Name: single extracellular vesicle transmembrane protein characterization by nano-flow cytometry
Uploaded: 2022-07-26T14:00:00
Duration: 12 min 27 s
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हम सामग्री और विशेषज्ञता प्रदान करना जारी रखने के लिए ओवेन डेविस और निक पीक के समूहों को धन्यवाद देना चाहते हैं।

1. एनएफसीएम उपकरण की स्थापना और एनएफसीएम मानकों का माप
नोट: एनएफसीएम उपकरण के सही संरेखण को मान्य करने और उपकरणों के बीच मजबूत तुलना प्रदान करने के लिए नमूनों के लिए डेटा अधिग्रहण शुरू करने से पहले तीन माप लिए जाते हैं। गुणवत्ता नियंत्रण (क्यूसी), आकार मानक, और एक रिक्त स्थान हैं।
<ol><li>क्यूसी मोतियों को आसुत जल में 1:100 को एक उपयुक्त 0.6 μL ट्यूब में पतला करें और लोडिंग बे में रखें।</li>
	<li>नमूना प्रवाह ड्रॉप डाउन मेनू से, पिछले नमूना / सफाई समाधान को पूरी तरह से बदलने के लिए 45 सेकंड के लिए सिस्टम में क्यूसी नमूने को पेश करने के लिए बूस्टिंग का चयन करें।<ol><li>बूस्ट करते समय, क्यूसी बीड्स "250 एनएम एफएल क्यूसी मानक" के लिए पूर्व निर्धारित टेम्पलेट पर लेजर पावर सेट करें, उदाहरण के लिए, नीले लेजर के लिए 10/40 मेगावाट, लाल लेजर के लिए 20/50 मेगावाट, 0.2% एसएस क्षय के साथ।</li>
	</ol></li>
	<li>सिस्टम दबाव को कम करने के लिए उसी डाउन मेनू से नमूना दबाव का चयन करें।</li>
	<li>निरंतर दबाव बनाए रखने के लिए ऑटो नमूना दबाव को 1.0 kPa पर सेट करें।</li>
	<li>अधिग्रहण नियंत्रणों से रिकॉर्ड करने के लिए समय का चयन करके 1 मिनट का विश्लेषण शुरू करें। डेटा को डॉट-प्लॉट पर प्लॉट किया जाएगा जो एसएस-तीव्रता और चयनित एफएल तीव्रता के लिए लॉग स्केल दिखाएगा।</li>
	<li>फ़ाइल सहेजने से पहले फ़ाइल नाम और नमूना कमजोर पड़ने डालें.</li>
	<li>लोडिंग बे से ट्यूब को हटाने के लिए अनलोड का चयन करें। सफाई समाधान के 150 μL के साथ बदलें और अनलोड का चयन करके सफाई समाधान को हटाने से पहले बूस्टिंग का चयन करके >30 सेकंड के लिए साफ करें।<ol><li>150 μL पानी युक्त ट्यूब का उपयोग करके केशिका टिप से किसी भी अतिरिक्त सफाई समाधान को हटा दें।</li>
	</ol></li>
	<li>आकार मानक मोतियों को पानी में 1: 100 पतला करें और 45 सेकंड के लिए नमूने को बढ़ाने से पहले लोडिंग बे में 100 μL लोड करें ।</li>
	<li>लेजर पावर को प्रीसेट टेम्पलेट "एस 16 एक्सो 68-155 एनएम" पर सेट करें। यह सेटिंग आकार मानक और 200 एनएम < ईवी युक्त नमूने दोनों के लिए है। उदाहरण के लिए, नीले लेजर के लिए 15/40 मेगावाट, लाल लेजर के लिए 20/50 मेगावाट, 0.2% एसएस क्षय के साथ।</li>
	<li>नमूनाकरण का चयन करें और पहले की तरह 1 मिनट के लिए नमूना रिकॉर्ड करने के लिए आगे बढ़ें।</li>
	<li>सॉफ्टवेयर द्वारा हटाने के लिए झूठे सकारात्मक की पहचान करते हुए, अपने एलुएंट का एक रिक्त माप बनाने के लिए पानी या पीबीएस नमूने के साथ तीसरा माप करें। मानक माप को इनपुट करना निम्नलिखित अनुभाग में वर्णित है।</li>
</ol>2. एक बिना लेबल वाले नमूने की कण एकाग्रता का निर्धारण करना और एक पीडीएफ रिपोर्ट तैयार करना
<ol><li>पीबीएस में अनलेबल ईवी नमूने को एनएफसीएम विश्लेषण के लिए एक उपयुक्त कण एकाग्रता सीमा, 1 x 108- 5 x 108 कण / एमएल में पतला करें। पतला नमूना के 10-100 μL को लोडिंग बे में लोड करें।</li>
	<li>जब कण एकाग्रता अज्ञात होती है, तो ईवी नमूने के 1: 100 कमजोर पड़ने से शुरू करें। नमूना एकाग्रता को बूस्टिंग के दौरान सीसीडी कैमरे पर लेजर स्पॉट के आकार से, या नमूनाकरण के दौरान इवेंट बर्स्ट ट्रेस के अवलोकन से जल्दी से अनुमानित किया जा सकता है।</li>
