Name: single extracellular vesicle transmembrane protein characterization by nano-flow cytometry
Uploaded: 2022-07-26T14:00:00
Duration: 12 min 27 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Single Extracellular Vesicle Transmembrane Protein Characterization by Nano-Flow Cytometry at JoVE.com

ברצוננו להודות לקבוצות של אוון דייויס וניק פיק על המשך אספקת החומר והמומחיות.

1. הגדרת מכשיר nFCM ומדידות של תקני nFCM
הערה: שלוש מדידות נלקחות לפני תחילת איסוף הנתונים עבור דגימות כדי לאמת יישור נכון של מכשיר nFCM ולספק השוואה חזקה בין מכשירים. אלה הם תקן ריכוז / בקרת איכות (QC), תקן גודל, וריק.
<ol><li>לדלל את חרוזי ה-QC 1:100 במים מזוקקים בצינור מתאים של 0.6 μL ולהניח בתא הטעינה.</li>
	<li>מהתפריט הנפתח Sample Flow , בחר הגברת כדי להציג את דגימת ה- QC למערכת למשך 45 שניות כדי להחליף לחלוטין את פתרון המדגם/ניקוי הקודם.<ol><li>תוך כדי האצה, הגדר את עוצמת הלייזר לתבנית המוגדרת מראש עבור חרוזי QC "250 ננומטר FL QC סטנדרטי", למשל, 10/40 mW עבור הלייזר הכחול, 20/50 mW עבור הלייזר האדום, עם דעיכת SS של 0.2%.</li>
	</ol></li>
	<li>בחר את לחץ הדגימה מאותו תפריט למטה כדי להפחית את לחץ המערכת.</li>
	<li>הגדר את לחץ הדגימה האוטומטי ל- 1.0 kPa כדי לשמור על לחץ קבוע.</li>
	<li>התחל את הניתוח של דקה אחת על-ידי בחירה באפשרות זמן להקלטה מתוך פקדי הרכישה. הנתונים יתווו על הנקודה-מתווה המציגה סולם יומן עבור עוצמת SS ועוצמת FL שנבחרה.</li>
	<li>הוסף את שם הקובץ ואת הדילול לדוגמה לפני שמירת הקובץ.</li>
	<li>בחר לפרוק כדי להסיר את הצינור ממפרץ הטעינה. החלף עם 150 μL של תמיסת ניקוי ונקה במשך >30 שניות על-ידי בחירה באפשרות הגברת לפני הסרת תמיסת הניקוי על-ידי בחירה באפשרות בטל פריקה.<ol><li>הסר כל תמיסת ניקוי עודפת מהקצה הנימי באמצעות צינור המכיל 150 μL של מים.</li>
	</ol></li>
	<li>יש לדלל את החרוזים הסטנדרטיים בגודל 1:100 במים ולטעון 100 μL לתוך תא הטעינה, לפני הגדלת הדגימה במשך 45 שניות.</li>
	<li>הגדר את עוצמת הלייזר לתבנית המוגדרת מראש "S16 exo 68-155 nm". הגדרה זו מיועדת הן לתקן הגודל והן לדגימות המכילות כלי רכב חשמליים < 200 ננומטר. לדוגמה, 15/40 mW עבור הלייזר הכחול, 20/50 mW עבור הלייזר האדום, עם דעיכת SS של 0.2%.</li>
	<li>בחר דגימה והמשך להקליט את הדגימה למשך דקה אחת כמו קודם.</li>
	<li>בצע את המדידה השלישית עם דגימת מים או PBS כדי ליצור מדידה ריקה של ה- eluent שלך, תוך זיהוי תוצאות חיוביות כוזבות להסרה על ידי התוכנה. הזנת המדידות הסטנדרטיות מתוארת בסעיף הבא.</li>
</ol>2. קביעת ריכוז החלקיקים של דגימה ללא תווית והפקת דוח PDF
<ol><li>דלל את דגימת EV ללא תווית ב- PBS לטווח ריכוז חלקיקים מתאים לניתוח nFCM, 1 x 10 8- 5 x 108 חלקיקים /מ"ל. טען 10-100 μL של הדגימה המדוללת לתוך תא הטעינה.</li>
	<li>כאשר ריכוז החלקיקים אינו ידוע, התחל בדילול של 1:100 של דגימת EV. ריכוז הדגימה יכול להיות משוער במהירות על ידי גודל נקודת הלייזר במצלמת CCD במהלך ההאצה, או על ידי תצפית על עקבות פרץ האירוע במהלך הדגימה.</li>
	<li>שפר את הדגימה שנטענה במשך 45 שניות לפני בחירת דגימה והקלט במשך דקה אחת, תוך שמירה כפי שתואר קודם לכן.</li>
	<li>כדי להתחיל לנתח נתונים אלה, עבור מהכרטיסיה רכישה לכרטיסיה ניתוח . פתח את קבצי ה- nfa שנשמרו.</li>
	<li>כדי לאפשר מדידת דגימה מדויקת, השתמש בשתי המדידות הסטנדרטיות שבוצעו לפני מדידת הדגימה כדי להגדיר ערכים להשוואת דגימות וכן את הריק.</li>
	<li>צור את עקומת הגודל הסטנדרטית, להמרת SS לקוטר, על-ידי בחירת הקובץ הסטנדרטי של הגודל ושימוש בכלי קביעת הסף (המכונה גם סף אוטומטי). הסף, הנראה לעין בעקבות התפרצות האירוע, מזהה את עוצמת האות המינימלית הנדרשת כדי שאירוע ייחשב למשמעותי.</li>
	<li>כאשר הסף מוגדר, בדוק את הפרמטרים של מתווה נקודה x ו- y הם SS-H או SS-A בציר x ו- FITC-A בציר y.</li>
	<li>פתח את כלי יצירת העקומה הסטנדרטי ובחר S16 exo 68-155 ננומטר כתבנית הגודל. לחצו על Find Peaks כדי לזהות את עוצמות השיא של ה-SS כחלקיק בקוטר 68, 91, 113 או 155 ננומטר.</li>
	<li>בדוק אם עקומת SS לקוטר נוצרה עם ערך r קרוב ל- 1 לפני סגירת החלון.</li>
	<li>הגדר את תקן הריכוז על ידי בחירת הקובץ שנשמר ולחיצה על ספירת STD. הזן את ריכוז החלקיקים של התקן.</li>
	<li>לאחר הגדרת המידע הסטנדרטי, בחר את הקובץ לדוגמה EV והגדר את הסף.</li>
	<li>בחר את הקובץ הריק ולחץ על הגדר ריק כדי לזהות את מספר התוצאות החיוביות המוטעות להסרה מספירת הדגימות. זה צריך להיעשות עם אותו סף כמו המדגם שלך. חזור לקובץ לדוגמה של EV.</li>
	<li>פתחו את הכלי יצירת PDF ובחרו ' גודל וריכוז'. הזן את הדילולים של הדגימה. ריכוז המדגם והתפלגות הגודל של החלקיקים מוצגים.</li>
</ol>3. תיוג לדוגמה
הערה: ניתן להשתמש בשתי אסטרטגיות צביעה בו זמנית לניתוח מקיף של החלקיקים בתרחיף. פרוטוקולי תיוג דורשים לעתים קרובות אופטימיזציה עבור נוגדנים חדשים או מקורות דגימה.
<ol><li>יש לדלל חלק מדגימת EV לריכוז של 1.25 x 1010 חלקיקים/מ"ל ב-PBS. דגירה של 8 μL של דגימת EV מדוללת עם 1 μL של נוגדן ו-1 μL של צבע עבור ריכוז חלקיקים של 1 x 10 10 חלקיקים /מ"ל (סך החלקיקים יהיה 1 x 108 מרחפים ב10 μL). יחס הדגירה של הנוגדן הוא 1:50 (1 μL של נוגדן 1:5) במקרה זה.<ol><li>השתמש ביותר משלושה ריכוזים שונים של נוגדן או צבע במהלך אופטימיזציה, כדי לספק נתונים המצביעים על כך שהפרוטוקול מאפשר קשירת אפיטופ מקסימלית ללא רוויית יתר של התווית שנבחרה, מה שעלול לפגוע בזיהוי של אירועי פלואורסצנטיות בעוצמה נמוכה. ריכוז הדגירה של צבע הממברנה הוא 40 ננומטר (1 μL של 400 ננומטר).</li>
	</ol></li>
	<li>מערבבים את דגימת ה-10 μL על ידי מערבולת במשך 5 שניות ודוגרים ב-RT למשך 30 דקות בחושך. הערה: המלצות לפקדים כלולות בדיון.</li>
	<li>לאחר הדגירה, יש ליטול 1 μL מהדגימה המסומנת ולדלל 1:50 ב-PBS בצינור של 0.6 מ"ל.</li>
	<li>טען את הדגימה לתוך תא ההעמסה והפעל לחץ מגביר במשך 45 שניות. ודא שהגדרות הלייזר נכונות ושהעדשות המתאימות נטענות.</li>
	<li>עבור ללחץ דגימה ובחר זמן להקלטה. לאחר הרכישה של דקה אחת, תן שם לקובץ הנתונים ושמור.</li>
	<li>פרקו את הדגימה והחליפו בתמיסת ניקוי. הגבר זאת למשך >30 שניות לפני טעינת הדוגמה הבאה המסומנת.</li>
</ol>4. ניתוח nFCM - יצירת PDF לניתוח תת-אוכלוסייה
<ol><li>ליצירת PDF, החל את אותם סטנדרטים כפי שנעשה בעבר; רק המדידה הריקה תיקבע אחרת.</li>
	<li>בחר את הקובץ לדוגמה והגדר את הסף. בהתוויית הנקודה, שנה את ציר ה- y כדי להציג מדידות FL מהערוץ הירוק או האדום.</li>
	<li>בחרו בכלי סימון מרובע והשתמשו בלחיצה ימנית כדי לצייר ריבוע סביב אוכלוסיית FL+ .</li>
	<li>פתח את קובץ המדידה הריק ולחץ על Set Blank לפני שתחזור לקובץ לדוגמה.</li>
	<li>פתחו את כלי יצירת ה-PDF כבעבר והתפלגות הגודל, הריכוז והאחוזים (בהשוואה לכל אירועי SS+ ) מזוהים עבור תת-האוכלוסייה FL+.<ol><li>חזור על הפעולה עבור כל תת-אוכלוסייה של עניין המזוהה כ"סה"כ, P1, P2 וכו'".</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol>
