выделения и оценки человека лейкоцитов и тромбоцитов

Mitochondrial dysfunction is known to play a significant role in a number of pathological conditions such as atherosclerosis, diabetes, septic shock, and ...

A Novel In vitro Model for Studying the Interactions Between Human Whole Blood and Endothelium

A Novel In vitro Model for Studying the Interactions Between Human Whole Blood and Endothelium

Роман<em&gt; В пробирке</em&gt; Модель для изучения взаимодействия между человеческим цельной крови и эндотелия

The majority of all known diseases are accompanied by disorders of the cardiovascular system. Studies into the complexity of the interacting pathways ...

Super-resolution Imaging of the Natural Killer Cell Immunological Synapse on a Glass-supported Planar Lipid Bilayer

Супер-Resolution Imaging в естественных клеток-киллеров Иммунологические Synapse на стекло при поддержке Planar липидного бислоя

The glass-supported planar lipid bilayer system has been utilized in a variety of disciplines. One of the most useful applications of this technique has ...

Assessment of the Immunomodulatory Properties of Human Mesenchymal Stem Cells (MSCs)

Assessment of the Immunomodulatory Properties of Human Mesenchymal Stem Cells MSCs

Оценка иммуномодулирующими свойствами человеческой мезенхимальных стволовых клеток (МСК)

The immunomodulatory properties of multilineage human mesenchymal stem cells (MSCs) appear to be highly relevant for clinical use towards a wide-range of ...

Magnetic Stirrer Method for the Detection of Trichinella Larvae in Muscle Samples

Magnetic Stirrer Method for the Detection of Trichinella Larvae in Muscle Samples

Магнитная мешалка Метод обнаружения<em&gt; трихинеллы</em&gt; Личинки в мышечной Образцы

Trichinellosis is a debilitating disease in humans and is caused by the consumption of raw or undercooked meat of animals infected with the nematode ...

A Flow Cytometry-Based Cytotoxicity Assay for the Assessment of Human NK Cell Activity

На основе цитометрии цитотоксичность Assay потока для оценки активности клеток человека NK

Within the innate immune system, effector lymphocytes known as natural killer (NK) cells play an essential role in host defense against aberrant cells, ...

Assessment of the Cytotoxic and Immunomodulatory Effects of Substances in Human Precision-cut Lung Slices

Оценка цитотоксических и иммуномодулирующих эффектов веществ в легкое человека точности cut ломтики

Respiratory diseases in their broad diversity need appropriate model systems to understand the underlying mechanisms and enable development of new ...

Characterization of Human Monocyte Subsets by Whole Blood Flow Cytometry Analysis

Характеристика человека Моноцит подмножеств по цельной крови Cytometry анализ потока

Monocytes are key contributors in various inflammatory disorders and alterations to these cells, including their subset proportions and functions, can ...

Assessment of the Synaptic Interface of Primary Human T Cells from Peripheral Blood and Lymphoid Tissue

Оценка синаптических интерфейса первичного человека Т-клеток в периферической крови и лимфоидной ткани

The current understanding of the dynamics and structural features of T-cell synaptic interfaces has been largely determined through the use of ...

Confocal Imaging of Double-Stranded RNA and Pattern Recognition Receptors in Negative-Sense RNA Virus Infection

Конфокальная томография двуцепочечной РНК и шаблон признание рецепторов в отрицательной смысл РНК вируса

Double-stranded (ds) RNA is produced as a replicative intermediate during RNA virus infection. Recognition of dsRNA by host pattern recognition receptors ...