	<li>नमूनाकरण का चयन करने से पहले लोड किए गए नमूने को 45 सेकंड के लिए बूस्ट करें और 1 मिनट के लिए रिकॉर्ड करें, जैसा कि पहले वर्णित है।</li>
	<li>इस डेटा का विश्लेषण शुरू करने के लिए, अधिग्रहण टैब से विश्लेषण टैब पर स्विच करें। सहेजी गई nfa फ़ाइलें खोलें।</li>
	<li>सटीक नमूना माप की अनुमति देने के लिए, नमूना तुलना के साथ-साथ रिक्त स्थान के लिए मान सेट करने के लिए नमूना माप से पहले लिए गए दो मानक मापों का उपयोग करें।</li>
	<li>पहले आकार मानक फ़ाइल का चयन करके और सेट थ्रेशोल्ड टूल (जिसे ऑटो-थ्रेशोल्डिंग भी कहा जाता है) का उपयोग करके, एसएस से व्यास रूपांतरण के लिए आकार मानक वक्र बनाएं। घटना विस्फोट ट्रेस में दिखाई देने वाली दहलीज, किसी घटना को महत्वपूर्ण माने जाने के लिए आवश्यक न्यूनतम सिग्नल तीव्रता की पहचान करती है।</li>
	<li>थ्रेशोल्ड सेट के साथ, डॉट प्लॉट एक्स की जांच करें और वाई पैरामीटर एक्स अक्ष पर एसएस-एच या एसएस-ए और वाई अक्ष पर एफआईटीसी-ए हैं।</li>
	<li>मानक वक्र पीढ़ी उपकरण खोलें और साइज़िंग टेम्पलेट के रूप में S16 एक्सो 68-155 एनएम का चयन करें। पीक एसएस तीव्रता को 68, 91, 113, या 155 एनएम व्यास कण के रूप में पहचानने के लिए चोटियों को खोजें पर क्लिक करें।</li>
	<li>विंडो को बंद करने से पहले जांचें कि क्या एसएस से व्यास वक्र 1 के करीब आर मान के साथ उत्पन्न किया गया है।</li>
	<li>सहेजी गई फ़ाइल का चयन करके और काउंट एसटीडी पर क्लिक करके एकाग्रता मानक सेट करें। मानक की कण एकाग्रता इनपुट करें।</li>
	<li>मानक जानकारी सेट करने के बाद, ईवी नमूना फ़ाइल का चयन करें और सीमा सेट करें।</li>
	<li>रिक्त फ़ाइल का चयन करें और नमूना गणना से हटाने के लिए झूठे सकारात्मक की संख्या की पहचान करने के लिए रिक्त स्थान सेट करें पर क्लिक करें। यह आपके नमूने के समान सीमा के साथ किया जाना चाहिए। ईवी नमूना फ़ाइल पर लौटें।</li>
	<li>पीडीएफ जनरेशन टूल खोलें और साइज़िंग और एकाग्रता का चयन करें। नमूने के कमजोर पड़ने को इनपुट करें। नमूने की एकाग्रता और कणों के आकार वितरण को दिखाया गया है।</li>
</ol>3. नमूना लेबलिंग
नोट: निलंबन में कणों के व्यापक विश्लेषण के लिए दो धुंधला रणनीतियों का एक साथ उपयोग किया जा सकता है। लेबलिंग प्रोटोकॉल को अक्सर नए एंटीबॉडी या नमूना स्रोतों के लिए अनुकूलन की आवश्यकता होती है।
<ol><li>पीबीएस में ईवी नमूने के एक हिस्से को 1.25 x 1010 कणों / एमएल की एकाग्रता में पतला करें। 1 x 10 10 कणों/एमएल की कण सांद्रता के लिए पतला ईवी नमूने के 8 μL को एंटीबॉडी के 1 μL और डाई के1 μL के साथ इनक्यूबेट करें (कुल कण 1 x 10 8 10μL में निलंबित होंगे)। एंटीबॉडी के लिए इनक्यूबेशन अनुपात इस उदाहरण में 1: 50 (1: 5 एंटीबॉडी का 1 μL) है।<ol><li>अनुकूलन के दौरान एंटीबॉडी या डाई की तीन से अधिक अलग-अलग सांद्रता का उपयोग करें, यह दर्शाता है कि प्रोटोकॉल चुने हुए लेबल की अधिक संतृप्ति के बिना अधिकतम एपिटोप बाइंडिंग की अनुमति देता है, जो कम तीव्रता प्रतिदीप्ति घटनाओं की पहचान को बाधित कर सकता है। झिल्ली डाई के लिए इनक्यूबेशन एकाग्रता 40 एनएम (400 एनएम का 1 μL) है।</li>
	</ol></li>
	<li>10 μL नमूने को 5 सेकंड के लिए भंवर द्वारा मिलाएं और अंधेरे में 30 मिनट के लिए RT पर इनक्यूबेट करें। नोट: नियंत्रण के लिए सिफारिशें चर्चा में शामिल हैं।</li>
	<li>इनक्यूबेशन बाद, लेबल किए गए नमूने का 1 μL लें और 0.6 एमएल ट्यूब में पीबीएस में 1:50 को पतला करें।</li>
	<li>नमूने को लोडिंग बे में लोड करें और 45 सेकंड के लिए बूस्टिंग दबाव लागू करें। सुनिश्चित करें कि लेजर सेटिंग्स सही हैं और उपयुक्त लेंस लोड किए गए हैं।</li>