	<li>Couch, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+brief+history+of+nearly+EV-erything+-+The+rise+and+rise+of+extracellular+vesicles.">A brief history of nearly EV-erything - The rise and rise of extracellular vesicles.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 10 (14), 12144 (2021).</li><li>Doyle, L. M., Wang, M. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+of+extracellular+vesicles,+their+origin,+composition,+purpose,+and+methods+for+exosome+isolation+and+analysis.">Overview of extracellular vesicles, their origin, composition, purpose, and methods for exosome isolation and analysis.</a> Cells. 8 (7), 727 (2019).</li><li>Grant, L. R., Milic, I., Devitt, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoptotic+cell-derived+extracellular+vesicles:+structure-function+relationships.">Apoptotic cell-derived extracellular vesicles: structure-function relationships.</a> Biochemical Society Transactions. 47 (2), 509-516 (2019).</li><li>Rontogianni, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+profiling+of+extracellular+vesicles+allows+for+human+breast+cancer+subtyping.">Proteomic profiling of extracellular vesicles allows for human breast cancer subtyping.</a> Communications Biology. 2, 325 (2019).</li><li>Sahoo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+and+diagnostic+translation+of+extracellular+vesicles+in+cardiovascular+diseases.">Therapeutic and diagnostic translation of extracellular vesicles in cardiovascular diseases.</a> Circulation. 143 (14), 1426-1449 (2021).</li><li>Chiang, C. -. Y., Chen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+characterizing+extracellular+vesicles+at+a+single-particle+level.">Toward characterizing extracellular vesicles at a single-particle level.</a> Journal of Biomedical Science. 26 (1), 9 (2019).</li><li>Karimi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detailed+analysis+of+the+plasma+extracellular+vesicle+proteome+after+separation+from+lipoproteins.">Detailed analysis of the plasma extracellular vesicle proteome after separation from lipoproteins.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (15), 2873-2886 (2018).</li><li>Akers, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+technologies+for+quantifying+Extracellular+Vesicles+(EVs)+in+Clinical+Cerebrospinal+Fluids+(CSF).">Comparative analysis of technologies for quantifying Extracellular Vesicles (EVs) in Clinical Cerebrospinal Fluids (CSF).</a> PLOS ONE. 11 (2), 0149866 (2016).</li><li>Bachurski, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicle+measurements+with+nanoparticle+tracking+analysis+-+An+accuracy+and+repeatability+comparison+between+NanoSight+NS300+and+ZetaView.">Extracellular vesicle measurements with nanoparticle tracking analysis - An accuracy and repeatability comparison between NanoSight NS300 and ZetaView.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 8 (1), 1596016 (2019).</li><li>Vogel, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+particle+concentration+of+multimodal+synthetic+reference+materials+and+extracellular+vesicles+with+orthogonal+techniques:+Who+is+up+to+the+challenge.">Measuring particle concentration of multimodal synthetic reference materials and extracellular vesicles with orthogonal techniques: Who is up to the challenge.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 10 (3), 12052 (2021).</li><li>Van Der Pol, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Particle+size+distribution+of+exosomes+and+microvesicles+determined+by+transmission+electron+microscopy,+flow+cytometry,+nanoparticle+tracking+analysis,+and+resistive+pulse+sensing.">Particle size distribution of exosomes and microvesicles determined by transmission electron microscopy, flow cytometry, nanoparticle tracking analysis, and resistive pulse sensing.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 12 (7), 1182-1192 (2014).</li><li>Hartjes, T. A., Mytnyk, S., Jenster, G. W., Van Steijn, V., Van Royen, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicle+quantification+and+characterization:+Common+methods+and+emerging+approaches.">Extracellular vesicle quantification and characterization: Common methods and emerging approaches.</a> Bioengineering. 6 (1), 7 (2019).</li><li>Zhao, Z., Wijerathne, H., Godwin, A. K., Soper, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+analysis+methods+of+extracellular+vesicles+(EVs).">Isolation and analysis methods of extracellular vesicles (EVs).</a> Extracellular Vesicles and Circulating Nucleic Acids. 2, 80-103 (2021).</li><li>Johnsen, K. B., Gudbergsson, J. M., Andresen, T. L., Simonsen, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+is+the+blood+concentration+of+extracellular+vesicles?+Implications+for+the+use+of+extracellular+vesicles+as+blood-borne+biomarkers+of+cancer.">What is the blood concentration of extracellular vesicles? Implications for the use of extracellular vesicles as blood-borne biomarkers of cancer.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Reviews on Cancer. 1871 (1), 109-116 (2019).</li><li>Zhu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-scattering+detection+below+the+level+of+single+fluorescent+molecules+for+high-resolution+characterization+of+functional+nanoparticles.">Light-scattering detection below the level of single fluorescent molecules for high-resolution characterization of functional nanoparticles.</a> ACS Nano. 8 (10), 10998-11006 (2014).</li><li>Van Der Pol, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardization+of+extracellular+vesicle+measurements+by+flow+cytometry+through+vesicle+diameter+approximation.">Standardization of extracellular vesicle measurements by flow cytometry through vesicle diameter approximation.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 16 (6), 1236-1245 (2018).</li><li>Lucchetti, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+extracellular+vesicles+by+conventional+flow+cytometry:+dream+or+reality.">Measuring extracellular vesicles by conventional flow cytometry: dream or reality.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (17), 6257 (2020).</li><li>Su&#225;rez, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+bead-assisted+flow+cytometry+method+for+the+semi-quantitative+analysis+of+Extracellular+Vesicles.">A bead-assisted flow cytometry method for the semi-quantitative analysis of Extracellular Vesicles.</a> Scientific Reports. 7 (1), 11271 (2017).</li><li>Tian, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+profiling+and+sizing+of+extracellular+vesicles+from+colorectal+cancer+patients+via+flow+cytometry.">Protein profiling and sizing of extracellular vesicles from colorectal cancer patients via flow cytometry.</a> ACS Nano. 12 (1), 671-680 (2018).</li><li>Silva, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+protein+cargo+loading+into+engineered+extracellular+vesicles+at+single-vesicle+and+single-molecule+resolution.">Quantification of protein cargo loading into engineered extracellular vesicles at single-vesicle and single-molecule resolution.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 10 (10), 12130 (2021).