	<li>नमूना दबाव पर स्विच करें और रिकॉर्ड करने के लिए समय का चयन करें। 1 मिनट के अधिग्रहण के बाद, डेटा फ़ाइल को नाम दें और सहेजें।</li>
	<li>नमूना अनलोड करें और सफाई समाधान के साथ बदलें। अगले लेबल वाले नमूने को लोड करने से पहले इसे >30 सेकंड के लिए बढ़ाएं।</li>
</ol>4. एनएफसीएम विश्लेषण-उप-जनसंख्या विश्लेषण के लिए पीडीएफ उत्पादन
<ol><li>पीडीएफ पीढ़ी के लिए, पहले किए गए मानकों के समान मानकों को लागू करें; केवल रिक्त माप अलग तरह से सेट किया जाएगा।</li>
	<li>नमूना फ़ाइल का चयन करें और सीमा सेट करें। डॉट प्लॉट पर, हरे या लाल चैनल से एफएल माप दिखाने के लिए वाई-अक्ष बदलें।</li>
	<li>स्क्वायर गेटिंग टूल का चयन करें और एफएल + आबादी के चारों ओर एक वर्ग खींचने के लिए बाएं क्लिक का उपयोग करें।</li>
	<li>रिक्त माप फ़ाइल खोलें और नमूना फ़ाइल पर वापस जाने से पहले रिक्त सेट करें पर क्लिक करें।</li>
	<li>पहले की तरह पीडीएफ जनरेशन टूल खोलें और एफएल + उपजनसंख्या के लिए आकार वितरण, एकाग्रता और प्रतिशत (सभी एसएस + घटनाओं की तुलना में) की पहचान की जाती है।<ol><li>ब्याज की प्रत्येक उप-जनसंख्या के लिए दोहराएं जिसे "कुल, पी 1, पी 2 आदि" के रूप में पहचाना जाता है।</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol>
	<li>Couch, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+brief+history+of+nearly+EV-erything+-+The+rise+and+rise+of+extracellular+vesicles.">A brief history of nearly EV-erything - The rise and rise of extracellular vesicles.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 10 (14), 12144 (2021).</li><li>Doyle, L. M., Wang, M. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+of+extracellular+vesicles,+their+origin,+composition,+purpose,+and+methods+for+exosome+isolation+and+analysis.">Overview of extracellular vesicles, their origin, composition, purpose, and methods for exosome isolation and analysis.</a> Cells. 8 (7), 727 (2019).</li><li>Grant, L. R., Milic, I., Devitt, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoptotic+cell-derived+extracellular+vesicles:+structure-function+relationships.">Apoptotic cell-derived extracellular vesicles: structure-function relationships.</a> Biochemical Society Transactions. 47 (2), 509-516 (2019).</li><li>Rontogianni, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+profiling+of+extracellular+vesicles+allows+for+human+breast+cancer+subtyping.">Proteomic profiling of extracellular vesicles allows for human breast cancer subtyping.</a> Communications Biology. 2, 325 (2019).</li><li>Sahoo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+and+diagnostic+translation+of+extracellular+vesicles+in+cardiovascular+diseases.">Therapeutic and diagnostic translation of extracellular vesicles in cardiovascular diseases.</a> Circulation. 143 (14), 1426-1449 (2021).</li><li>Chiang, C. -. Y., Chen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+characterizing+extracellular+vesicles+at+a+single-particle+level.">Toward characterizing extracellular vesicles at a single-particle level.</a> Journal of Biomedical Science. 26 (1), 9 (2019).</li><li>Karimi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detailed+analysis+of+the+plasma+extracellular+vesicle+proteome+after+separation+from+lipoproteins.">Detailed analysis of the plasma extracellular vesicle proteome after separation from lipoproteins.