</li><li>Dragovic, R. A., Southcombe, J. H., Tannetta, D. S., Redman, C. W. G., Sargent, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicolor+flow+cytometry+and+nanoparticle+tracking+analysis+of+extracellular+vesicles+in+the+plasma+of+normal+pregnant+and+pre-eclamptic+women.">Multicolor flow cytometry and nanoparticle tracking analysis of extracellular vesicles in the plasma of normal pregnant and pre-eclamptic women.</a> Biology of Reproduction. 89 (6), 151 (2013).</li><li>Teng, F., Fussenegger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shedding+light+on+extracellular+vesicle+biogenesis+and+bioengineering.">Shedding light on extracellular vesicle biogenesis and bioengineering.</a> Advanced Science. 8 (1), 2003505 (2021).</li><li>Laulagnier, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mast+cell-+and+dendritic+cell-derived+exosomes+display+a+specific+lipid+composition+and+an+unusual+membrane+organization.">Mast cell- and dendritic cell-derived exosomes display a specific lipid composition and an unusual membrane organization.</a> Biochemical Journal. 380, 161-171 (2004).</li><li>Simonsen, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pitfalls+associated+with+lipophilic+fluorophore+staining+of+extracellular+vesicles+for+uptake+studies.">Pitfalls associated with lipophilic fluorophore staining of extracellular vesicles for uptake studies.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 8 (1), 1582237 (2019).</li><li>Collot, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MemBright:+A+family+of+fluorescent+membrane+probes+for+advanced+cellular+imaging+and+neuroscience.">MemBright: A family of fluorescent membrane probes for advanced cellular imaging and neuroscience.</a> Cell Chemical Biology. 26 (4), 600-614 (2019).</li><li>Takov, K., Yellon, D. M., Davidson, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confounding+factors+in+vesicle+uptake+studies+using+fluorescent+lipophilic+membrane+dyes.">Confounding factors in vesicle uptake studies using fluorescent lipophilic membrane dyes.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1388731 (2017).</li><li>Tian, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quality+and+efficiency+assessment+of+six+extracellular+vesicle+isolation+methods+by+nano-flow+cytometry.">Quality and efficiency assessment of six extracellular vesicle isolation methods by nano-flow cytometry.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 9 (1), 1697028 (2020).</li><li>Mondal, A., Ashiq, K. A., Phulpagar, P., Singh, D. K., Shiras, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effective+visualization+and+easy+tracking+of+extracellular+vesicles+in+glioma+cells.">Effective visualization and easy tracking of extracellular vesicles in glioma cells.</a> Biological Procedures Online. 21, 4 (2019).</li><li>Gelibter, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+storage+on+extracellular+vesicles:+A+systematic+study.">The impact of storage on extracellular vesicles: A systematic study.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 11 (2), 12162 (2022).</li><li>Jayachandran, M., Miller, V. M., Heit, J. A., Owen, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methodology+for+isolation,+identification+and+characterization+of+microvesicles+in+peripheral+blood.">Methodology for isolation, identification and characterization of microvesicles in peripheral blood.</a> Journal of Immunological Methods. 375 (1-2), 207-214 (2012).</li><li>Mizenko, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tetraspanins+are+unevenly+distributed+across+single+extracellular+vesicles+and+bias+sensitivity+to+multiplexed+cancer+biomarkers.">Tetraspanins are unevenly distributed across single extracellular vesicles and bias sensitivity to multiplexed cancer biomarkers.</a> Journal of Nanobiotechnology. 19 (1), 250 (2021).</li><li>Kowal, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+comparison+defines+novel+markers+to+characterize+heterogeneous+populations+of+extracellular+vesicle+subtypes.">Proteomic comparison defines novel markers to characterize heterogeneous populations of extracellular vesicle subtypes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (8), 968-977 (2016).</li><li>Laulagnier, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid+precursor+protein+products+concentrate+in+a+subset+of+exosomes+specifically+endocytosed+by+neurons.">Amyloid precursor protein products concentrate in a subset of exosomes specifically endocytosed by neurons.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (4), 757-773 (2018).</li><li>Simonsen, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+are+we+looking+at?+Extracellular+vesicles,+lipoproteins,+or+both.">What are we looking at? Extracellular vesicles, lipoproteins, or both.</a> Circulation Research. 121 (8), 920-922 (2017).</li><li>S&#243;dar, B. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low-density+lipoprotein+mimics+blood+plasma-derived+exosomes+and+microvesicles+during+isolation+and+detection.">Low-density lipoprotein mimics blood plasma-derived exosomes and microvesicles during isolation and detection.</a> Scientific Reports. 6, 24316 (2016).</li><li>Brennan, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+methods+for+the+isolation+and+separation+of+extracellular+vesicles+from+protein+and+lipid+particles+in+human+serum.">A comparison of methods for the isolation and separation of extracellular vesicles from protein and lipid particles in human serum.</a> Scientific Reports. 10 (1), 103 (2020).</li><li>Welton, J. L., Webber, J. P., Botos, L. -. A., Jones, M., Clayton, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ready-made+chromatography+columns+for+extracellular+vesicle+isolation+from+plasma.">Ready-made chromatography columns for extracellular vesicle isolation from plasma.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 4, 27269 (2015).</li><li>Peruzzotti-Jametti, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+stem+cells+traffic+functional+mitochondria+via+extracellular+vesicles.">Neural stem cells traffic functional mitochondria via extracellular vesicles.</a> PLOS Biology. 19 (4), 3001166 (2021).</li><li>Arab, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+extracellular+vesicles+and+synthetic+nanoparticles+with+four+orthogonal+single-particle+analysis+platforms.">Characterization of extracellular vesicles and synthetic nanoparticles with four orthogonal single-particle analysis platforms.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 10 (6), 12079 (2021).</li><li>Th&#233;ry, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimal+information+for+studies+of+extracellular+vesicles+2018+(MISEV2018):+a+position+statement+of+the+International+Society+for+Extracellular+Vesicles+and+update+of+the+MISEV2014+guidelines.">Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).</li></ol>