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (15), 2873-2886 (2018).</li><li>Akers, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+technologies+for+quantifying+Extracellular+Vesicles+(EVs)+in+Clinical+Cerebrospinal+Fluids+(CSF).">Comparative analysis of technologies for quantifying Extracellular Vesicles (EVs) in Clinical Cerebrospinal Fluids (CSF).</a> PLOS ONE. 11 (2), 0149866 (2016).</li><li>Bachurski, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicle+measurements+with+nanoparticle+tracking+analysis+-+An+accuracy+and+repeatability+comparison+between+NanoSight+NS300+and+ZetaView.">Extracellular vesicle measurements with nanoparticle tracking analysis - An accuracy and repeatability comparison between NanoSight NS300 and ZetaView.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 8 (1), 1596016 (2019).</li><li>Vogel, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+particle+concentration+of+multimodal+synthetic+reference+materials+and+extracellular+vesicles+with+orthogonal+techniques:+Who+is+up+to+the+challenge.">Measuring particle concentration of multimodal synthetic reference materials and extracellular vesicles with orthogonal techniques: Who is up to the challenge.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 10 (3), 12052 (2021).</li><li>Van Der Pol, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Particle+size+distribution+of+exosomes+and+microvesicles+determined+by+transmission+electron+microscopy,+flow+cytometry,+nanoparticle+tracking+analysis,+and+resistive+pulse+sensing.">Particle size distribution of exosomes and microvesicles determined by transmission electron microscopy, flow cytometry, nanoparticle tracking analysis, and resistive pulse sensing.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 12 (7), 1182-1192 (2014).</li><li>Hartjes, T. A., Mytnyk, S., Jenster, G. W., Van Steijn, V., Van Royen, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicle+quantification+and+characterization:+Common+methods+and+emerging+approaches.">Extracellular vesicle quantification and characterization: Common methods and emerging approaches.</a> Bioengineering. 6 (1), 7 (2019).</li><li>Zhao, Z., Wijerathne, H., Godwin, A. K., Soper, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+analysis+methods+of+extracellular+vesicles+(EVs).">Isolation and analysis methods of extracellular vesicles (EVs).</a> Extracellular Vesicles and Circulating Nucleic Acids. 2, 80-103 (2021).</li><li>Johnsen, K. B., Gudbergsson, J. M., Andresen, T. L., Simonsen, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+is+the+blood+concentration+of+extracellular+vesicles?+Implications+for+the+use+of+extracellular+vesicles+as+blood-borne+biomarkers+of+cancer.">What is the blood concentration of extracellular vesicles? Implications for the use of extracellular vesicles as blood-borne biomarkers of cancer.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Reviews on Cancer. 1871 (1), 109-116 (2019).</li><li>Zhu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-scattering+detection+below+the+level+of+single+fluorescent+molecules+for+high-resolution+characterization+of+functional+nanoparticles.">Light-scattering detection below the level of single fluorescent molecules for high-resolution characterization of functional nanoparticles.</a> ACS Nano. 8 (10), 10998-11006 (2014).</li><li>Van Der Pol, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardization+of+extracellular+vesicle+measurements+by+flow+cytometry+through+vesicle+diameter+approximation.">Standardization of extracellular vesicle measurements by flow cytometry through vesicle diameter approximation.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 16 (6), 1236-1245 (2018).</li><li>Lucchetti, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+extracellular+vesicles+by+conventional+flow+cytometry:+dream+or+reality.">Measuring extracellular vesicles by conventional flow cytometry: dream or reality.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (17), 6257 (2020).</li><li>Su&#225;rez, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+bead-assisted+flow+cytometry+method+for+the+semi-quantitative+analysis+of+Extracellular+Vesicles.">A bead-assisted flow cytometry method for the semi-quantitative analysis of Extracellular Vesicles.</a> Scientific Reports. 7 (1), 11271 (2017).</li><li>Tian, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+profiling+and+sizing+of+extracellular+vesicles+from+colorectal+cancer+patients+via+flow+cytometry.">Protein profiling and sizing of extracellular vesicles from colorectal cancer patients via flow cytometry.</a> ACS Nano. 12 (1), 671-680 (2018).</li><li>Silva, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+protein+cargo+loading+into+engineered+extracellular+vesicles+at+single-vesicle+and+single-molecule+resolution.">Quantification of protein cargo loading into engineered extracellular vesicles at single-vesicle and single-molecule resolution.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 10 (10), 12130 (2021).</li><li>Dragovic, R. A., Southcombe, J. H., Tannetta, D. S., Redman, C. W. G., Sargent, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicolor+flow+cytometry+and+nanoparticle+tracking+analysis+of+extracellular+vesicles+in+the+plasma+of+normal+pregnant+and+pre-eclamptic+women.">Multicolor flow cytometry and nanoparticle tracking analysis of extracellular vesicles in the plasma of normal pregnant and pre-eclamptic women.</a> Biology of Reproduction. 89 (6), 151 (2013).</li><li>Teng, F., Fussenegger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shedding+light+on+extracellular+vesicle+biogenesis+and+bioengineering.">Shedding light on extracellular vesicle biogenesis and bioengineering.</a> Advanced Science. 8 (1), 2003505 (2021).</li><li>Laulagnier, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mast+cell-+and+dendritic+cell-derived+exosomes+display+a+specific+lipid+composition+and+an+unusual+membrane+organization.">Mast cell- and dendritic cell-derived exosomes display a specific lipid composition and an unusual membrane organization.</a> Biochemical Journal. 380, 161-171 (2004).