A.L., B.P., D.A., R.L, R.T הם עובדי NanoFCM ותרומתם למאמר זה נעשתה כחלק מהעסקתם.

פרטי דגימה ומגיב שני מבודדי EV מקווי תאים נפרדים נבחרו להדגמה של תיוג פלואורסצנטי וניתוח nFCM לאחר מכן. שתי ערכות EV הושעו ב-PBS ואוחסנו בטמפרטורה של -80°C למשך <3 חודשים, אך רוב התנאים האחרים היו שונים בין מבודדים. קו תאי המיובלסט של עכבר C2C12 מייצג מבשר עוברי לתאי שריר השלד וגודלו בתרבית דו-ממדית, תוך התניית מדיום הגידול במשך 72 שעות לפני בידוד EV על ידי אולטרה-צנטריפוגציה. SW620 הוא קו תאי אדנוקרצינומה של המעי הגס האנושי וגודל בביוריאקטור בסיסי, המעשיר את המדיה במשך 7 שבועות, עם בידוד EV שנערך על ידי כרומטוגרפיה של אי הכללת גודל (SEC) ושברים 7-9 שהושלכו מעמודות SEPHAROSE CL-2B המשולבות לדגימה אחת.
בעוד שרכבים חשמליים מבודדים ומרוכזים מ-CCM הם סוגי הדגימות שהכי קל לעבוד איתם, nFCM ישים לרוב המבודדים של EV, כולל ביופלואידים כגון סרום, פלזמה, שתן ו-CSF. ניתוחי דגימות אלה נהנים מזיהוי nFCM SS של כל החלקיקים, ומאפשרים אימות עם NTA, TRPS וניתוחי חלקיקים אחרים, תוך תיאור תת-אוכלוסיות EV המסומנות באופן פלואורסצנטי במונחים כמותיים, כמו גם חלק מהסך הכל, לגישה בלתי משוחדת של ניתוח חלקיקים מרובי פרמטרים. ניתוח של דגימות מעובדות נמוכות אפשרי גם כן, כגון שתן לא מסוכם ו- CCM מועשר ב- EV עם אזהרה של צורך בחלבון מזוהם נמוך.
צבע הממברנה המשמש כאן נועד להשתלב בדו-שכבת השומנים, עם מואטי ליפופילי להעמסת ממברנה וצבע הידרופילי להשארת קרום הפלזמה25. אין כיום צבע מושלם לתיוג EV ויש לקחת בחשבון מספר קריטריונים בעת הבחירה, כולל ספציפיות לרכבים חשמליים, התאמה עם קיבוע או חדירה, ויעילות של תיוג EV26.
תיוג נוגדנים מצומדים פלואורסצנטיים של אפיטופים שנחשפו לפני השטח הוכח כשיטה יעילה לזיהוי תת-אוכלוסיות של EV27. היבט מרכזי של אופטימיזציה של פרוטוקול הוא עמידה בנקודת הרוויה של התווית, ולא מעבר לכך, כדי להיקשר לכל האפיטופים הזמינים מבלי לעכב זיהוי של חלקיקים פלואורסצנטיים נמוכים על ידי מתן אפשרות למלא את המאגר שמסביב בנוגדן פלואורסצנטי לא מאוגד28. בנוסף, הזמינות של אתרי קשירה חשופים לסימון נוגדנים עשויה להיות מושפעת מכמה גורמים. תנאי אחסון של כלי רכב חשמליים הוכחו כמשפיעים על פרופילי הריכוז והגודל של כלי רכב חשמליים29 , כאשר תצפיות מצביעות גם על השפעות על תיוג נוגדנים30. נוכחותם של חלבוני קורונה על פני השטח, שינויים בחלבונים והשפעות של טכניקות בידוד עשויים גם הם להשפיע על תיוג הנוגדנים במקרים מסוימים. בסופו של דבר, ככל שהשימוש בתוויות פלואורסצנטיות הופך נפוץ יותר במחקרי EV, תכנון ניסויי ואופטימיזציה של טכניקות אנליטיות מרובות יהפכו למעודנים יותר.
כדי להגדיל את הדיוק של התוצאות, ניתן לכלול מספר בקרות כגון (1) PBS + בקרת צבע, כדי להעריך את היווצרות מיצלה או צבירה בצבעים מסוימים, אשר יכולים להופיע כחלקיקי SS+ בניתוח nFCM, (2) PBS + בקרת נוגדנים, אגרגטים יכולים להתרחש, אם כי לעתים קרובות לא גדולים מספיק כדי לפזר מספיק אור לזיהוי SS, (3) דגימת EV + בקרת נוגדנים IgG, נפוץ בציטומטריה של זרימה ומשמש לזיהוי כל קשירה לא ספציפית, (4) דגימת חלקיקים שאינם EV + בקרת נוגדנים / צבע - חשוב במיוחד כאשר יש צורך לזהות כלי רכב חשמליים בדגימות חלקיקים מורכבות, בקרות כגון חלקיקי ליפופרוטאין מטוהרים בצפיפות נמוכה (LDL) או דגימות מדוללות/אבלציה של EV יכולות לשמש כבקרה שלילית לאימות תיוג סלקטיבי, (5) בקרות חיוביות קשות לתכנון אך אימות נוגדן על תאים הוא הכללה שימושית.
הצגת טטרספנינים על כלי רכב חשמליים תיוג הנוגדנים והממברנות של ניסוי זה מדגים את הרמה הגבוהה של נתונים כמותיים שניתן להשיג במסגרת זמן קטנה על ידי ניתוח nFCM. מדידה סימולטנית של התכונות הפיזיקליות העיקריות של קוטר/ריכוז חלקיקים עם המדידות הפנוטיפיות של נוכחות הממברנה ו/או החלבון מובילה לתיאורים ברמה גבוהה של תת-אוכלוסיות בתוך בידוד חלקיקים.
חשוב לציין כי בשתי דגימות EV אלה זוהו רמות משתנות של שלושת הטטרספנינים הקשורים ל-EV, CD9, CD63, CD81. CD9 הוצג על החלק הגדול ביותר של כלי רכב חשמליים הן עבור כלי רכב חשמליים הנגזרים מ-C2C12 והן עבור SW620, כאשר CD81 ו-CD63 הם החלבונים השניים והפחות מוצגים, בהתאמה.
למרות כמה קווי דמיון שנצפו כאן בפרופילי הטטרספאנין של כלי רכב חשמליים משני מקורות תאים שונים מאוד, רמות של CD9, CD63 ו- CD81 יכולות להיות שונות מאוד בין קו התא לבין EVs31 שמקורם בחולה.
ההבדל בביטוי CD63 בין שתי דגימות EV רלוונטי במיוחד לדיון המתמשך במזהי מפתח של 'EV-ness'. בעוד שהצגת CD63 רק ב~8% מכלי הרכב החשמליים SW620 עשויה להיות בלתי צפויה על ידי חלקם, CD63 הוצע כמזהה גרוע של הסוגים השונים של כלי רכב חשמליים המבודדים לפי גודל או צפיפות32, ורכבים חשמליים שליליים של טטרספנין זוהו, גם כאשר הם מתוארים כאקסוזומיםדמויי 33.
זיהוי כלי רכב חשמליים בתוך בידודים מורכבים של חלקיקים ההטרוגניות של פרופילי טטרספנין EV, הן בקו התאים והן ברכבים חשמליים שמקורם בחולה, מזהירה מפני הסתמכות על לכידה מבוססת טטרספנין של כלי רכב חשמליים ומדגישה את הצורך העתידי בשיטות זיהוי EV חדשות31. תיוג EV ללא תלות בחלבונים ספציפיים עשוי להתגלות כמועיל מאוד לזיהוי כלי רכב חשמליים מחלקיקים בגודל דומה שאינם EV, אם ניתן להוכיח שספציפיות EV גבוהה מאוד. זה נכון במיוחד עבור מבודדי EV biofluid כפי שהוצע כי ריכוז של כלי רכב חשמליים בדם אנושי פלזמה הוא בטווח של 10 10 חלקיקים / מ"ל בעוד ליפופרוטאינים נמדדים ב10 16 לכל מ"ל14,34. אפילו לאחר העשרת EV, מחקרים המשווים חיוביות חלקיקים עבור סמני טטרספנין ו/או סמן LDL ApoB מציעים שפע גדול פי ~50-100 של LDL בדגימות פלזמה נטולת טסיות (PFP) בהשוואה ל- EV35.
טכניקת הבידוד המשמשת משפיעה מאוד על טווח החלקיקים שאינם EV מבודדים, כגון ליפופרוטאינים בצפיפות נמוכה מאוד (VLDL), ליפופרוטאינים בצפיפות בינונית (IDL) ו-LDL36. ישנם גם תיאורים של קו-איזולטים של ליפופרוטאינים הקשורים לרכבים חשמליים, שאמנם ממלאים תפקיד ביולוגי חשוב, אך הופכים את השגת דגימות EV טהורות למטרה מאתגרת35.
לכן, ניתן לטעון כי יש להתמקד יותר בתיאור החלקיקים המרכיבים דגימה, במקום להשיג בידוד של מבחר טהור אך מוגבל של כלי רכב חשמליים. השגת תיאור מקיף של חלקיקים על ידי מדידת שפע הטטרספאנין בכמויות גדולות וספירת חלקיקים בנפרד יכולה להיות לא מספיקה כדי לקבוע במדויק את ריכוזי הרכב החשמלי, במיוחד ממקורות ביופלואידיים36,37. זיהוי תת-אוכלוסיות בגישה מבוססת שכבות, תוך הצגת סך כל החלקיקים, כלי הרכב החשמליים והרכבים החשמליים המציגים חלבונים מסוימים, כפי שהוכח בניסוי זה, עשוי לספק פתרון חזק לאפיון ננו-חלקיקים. זה היה המקרה עבור פרויקטים הכוללים טעינת EV עם עיצובים ליישומים טיפוליים עתידיים20 וזיהוי של CD63+ EVs עם מטען לומינלי כגון מיטוכונדריה38.
nFCM בתוך הרפרטואר של ניתוח EV חוזק של ניתוח nFCM EV הוא הדרך שבה נתונים יכולים לאשש ולהתבסס על הניתוחים הנפוצים ביותר של EV וליצור גשרים בין מערכי נתונים פיזיים ופנוטיפיים. עם זאת, זה מבוסס על פרוטוקולי תיוג מדויקים שלעתים קרובות צריכים להיות מותאמים לריאגנטים ייחודיים לתיוג כגון צבעים ונוגדנים. קריטריון מרכזי לניתוח מדויק הוא תיוג חלקיקים המרחפים במאגר שאינו פלואורסצנטי, המסתמך על הסרת עודפי פלואורופור לא מאוגדים או על עידון הפרוטוקולים כך שלא יעלו על רוויית אפיטופים.
מחקרי השוואה הראו כי גודל nFCM של כלי רכב חשמליים מספק נתונים בהתאם ל-TRPS ול-cryo-TEM, טכניקות המתוארות כמדויקות יותר מ-NTA עבור ניתוח גודל EV 10,39. עם זאת, כמו בכל שיטה מבוססת אופטיקה, יש להכיר בהשפעת התכונות האופטיות ההטרוגניות הנראות עבור כלי רכב חשמליים ובהבדלים בין התכונות האופטיות של חומר ייחוס לבין כלי רכב חשמליים בעת פירוש נתונים10.
כתם מערבי היה שיטה מרכזית לציון העשרת EV באמצעות זיהוי סמני EV40. אבל הרצון להדגים את נוכחותם של סמנים כאלה על חלקיקים הניע התקדמות בניתוחים ציטומטריים של זרימה מבוססת EV17. עם זאת, ההחלטות הדרושות כדי לספק נתונים חזקים מושגות כיום בצורה הטובה ביותר באמצעות מכשור ייעודי בכל הנוגע לאור מפוזר ופלואורסצנטי19.
nFCM מספק גישה בלתי משוחדת של תיאור ראשוני של כל החלקיקים שאינם רלוונטיים לסמנים ספציפיים, על ידי שימוש במדידת פיזור צד, המאפשרת אימות עם הטכניקות הנפוצות ביותר של NTA, RPS ו- TEM1, תוך הוספת מדידה פנוטיפית הדומה ל- WB או Elisa באופן כמותי.

מהם כלי רכב חשמליים? שלפוחיות חוץ-תאיות (EVs) הן המונח הקולקטיבי למגוון חלקיקים ממברניים שמקורם בתאים, המהווים חלק בלתי נפרד מפעילויות תאיות ורקמות נורמליות רבות. השפעתם על מגוון רחב של תחומים מדעיים והרלוונטיות הקלינית הפוטנציאלית שלהם הניעו צמיחה במחקר EV ובעניין התעשייתי1. מחקר EV קטן (sEV) מתמקד בעיקר באקסוזומים, חלקיקי 40-100 ננומטר שמתחילים להיווצר באנדוזומים המוקדמים לפני ההבשלה והשחרור באמצעות איחוי של גופים רב-שלפוחיתיים (MVB) לממברנת הפלזמה, כמו גם מיקרו-ווסיקלים, הניצנים ישירות מממברנת הפלזמה ויוצרים חלקיקים של 80-1,000 ננומטר2. אוכלוסיית EV שלישית הם גופים אפופטוטיים, חלקיקים של 50-1,500 ננומטר שנוצרו במהלך מוות של תאים, כלומר חלקם היחסי לרכבים חשמליים אחרים יכול להיות משתנה מאוד3.
מכיוון שמאפייני EV עשויים לייצג שינויים המתרחשים בתא/רקמת המקור שלהם, קיים פוטנציאל לשימוש בהם באבחון. ניתוחי 'אומיקה' שונים החלו לזהות סמנים של מוצא התא ומצב המחלה, אשר עשויים לאפשר הערכה לא פולשנית של חולים באמצעות מקורות EV כגון פלזמה בדם / סרום, שתן, רוק ונוזל עמוד השדרה המוחי (CSF)4,5. הכוח המניע מאחורי חידושים אלה הקשורים לרכב חשמלי הן טכניקות אפיון חדשות המתגברות על מגבלות קודמות.
הצורך והאתגרים של אפיון EV יחיד אפיון EV יחיד הופך לחשוב יותר ויותר הן לאימות והן לתיאור של מבודדי EV, כמו גם להבהרת תכונות מפתח של ננו-חלקיקים אלה להתקדמות של טיפולים ואבחון מבוססי EV6. בהתאם למקור EV ולשימוש המיועד, ניתוח טוהר, המתואר לעתים קרובות כיחס בין EV לחלקיקים שאינם EV או כ- EV לחלבון חופשי, יכול לדרוש כמויות משמעותיות של נתונים מניתוחים מרובים7.
ספירת חלקיקים ומדידות גודל בפרסומי EV הסתמכו בעבר במידה רבה על מעקב אחר ננו-חלקיקים (NTA), חישת פולסים התנגדותיים (RPS) ומיקרוסקופיית אלקטרונים (EM)2. NTA ו-RPS סטנדרטיים חסרים את היכולת להבחין בין כלי רכב חשמליים לחלקיקים שאינם EV ויש להם אזהרות משלהם כגון תפוקה איטית8 וגבול זיהוי תחתון לא מתאים שנראה עם NTA 9,10,11.
הטטרספאנינים CD9, CD63 ו-CD81 היו בעבר מזהים חשובים לנוכחות של כלי רכב חשמליים בבידודים/הכנות לרכב חשמלי. בדרך כלל, נעשה שימוש בטכניקות של כתם מערבי (WB) וכתמי נקודות כדי להראות את ההעשרה של חלבונים אלה במבודדי EV בהשוואה לליזאט תאי12. עם זאת, היעדר הכמות לשיטות אלה וההטרוגניות של סמני EV אלה, הן לגבי התצוגה בתוך תת-אוכלוסיות EV והן לגבי וריאציות הקשורות לתאים, רקמות או מטופלים, מעודדים טכניקות אנליטיות מתקדמות, המאחדות אפיון פיזיקלי ופנוטיפי13.
ציטומטריה של זרימה ננו כטכניקת ניתוח EV מקיפה קביעת ריכוזי EV אמיתיים דורשת זיהוי של חלקיקים שלמים וסמן אוניברסלי, במיוחד במבודדי חלקיקים מורכבים, עם רזולוציה המסוגלת לזהות את כל כלי הרכב החשמליים תוך הבחנה בינם לבין חלקיקים שאינם EV14.
ציטומטריה של זרימה ננו (nFCM) היא טכניקה המאפשרת ניתוח ללא תווית של חלקיקים בגודל שבין 45-1,000 ננומטר תוך שימוש בו זמנית בתיוג וזיהוי פלואורסצנטי לזיהוי תת-אוכלוסיות של חלקיקים. הבדל מרכזי מציטומטריה של זרימה קונבנציונלית הוא השימוש בציוד המוקדש לניתוח ננו-חלקיקים, המאפשר את הרזולוציה הגדולה ביותר15. ניתוח EV, המשתמש במכשור זרימה קונבנציונלי המיועד לניתוח חלקיקים קטנים משתפר, אך עדיין מתקשה להשיג את הרזולוציה לזהות ולנתח <100 ננומטר EVs16,17. ציטומטריה של זרימה מבוססת חרוזים היא התאמה נוספת המשמשת לעתים קרובות לניתוח EV, אך פעולה זו מסירה את האפשרות של זיהוי חלקיקים בודדים ומציגה הטיות מבוססות לכידה18.
nFCM, הנהנה מגבול זיהוי נמוך יותר של ~ 45 ננומטר בערוץ הפיזור הצדדי (SS) לניתוח EV, משתמש בהפעלת SS. ניתן לחשוב על כך כניתוח 'חלקיקים ראשונים', שכן משמעות הדבר היא שאירועים חייבים לספק אות SS, העולה על סף מוגדר לפני ניתוח עוצמת הפלואורסצנציה. פעולה זו מסירה תוצאות חיוביות שגויות כגון ממברנה מושפלת וצבירות פלואורופור, וממקדת את הניתוח ברכבים חשמלייםשלמים 15. מדידות SS משמשות גם לגודל חלקיקים בודדים בהשוואה לתקן ננוספרה סיליקה בן ארבעה מודלים19. מדידות הפלואורסצנציה נלקחות על שני גלאים נוספים המאפשרים שלוש מדידות בו זמנית עבור כל חלקיק כדי לתאר את ריכוז החלקיקים, גודלם ונוכחותם של סמנים או מטרות מעניינות אחרות על מנת לזהות תת-אוכלוסיות EV20.
בניסוי הבא, מדידות SS ופלורסנט (FL) משמשות למדידת חלקיקים >45 ננומטר, להראות את תת-הקבוצה של כלי רכב חשמליים חיוביים לממברנה, ולזהות CD9, CD63, CD81 מצגת על תת-אוכלוסיות EV. הן הריכוז של תת-אוכלוסיות אלה והן היחס שלהן כחלק מסך החלקיקים שנמדדו על ידי SS מתוארים, וכך גם פרופילי הגודל שלהן.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>APC Anti-CD81 antibody (M38)</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab233259</td>
			<td>Anti-Human CD81 APC 
			conjugated antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC Anti-CD9 antibody (EM-04)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab82392</td>
			<td>Anti-mouse CD9 APC 
			conjugated antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC Anti-CD9 antibody (MEM-61), prediluted</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab82389</td>
			<td>Anti-Human CD9 APC 
			conjugated antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC anti-mouse CD63 antibody</td>
			<td>biolegend</td>
			<td>143905</td>
			<td>Anti-Mouse CD63 APC 
			conjugated antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC anti-mouse/rat CD81 antibody</td>
			<td>biolegend</td>
			<td>104909</td>
			<td>Anti-Mouse CD81 APC 
			conjugated antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD63 monoclonal antibody (MEM-259), APC</td>
			<td>invitrogen Via Fisherscientific</td>
			<td>A15712</td>
			<td>Anti-Human CD63 APC 
			conjugated antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Celline AD1000 bioreactor</td>
			<td>Merck</td>
			<td>Z688037-5EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cleaning solution</td>
			<td>NanoFCM</td>
			<td>17159</td>
			<td>In house cleaning solution for nanoanalyser</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVs from C2C12</td>
			<td>Gifted</td>
			<td></td>
			<td>Mouse line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVs from SW620</td>
			<td>Gifted</td>
			<td></td>
			<td>Human line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Memglow - Fluorogenic Membrane Probe</td>
			<td>Cytoskeleton</td>
			<td>MG01</td>
			<td>non toxic cell membrane dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoAnalyzer</td>
			<td>NanoFCM</td>
			<td></td>
			<td>nano-flow cytometer for measurement of single particles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS, pH 7.2</td>
			<td>Gibco Via Fisherscientific</td>
			<td>12549079</td>
			<td>Salt solution for dilution of samples and antibodies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Snaplock Microtubes, 0.60mL</td>
			<td>Axygen Via Fisherscientific</td>
			<td>11371944</td>
			<td>Tubes required to load sample into nanoanalyser</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single extracellular vesicle transmembrane protein characterization by nano-flow cytometry

אפיון חלקיקים בודדים הפך רלוונטי יותר ויותר למחקר על שלפוחיות חוץ-תאיות, והתקדם מטכניקות ניתוח בתפזורת וניתוח חלקיקים מהדור הראשון למדידות מקיפות מרובות פרמטרים כגון ציטומטריה של זרימה ננומטרית (nFCM). nFCM היא צורה של ציטומטריה של זרימה המשתמשת במכשור שתוכנן במיוחד לניתוח ננו-חלקיקים, המאפשר לאפיין אלפי כלי רכב חשמליים לדקה הן עם טכניקות צביעה והן ללא שימוש בהן. זיהוי פיזור צד ברזולוציה גבוהה (SS) מאפשר לקבוע גודל וריכוז עבור כל החלקיקים הביולוגיים הגדולים מ-45 ננומטר, בעוד שזיהוי פלואורסצנטי סימולטני (FL) מזהה נוכחות של סמנים מסומנים ויעדים בעלי עניין. לאחר מכן ניתן לתאר תת-אוכלוסיות מסומנות ביחידות כמותיות של חלקיקים/מ"ל או כאחוז מסך החלקיקים שזוהו על ידי פיזור צדדי.
כאן, כלי רכב חשמליים שמקורם במדיית תרבית תאים מותנית (CCM) מסומנים הן בצבע שומני, כדי לזהות חלקיקים עם ממברנה, והן בנוגדנים ספציפיים ל-CD9, CD63 ו-CD81 כסמני EV נפוצים. מדידות של חומר השוואה, תקן ריכוז וסטנדרט גודל של ננוספרות סיליקה, כמו גם חומר מדגם מסומן מנותחים בניתוח של דקה אחת. לאחר מכן התוכנה משמשת למדידת פרופיל התפלגות הריכוז והגודל של כל החלקיקים, ללא תלות בתיוג, לפני קביעת החלקיקים החיוביים לכל אחת מהתוויות.
ניתן להשתמש בזיהוי סימולטני של SS ו-FL באופן גמיש עם מקורות EV ויעדי תיוג רבים ושונים, חיצוניים ופנימיים, המתארים דגימות EV באופן מקיף וכמותי.