</li><li>Simonsen, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pitfalls+associated+with+lipophilic+fluorophore+staining+of+extracellular+vesicles+for+uptake+studies.">Pitfalls associated with lipophilic fluorophore staining of extracellular vesicles for uptake studies.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 8 (1), 1582237 (2019).</li><li>Collot, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MemBright:+A+family+of+fluorescent+membrane+probes+for+advanced+cellular+imaging+and+neuroscience.">MemBright: A family of fluorescent membrane probes for advanced cellular imaging and neuroscience.</a> Cell Chemical Biology. 26 (4), 600-614 (2019).</li><li>Takov, K., Yellon, D. M., Davidson, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confounding+factors+in+vesicle+uptake+studies+using+fluorescent+lipophilic+membrane+dyes.">Confounding factors in vesicle uptake studies using fluorescent lipophilic membrane dyes.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1388731 (2017).</li><li>Tian, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quality+and+efficiency+assessment+of+six+extracellular+vesicle+isolation+methods+by+nano-flow+cytometry.">Quality and efficiency assessment of six extracellular vesicle isolation methods by nano-flow cytometry.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 9 (1), 1697028 (2020).</li><li>Mondal, A., Ashiq, K. A., Phulpagar, P., Singh, D. K., Shiras, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effective+visualization+and+easy+tracking+of+extracellular+vesicles+in+glioma+cells.">Effective visualization and easy tracking of extracellular vesicles in glioma cells.</a> Biological Procedures Online. 21, 4 (2019).</li><li>Gelibter, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+storage+on+extracellular+vesicles:+A+systematic+study.">The impact of storage on extracellular vesicles: A systematic study.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 11 (2), 12162 (2022).</li><li>Jayachandran, M., Miller, V. M., Heit, J. A., Owen, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methodology+for+isolation,+identification+and+characterization+of+microvesicles+in+peripheral+blood.">Methodology for isolation, identification and characterization of microvesicles in peripheral blood.</a> Journal of Immunological Methods. 375 (1-2), 207-214 (2012).</li><li>Mizenko, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tetraspanins+are+unevenly+distributed+across+single+extracellular+vesicles+and+bias+sensitivity+to+multiplexed+cancer+biomarkers.">Tetraspanins are unevenly distributed across single extracellular vesicles and bias sensitivity to multiplexed cancer biomarkers.</a> Journal of Nanobiotechnology. 19 (1), 250 (2021).</li><li>Kowal, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+comparison+defines+novel+markers+to+characterize+heterogeneous+populations+of+extracellular+vesicle+subtypes.">Proteomic comparison defines novel markers to characterize heterogeneous populations of extracellular vesicle subtypes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (8), 968-977 (2016).