מצגת טטרספנין על כלי רכב חשמליים נגזרים מדגם SW620 ורכבים חשמליים נגזרים מסוג C2C12 ניתוח מודרני של שפע הטטרספאנינים העיקריים CD9, CD63 ו- CD81 על כלי רכב חשמליים ממגוון מקורות הדגיש את השונות הקיצונית של נוכחותם, הן בניתוחים בתפזורת והן בעת ניתוח הצגתם על תת-אוכלוסיות EV21. זה קשור ככל הנראה לזמינות של מסלולי ביוגנזה שונים כגון מסלולים תלויי ESCRTועצמאיים 22.
CD9 הוצג על האחוז הגדול ביותר של כלי רכב חשמליים C2C12 ב~50%, כאשר CD63 מוצג על ~30% בלבד, באיור 1. כאשר התיוג בוצע עם כל שלושת האנטי-טטרספנינים בדגרה אחת, ~70% מהחלקיקים נמצאו כמציגים לפחות אחד מסמני EV. מדידות חוזרות הראו את סטיית התקן הנמוכה ביותר עבור תיוג CD9/63/81 של כלי רכב חשמליים C2C12 ב~3.8%, בעוד שזה היה ~8.1% עבור CD81 שכותרתו C2C12 EVs.
כלי רכב חשמליים שמקורם ב-SW620 הראו פרופיל טטרספאנין שונה, עם הבדל גדול בהרבה בין ה-CD9 המוצג ביותר ב~40% לבין ה-CD63 המוצג הכי פחות ב~7%. בדומה ל-C2C12 EVs, CD9 היה נוכח ברוב האוכלוסייה החיובית לטטרספנין, שכן הסימון המשולב CD9/63/81 זיהה ~42% מהחלקיקים כבעלי לפחות אחד משלושת הסמנים.
רוב החלקיקים הנגזרים מ-C2C12, אוכלוסיית ה-SS+ הכוללת, נעו בגודלם בין 45-120 ננומטר, עם חציון ~65 ננומטר. פרופילי הגודל של כל אחת מתת-אוכלוסיות הטטרספנין הבודדות המסומנות כתת-אוכלוסיות EV, המוצגים באיור 1, דומים זה לזה, ומראים גודל חציוני גדול יותר של ~75-85 ננומטר ופחות <65 ננומטר EVs בהשוואה לאוכלוסיית החלקיקים הכוללת.
חלקיקים נגזרים SW620 נעו בין 45-160 ננומטר עם גודל חציוני של ~ 65 ננומטר, מראה התפלגות מוטה. הטטרספאנין המסומן כרכבים חשמליים מראה התפלגות נורמלית יותר וקוטר חציוני גדול יותר בין 90-110 ננומטר, עם התפלגויות דומות בין תת-אוכלוסיות חיוביות בודדות של טטרספאנין.
בעוד שהטטרספאנינים המוצגים ביותר והפחות מוצגים זהים עבור שני קווי תאים אלה, הייצוג היחסי שלהם שונה מאוד ויש הבדל מעניין בין ההצגה המשותפת הפוטנציאלית של טטרספאנינים הנצפית מההבדל בחיוביות CD9 לבין החיוביות CD9/63/81.
שילוב של תיוג ממברנת EV עם תיוג נוגדנים הממברנה הדו-שכבתית של כלי רכב חשמליים מספקת יעד תיוג גנרי יותר, שעשוי לאפשר הבחנה בין חלקיקים שאינם EV בגודל דומה, כגון אגרגטים של חלבונים וצורות מסוימות של LDL עם מונו-שכבות שומנים23. יש לאמת את הספציפיות של סוג זה של התוויה, שכן כמה צבעי ממברנה נפוצים המשמשים במחקרי EV הוכחו כנקשרים גם לחלקיקים שאינם EV24.
תיוג ממברנות הראה שוב ושוב ~ 80% חיוביות של כלי רכב חשמליים שמקורם ב- C2C12 ו- SW620 EVs. עוצמת ה-SS (SS-H) מראה מתאם טוב עם עוצמת FITC בחלקות הנקודות של תוצאות C2C12 ו-SW620 המוצגות באיור 2. זה צפוי מכיוון שעוצמת ה-SS היא יחסית לגודל החלקיקים ומכאן שטח הפנים של הממברנה.
רוב הנוגדנים שסומנו כרכבים חשמליים היו חיוביים גם עבור תיוג הממברנה שהראה אחוזים חיוביים כפולים (FITC+ ו-APC+) דומים מאוד לאחוזים החיוביים של הטטרספנין. FITC לעומת APC נקודות חלקות מראות מתאם קל בין תיוג ממברנה וטטרספנין עם תיוג CD63 שנראה כי הוא מראה את המתאם החלש ביותר לתיוג ממברנה. זוהו אירועים מעטים שהיו חיוביים לתיוג נוגדנים אך שליליים לתיוג ממברנה.
יכולת שכפול, יעילות תיוג כפול ופלטי נתונים חלופיים שיקול חשוב בתכנון ניסויי nFCM הוא פלואורופור או אינטראקטיביות של תוויות. איור 3a מראה שחזרה על תיוג הנוגדנים עם ובלי תיוג נוסף של ממברנה מובילה למדידות חיוביות דומות מאוד של %. בפרט, תיוג SW620 מראה מעט מאוד שונות בין שתי ערכות המדידה. זה מראה על הפרעה מוגבלת בין צבע לקשירת נוגדנים וגם מדגיש יכולת שכפול טובה כאשר חוזרים על תיוג EV.
מדידות עוצמה, הן פיזור צד והן פלואורסצנטיות, ניתנות לייצוא כדי להצטיין עבור כל חלקיק בודד שנמדד. מכאן אנו יכולים ליצור מדידות עוצמת פלואורסצנציה ממוצעת (MFI) כדי לספק קירובים השוואתיים של שפע היעד המסומן שלנו. MFI עבור האוכלוסיות הפלואורסצנטיות של כלי רכב חשמליים הנגזרים מ-C2C12 מציעים הצגה מעט נמוכה יותר של CD63 ו-CD81 עם מדידות MFI של ~550 ו-~600, בהתאמה, בהשוואה ל-~850 MFI שנצפו עבור כלי רכב חשמליים מסוג CD9+. יחידות המידה של MFI במקרה זה הן FL-A ואינן מתוקננות כנגד כיול פלואורסצנטי. השימוש בכל שלושת הנוגדנים אינו מעורר פלואורסצנטיות גדולה בהרבה מאשר רק תיוג CD9. זה שונה מאוד ממדידות SW620 MFI, המצביעות על כך ששימוש בקוקטייל של כל שלושת הנוגדנים מספק אות פלואורסצנטי גדול יותר עבור כלי רכב חשמליים מסומנים, מאשר שימוש בכל תווית נוגדנים בודדת.
היסטוגרמות התפלגות הגודל המיוצרות על ידי תוכנת NanoFCM ניתנות גם לייצוא לאקסל ומאפשרות כיסוי של ערכות נתונים משולשות. פרופילי התפלגות הגודל באיור 3 דומים לאלה של איור 1 , אך כוללים קווי שגיאה. הגודל החציוני של EV של תת-אוכלוסיות חיוביות של טטרספנין ברכבים חשמליים שמקורם ב-C2C12 מראה חציון סביב 70 ננומטר, מעט גדול יותר מהממוצע של 60 ננומטר מכלל אוכלוסיות החלקיקים. SW620 EVs חיוביים עבור סמני טטרספנין גדולים יותר, ומראים שיאים של ~ 100 ננומטר.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64020/64020fig01.jpg"> איור 1: CD9, CD63, CD81 תת-אוכלוסיות חיוביות של EV שזוהו על-ידי תיוג נוגדנים . (A) תרשים עמודות המציג את אחוז הרכבים החשמליים המסומנים בהשוואה לסך החלקיקים שנצפו על-ידי SS עבור כלי רכב חשמליים הנגזרים מ-C2C12. (B) תרשים עמודות המציג את אחוז כלי הרכב החשמליים המסומנים בהשוואה לסך החלקיקים שנצפו על-ידי SS עבור כלי רכב חשמליים שמקורם ב-SW620. (C) פרופילי הפצה בגודל מייצג עבור כלי רכב חשמליים נגזרים C2C12. כל היסטוגרמה נלקחת ממסמכי PDF שנוצרו למדידה הראשונה של ערכות נתונים משולשות. (D) פרופילי הפצה בגודל מייצג עבור כלי רכב חשמליים נגזרים מדגם SW620. כל היסטוגרמה נלקחת ממסמכי PDF שנוצרו למדידה הראשונה של ערכות נתונים משולשות. קווי שגיאה מייצגים סטיית תקן של מדידות משולשות של אותן דגימות המסומנות. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64020/64020fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64020/64020fig02.jpg"> איור 2: תיוג ממברנות ותיוג נוגדנים של CD9, CD63, CD81 המציגים תת-אוכלוסיות של EV . (A) תרשים עמודות המציג ממברנה+ %, טטראספנין+ % וכפול+ % עבור כלי רכב חשמליים C2C12. (B) תרשים עמודות המציג ממברנה+ %, טטרספנין+ % וכפול+ % עבור כלי רכב חשמליים מדגם SW620. (C) חלקות נקודות SS לעומת FITC מייצגות המציגות את ההתאמה לאוכלוסייה החיובית של הממברנה. (D) מגרשים מייצגים של FITC לעומת APC dot המציגים צפיפות לאוכלוסייה חיובית כפולה של כלי רכב חשמליים מ-C2C12. (E) מגרשים מייצגים של FITC לעומת APC dot המציגים צפיפות לאוכלוסייה חיובית כפולה של כלי רכב חשמליים מ- SW620. קווי שגיאה מייצגים סטיית תקן של מדידות משולשות של אותן דגימות המסומנות. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64020/64020fig02large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64020/64020fig03.jpg"> איור 3: הערכת שונות במדידות חוזרות . (A) תרשימי עמודות המציגים תיוג נוגדנים % חיוביות עם ובלי תיוג נוסף של ממברנה. (B) מדידות עוצמה פלואורסצנטיות ממוצעות עבור תת-קבוצות EV מגודרות. (C) היסטוגרמות התפלגות גודל ממוצעות עבור ערכות נתונים משולשות עבור כלי רכב חשמליים C2C12. (D) היסטוגרמות של התפלגות גודל ממוצע עבור ערכות נתונים משולשות עבור כלי רכב חשמליים מדגם SW620. קווי שגיאה מייצגים סטיית תקן של מדידות משולשות של אותן דגימות המסומנות. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64020/64020fig03large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Single Extracellular Vesicle Transmembrane Protein Characterization by Nano-Flow Cytometry at JoVE.com