</li><li>Laulagnier, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid+precursor+protein+products+concentrate+in+a+subset+of+exosomes+specifically+endocytosed+by+neurons.">Amyloid precursor protein products concentrate in a subset of exosomes specifically endocytosed by neurons.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (4), 757-773 (2018).</li><li>Simonsen, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+are+we+looking+at?+Extracellular+vesicles,+lipoproteins,+or+both.">What are we looking at? Extracellular vesicles, lipoproteins, or both.</a> Circulation Research. 121 (8), 920-922 (2017).</li><li>S&#243;dar, B. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low-density+lipoprotein+mimics+blood+plasma-derived+exosomes+and+microvesicles+during+isolation+and+detection.">Low-density lipoprotein mimics blood plasma-derived exosomes and microvesicles during isolation and detection.</a> Scientific Reports. 6, 24316 (2016).</li><li>Brennan, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+methods+for+the+isolation+and+separation+of+extracellular+vesicles+from+protein+and+lipid+particles+in+human+serum.">A comparison of methods for the isolation and separation of extracellular vesicles from protein and lipid particles in human serum.</a> Scientific Reports. 10 (1), 103 (2020).</li><li>Welton, J. L., Webber, J. P., Botos, L. -. A., Jones, M., Clayton, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ready-made+chromatography+columns+for+extracellular+vesicle+isolation+from+plasma.">Ready-made chromatography columns for extracellular vesicle isolation from plasma.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 4, 27269 (2015).</li><li>Peruzzotti-Jametti, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+stem+cells+traffic+functional+mitochondria+via+extracellular+vesicles.">Neural stem cells traffic functional mitochondria via extracellular vesicles.</a> PLOS Biology. 19 (4), 3001166 (2021).</li><li>Arab, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+extracellular+vesicles+and+synthetic+nanoparticles+with+four+orthogonal+single-particle+analysis+platforms.">Characterization of extracellular vesicles and synthetic nanoparticles with four orthogonal single-particle analysis platforms.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 10 (6), 12079 (2021).</li><li>Th&#233;ry, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimal+information+for+studies+of+extracellular+vesicles+2018+(MISEV2018):+a+position+statement+of+the+International+Society+for+Extracellular+Vesicles+and+update+of+the+MISEV2014+guidelines.">Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).</li></ol>

ए.एल., बी.पी., डी.ए., आर.एल., आर.टी. नैनोएफसीएम के कर्मचारी हैं और इस पेपर में उनका योगदान उनके रोजगार के हिस्से के रूप में किया गया था।

ईवी क्या हैं? एक्स्ट्रासेल्युलर वेसिकल्स (ईवी) कई सामान्य सेलुलर और ऊतक गतिविधियों के अभिन्न अंग सेल-व्युत्पन्न झिल्लीदार कणों की एक श्रृंखला के लिए सामूहिक शब्द हैं। वैज्ञानिक क्षेत्रों की एक विस्तृत श्रृंखला पर उनके प्रभाव और उनकी संभावित नैदानिक प्रासंगिकता ने ईवी अनुसंधान और औद्योगिक हित में वृद्धि को प्रेरितकिया है। छोटे ईवी (एसईवी) अनुसंधान मुख्य रूप से एक्सोसोम, 40-100 एनएम कणों पर केंद्रित है जो परिपक्वता से पहले शुरुआती एंडोसोम में गठन शुरू करते हैं और प्लाज्मा झिल्ली में मल्टी-वेसिकुलर बॉडी (एमवीबी) के संलयन के माध्यम से रिलीज होते हैं, साथ ही माइक्रोवेसिकल्स, जो सीधे प्लाज्मा झिल्ली से 80-1,000 एनएम कणबनाते हैं। एक तीसरी ईवी आबादी एपोप्टोटिक निकाय हैं, कोशिका मृत्यु के दौरान 50-1,500 एनएम कण बनते हैं, जिसका अर्थ है कि अन्य ईवी के लिए उनका सापेक्ष अनुपात बहुत परिवर्तनशील हो सकताहै।