Single Extracellular Vesicle Transmembrane Protein Characterization by Nano-Flow Cytometry

הדור האחרון של כלי אפיון EV מסוגלים לנתח EV יחיד על פני מספר פרמטרים בו זמנית. ציטומטריה של זרימה ננו מודדת את כל החלקיקים הביולוגיים הגדולים מ-45 ננומטר ללא התוויה ומזהה מאפיינים ספציפיים של תת-אוכלוסיות על ידי מגוון טכניקות תיוג פלואורסצנטיות.

אפיון חלבון טרנס-ממברנה חוץ-תאי יחיד על-ידי ציטומטריה של זרימה ננו

Single particle characterization has become increasingly relevant for research into extracellular vesicles, progressing from bulk analysis techniques and ...

אפיון מעמיק של כלי רכב חשמליים יכול להיות מאתגר, ולדרוש מספר מכשירים לתיאור פרמטרים בודדים. מדידת הקריטריונים המרכזיים האלה בטכניקה אחת כמו ציטומטריה של ננו-זרימה מתארת תת-אוכלוסיות מרובות של כלי רכב חשמליים בו-זמנית. כך שכל EV נמדד בנפרד בזיהוי חלקיקים בקוטר של יותר מ-14 ננומטר ללא תווית לפני קביעת הפלואורסצנטיות שלהם.זה יוצר מערך נתונים חזק על ידי הסרת תוצאות חיוביות שגויות. ניתן ליישם ציטומטריה של ננו-זרימה על כלי רכב חשמליים ממגוון מקורות, כולל כאלה המועשרים מפלזמה, CSF ומדיום תרבית. טכניקה זו משמשת גם לניתוח של וירוסים, ננו-חלקיקי שומנים וננו-חומרים.חשוב למטב את פרוטוקול ההתוויה. זה ממקסם כל פלואורסצנציה הקשורה לחלקיק בהשוואה לכל פלואורסצנציה שיורית שנותרה במאגר. כדי להתחיל, הפעל את המכשיר, טען מקצוע ננו-זרימה ובחר הפעל מהתפריט הנפתח Sheath Flow, טען מים לתא הטעינה ובחר הגברת מהתפריט הנפתח Sheath Flow.דללו את חרוזי ה-QC אחד עד 100 במים מזוקקים בצינור של 0.6 מיקרוליטר, והניחו אותם בתא הטעינה כדי להכניס את הדגימה למערכת. לאחר מכן הגבירו את הדגימה למשך 45 שניות כפי שהודגם קודם לכן כדי להחליף לחלוטין את הדגימה, המים או תמיסת הניקוי הקודמת. תוך כדי האצה, הגדר את עוצמת הלייזר לתבנית המוגדרת מראש עבור חרוזי QC ל-250 ננומטר FL QC סטנדרטי.מאוחר יותר, כדי להפחית את לחץ המערכת, בחר את לחץ הדגימה מאותו תפריט נפתח והגדר את לחץ הדגימה האוטומטית לקילו פסקל אחד כדי לשמור על לחץ קבוע. לאחר מכן התחל את הניתוח של דקה אחת על-ידי בחירה באפשרות זמן להקלטה מתוך פקדי הרכישה. הנתונים יתווצרו על מתווה הנקודות המציג סולם יומן עבור עוצמת פיזור צדדית, ועוצמת פלואורסצנטיות נבחרת.לפני שמירת הקובץ, הוסף את שם הקובץ ואת דילול הדגימה. לאחר מכן, בחר לפרוק כדי להסיר את הצינור ממפרץ הטעינה. החלף את חרוזי ה- QC ב- 150 מיקרוליטר של תמיסת ניקוי ונקה במשך יותר מ- 30 שניות על-ידי בחירה באפשרות boosting.באמצעות צינור המכיל 150 מיקרוליטר של מים, להסיר כל תמיסת ניקוי עודף מן הקצה נימי על ידי טבילת הקצה במים. לאחר מכן דיללו את גודל החרוזים הסטנדרטיים אחד עד 100 במים והעמיסו 100 מיקרוליטרים לתא ההעמסה. כעת, הגדר את עוצמת הלייזר לתבנית המוגדרת מראש, S16 EXO 68 עד 155 ננומטר.הגדרה זו מיועדת הן לתקן הגודל והן לדגימות המכילות כלי רכב חשמליים הקטנים מ-200 ננומטר. בחר דגימה והמשך להקליט את הדגימה למשך דקה אחת. בצע את המדידה השלישית עם דגימת מים או PBS כדי ליצור פיחות מדידה ריק, המזהה תוצאות חיוביות כוזבות להסרה על ידי התוכנה.דלל את דגימות ה-EV ללא תווית ב-PBS לטווח ריכוז חלקיקים מתאים של פי 10 עד השמיני עד חמש פעמים 10 עד החלקיקים השמיניים למיליליטר לצורך ניתוח nFCM. ולטעון 10 עד 100 מיקרוליטר של הדגימה המדוללת לתוך תא הטעינה. אם ריכוז החלקיקים אינו ידוע, התחל בדילול של אחד עד 100 של דגימת EV.ריכוז הדגימה יכול להיות משוער במהירות על ידי גודל נקודת הלייזר במצלמת CCD במהלך ההאצה, או על ידי תצפית על עקבות התפרצות האירוע במהלך הדגימה. לאחר שהדגימה שנטענה מוגברת למשך 45 שניות, הקלט במשך דקה אחת ושמור את הקובץ כפי שהוכח קודם לכן. לאחר ההקלטה, התחל לנתח נתונים אלה, עבור מהכרטיסייה רכישה לכרטיסייה ניתוח ופתיחת קבצי NFA שנשמרו.למדידת דגימה מדויקת, השתמש בשתי המדידות הסטנדרטיות שבוצעו לפני מדידת הדגימה כדי להגדיר ערכים להשוואת דגימות וכן את הריק. צור את עקומת הגודל הסטנדרטית להמרה של פיזור צד לקוטר על-ידי בחירת הקובץ Standard Size ושימוש בכלי קבע סף. הסף, הנראה לעין בעקבות התפרצות האירוע, מזהה את עוצמת האות המינימלית הנדרשת כדי שאירוע ייחשב למשמעותי.כאשר הסף מוגדר, בדוק את הפרמטרים של התוויית הנקודות, SS-H או SS-A בציר X ו- FITC-A בציר Y. פתח את הכלי יצירת עקומה רגילה ובחר S16 EXO 68 עד 155 ננומטר כתבנית הגודל. לחצו על Find Peaks כדי לזהות את עוצמות הפיזור הצדדיות של השיא כחלקיקים בקוטר 68, 91, 113 או 155 ננומטר.לפני סגירת החלון, בדוק אם עקומת הצד המפוזר לקוטר נוצרה עם ערך R קרוב לאחד. קבע את תקן הריכוז. בחר את הקובץ שנשמר, לחץ על תקן ספירה והזן את ריכוז החלקיקים של התקן.הגדר את המידע הסטנדרטי. בחר את הקובץ לדוגמה EV והגדר את הסף. בחר את הקובץ הריק ולחץ על הגדר ריק כדי לזהות את מספר התוצאות החיוביות המוטעות להסרה מספירת הדגימות.לאחר פתיחת כלי יצירת PDF, בדקו את הגודל, הריכוז והדילולים של הדגימה. לאחר מכן הראה את ריכוז המדגם ואת התפלגות הגודל של החלקיקים. לאחר תיוג דגימות EV כמתואר בכתב היד, קח מיקרוליטר אחד של הדגימה המסומנת ודלל אחד עד 50 ב- PBS בצינור של 0.6 מיליליטר.טען את הדגימה לתא הטעינה והפעל לחץ מגביר למשך 45 שניות. כמו כן, ודא שהגדרות לייזר נכונות והעדשות המתאימות נטענות. כעת, עבור ללחץ דגימה ובחר את זמן ההקלטה.לאחר הרכישה בדקה אחת, תן שם לקובץ הנתונים ושמור. פרקו את הדגימה, החליפו אותה בתמיסת ניקוי והגבירו את תמיסת הניקוי למשך יותר מ-30 שניות לפני טעינת הדגימה הבאה המסומנת כפי שהודגם קודם לכן. ליצירת PDF, החל את אותם סטנדרטים שהוכחו בעבר.רק המדידה הריקה תיקבע אחרת. בחר את הקובץ לדוגמה והגדר את הסף. בחרו בכלי סימון והשתמשו בלחיצה השמאלית כדי לצייר קו המפריד בין האוכלוסייה החיובית הפלואורסצנטית.הגדר את השמות והצבעים לייצוג. הגדר את הקובץ הריק ולחץ על הגדר ריק כדי לזהות את מספר התוצאות החיוביות המוטעות להסרה מכל אוכלוסייה שונה. פתחו את כלי יצירת PDF וזהו את התפלגות הגודל, הריכוז והאחוזים של תת-האוכלוסייה החיובית הפלואורסצנטית.במתווה הנקודה, שנה את ציר ה- Y כדי להציג מדידות פלואורסצנטיות מהערוץ הירוק או האדום. קבעו את הריק וצרו מסמך PDF כפי שהוכח קודם לכן. בהתוויית הנקודה, הגדר את ציר ה- X ל- FITC ואת ציר Y ל- APC.השתמש בכלי הרביע כדי לזהות אוכלוסיות חיוביות פלואורסצנטיות כפולות. קבעו שמות וצבעים שיהיו מייצגים, ולאחר מכן פתחו את קובץ PDF ובחרו בתת-האוכלוסיות הפלואורסצנטיות. כלי רכב חשמליים שמקורם ב-C2C12 הראו כ-50% CD9, 30% CD63 מצגת ו-70% אוכלוסייה הציגו לפחות אחד משלושת סמני ה-EV.פרופילי הגודל של תת-אוכלוסיות EV בודדות המסומנות בטטרספנין הראו גודל חציוני גדול יותר של כ-75 עד 85 ננומטר ופחות מ-65 ננומטר EVs בהשוואה לאוכלוסיית החלקיקים הכוללת. כלי רכב חשמליים שמקורם ב-SW620 הראו כ-40% CD9, 7% CD63 מצגת ו-42% מהחלקיקים כבעלי לפחות אחד משלושת הסמנים. כלי הרכב החשמליים בעלי התווית של SW620, המסומנים בטטרספנין, הראו התפלגות נורמלית יותר וקוטר חציוני גדול יותר בין 90 ל-110 ננומטר עם התפלגויות דומות בין תת-אוכלוסיות חיוביות של טטרספאנין בודדות.תיוג ממברנות הראה שוב ושוב 80% חיוביות של כלי רכב חשמליים המופקים מ-C2C12 ו-SW620. עוצמת הפיזור הצדדי מתואמת עם עוצמת FITC על חלקות הנקודות של C2C12 ו- SW620. האחוזים החיוביים הכפולים דומים מאוד לאחוזים החיוביים של הטטרספנין.ונראה כי תיוג CD63 מראה את המתאם החלש ביותר לתיוג ממברנות. מדדי החיוביות באחוזים היו דומים בין סימון הנוגדנים עם ובלי תיוג נוסף של ממברנה. עוצמת פלואורסצנטיות ממוצעת עבור אוכלוסיות פלואורסצנטיות של כלי רכב חשמליים שמקורם ב-C2C12 הציעה הצגה נמוכה יותר של CD63 ו-CD81 בהשוואה ל-CD9 EVs, בעוד ש-SW620 הראה כי שימוש בכל שלושת הנוגדנים מספק אות פלואורסצנטי גדול יותר מכל תווית נוגדנים בודדת בפרוטוקול זה, סמני EV נפוצים סומנו באופן פלואורסצנטי, אך ניתן לבחור רבות ממטרות הנוגדנים כדי להראות את מקור EV, את פונקציית EV, או את מצב המחלה.

Research

JoVE Journal

Biology

IP-FCM:  Immunoprecipitation Detected by Flow Cytometry

IP-FCM: immunoprecipitation זוהה על ידי זרימת cytometry

Immunoprecipitation detected by flow cytometry (IP-FCM) is an efficient method for detecting and quantifying protein-protein interactions. The basic ...

Transmembrane Domain Oligomerization Propensity determined by ToxR Assay

דומיין הטרנסממברני Oligomerization הנטייה נקבע על ידי Assay ToxR

The oversimplified view of protein transmembrane domains as merely anchors in phospholipid bilayers has long since been disproven.  In many cases ...

Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae

Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae

ביטוי וטיהור של חלבון פיברוזיס פיברוזיס הטרנסממברני הרגולטור מוליכות ב Saccharomyces cerevisiae

The  cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) is a chloride  channel, that when mutated, can give rise to cystic fibrosis in  ...

Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein Expressed in Saccharomyces cerevisiae

Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein Expressed in Saccharomyces cerevisiae

טיהור של חלבון הטרנסממברני מוליכות רגולטור סיסטיק פיברוזיס שבא לידי ביטוי ב<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Defects in the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) protein cause cystic fibrosis (CF), an autosomal recessive disease that ...

Characterization of G Protein-coupled Receptors by a Fluorescence-based Calcium Mobilization Assay

אפיון של רצפטורים מצמידים גרמו חלבון על ידי Assay גיוס סיד הקרינה מבוססת

For more than 20 years, reverse pharmacology has been the preeminent strategy to discover the activating ligands of orphan G protein-coupled receptors ...

High Efficiency Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells to Cardiomyocytes and Characterization by Flow Cytometry

בידול יעילות גבוה של תאי גזע pluripotent האדם לשריר לב ואפיון על ידי cytometry הזרימה

There is an urgent need to develop approaches for repairing the damaged heart, discovering new therapeutic drugs that do not have toxic effects on the ...

Techniques for the Analysis of Extracellular Vesicles Using Flow Cytometry

טכניקות לניתוח של תאית שלפוחית ​​שימוש cytometry הזרימה

Extracellular Vesicles (EVs) are small, membrane-derived vesicles found in bodily fluids that are highly involved in cell-cell communication and help ...

Detecting and Characterizing Protein Self-Assembly In Vivo by Flow Cytometry

גילוי ואפיון הרכבה עצמית של חלבון בVivo על-ידי הזרמת הקיטומטל

Protein self-assembly governs protein function and compartmentalizes cellular processes in space and time. Current methods to study it suffer from ...

Quantification of Cellular Densities and Antigenic Properties using Magnetic Levitation

כימות של צפיפות תאית ומאפיינים אנטיגניים באמצעות ריחוף מגנטי

The described method was developed based on the principles of magnetic levitation, which separates cells and particles based on their density and magnetic ...

Extracellular Vesicle Uptake Assay via Confocal Microscope Imaging Analysis

Extracellular Vesicle Uptake Assay via Confocal Microscope Imaging Analysis

ספיגת ארסיה חוץ-תאית באמצעות ניתוח הדמיית מיקרוסקופ קונפוצלי

There is a need for practical assays to visualize and quantify the cells' extracellular vesicle (EV) uptake. EV uptake plays a role in intercellular ...