चूंकि ईवी विशेषताएं उनके सेल / मूल के ऊतक में होने वाले परिवर्तनों का प्रतिनिधित्व कर सकती हैं, इसलिए निदान में उनके उपयोग की संभावना है। विभिन्न 'ओमिक्स' विश्लेषणों ने कोशिका उत्पत्ति और रोग की स्थिति के मार्करों की पहचान करना शुरू कर दिया है, जो ईवी स्रोतों जैसे रक्त प्लाज्मा / सीरम, मूत्र, लार और सेरेब्रल स्पाइनल फ्लूइड (सीएसएफ) 4,5 का उपयोग करके रोगियों के गैर-इनवेसिव मूल्यांकन की अनुमति दे सकता है। इन ईवी से संबंधित नवाचारों के पीछे एक प्रेरणा शक्ति नई लक्षण वर्णन तकनीकें हैं जो पिछली सीमाओं को दूर करती हैं।
एकल ईवी लक्षण वर्णन की आवश्यकता और चुनौतियां एकल ईवी लक्षण वर्णन ईवी आइसोलेट्स के सत्यापन और विवरण दोनों के लिए तेजी से महत्वपूर्ण होता जा रहा है, साथ ही ईवी-आधारित उपचारों और निदानकी प्रगति के लिए इन नैनोकणों की प्रमुख विशेषताओं को स्पष्ट करता है। ईवी स्रोत और इच्छित उपयोग के आधार पर, शुद्धता का विश्लेषण, जिसे अक्सर ईवी से गैर-ईवी कणों के अनुपात के रूप में या ईवी से मुक्त प्रोटीन के रूप में वर्णित किया जाता है, को कई एनालिटिक्स 7 से महत्वपूर्ण मात्रा में डेटा की आवश्यकता हो सकतीहै।
ईवी प्रकाशनों में कण गणना और आकार माप पहले नैनोपार्टिकल ट्रैकिंग (एनटीए), प्रतिरोधक पल्स सेंसिंग (आरपीएस), और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (ईएम) 2 पर बहुत अधिक निर्भर हैं। मानक एनटीए और आरपीएस में ईवी को गैर-ईवी कणों से अलग करने की क्षमता की कमी है और उनकी अपनी चेतावनी है जैसे कि धीमी थ्रूपुट8 और एनटीए 9,10,11 के साथ देखी गई पहचान की अनुपयुक्त निचली सीमा।
टेट्रास्पैनिन सीडी 9, सीडी 63, और सीडी 81 ऐतिहासिक रूप से ईवी अलगाव / तैयारी में ईवी की उपस्थिति के लिए महत्वपूर्ण पहचानकर्ता रहे हैं। आमतौर पर, सेल लाइसेट12 की तुलना में ईवी आइसोलेट्स में इन प्रोटीनों के संवर्धन को दिखाने के लिए पश्चिमी सोख्ता (डब्ल्यूबी) और डॉट ब्लॉटिंग तकनीकों का उपयोग किया जाता है। हालांकि, ईवी उप-आबादी और सेल, ऊतक या रोगी से संबंधित भिन्नता दोनों के भीतर प्रदर्शन के संबंध में इन विधियों की मात्रा की कमी और इन ईवी मार्करों की विविधता, उन्नत विश्लेषणात्मक तकनीकों को प्रोत्साहित करती है, जो भौतिक और फेनोटाइपिक लक्षण वर्णनको एकीकृत करती हैं।
नैनो-फ्लो साइटोमेट्री एक व्यापक ईवी विश्लेषण तकनीक के रूप में सही ईवी सांद्रता का निर्धारण करने के लिए बरकरार कणों की पहचान और एक सार्वभौमिक मार्कर की आवश्यकता होती है, विशेष रूप से जटिल कण आइसोलेट्स में, जिसमें संकल्प सभी ईवी का पता लगाने में सक्षम होता है, जबकि उन्हें गैर-ईवी कणों से अलग कियाजाता है।
नैनो-फ्लो साइटोमेट्री (एनएफसीएम) एक ऐसी तकनीक है जो कण उप-आबादी की पहचान करने के लिए फ्लोरोसेंट लेबलिंग और पहचान का उपयोग करते हुए 45-1,000 एनएम के बीच आकार के कणों के अनलेबल विश्लेषण की अनुमति देती है। पारंपरिक प्रवाह साइटोमेट्री से एक महत्वपूर्ण अंतर नैनोपार्टिकल विश्लेषण के लिए समर्पित उपकरणों का उपयोग है, जो सबसे बड़े रिज़ॉल्यूशन15 की अनुमति देता है। ईवी विश्लेषण, जो छोटे कण विश्लेषण के लिए पारंपरिक प्रवाह इंस्ट्रूमेंटेशन का उपयोग करता है, में सुधार हो रहा है, लेकिन फिर भी <100 एनएम ईवी16,17 का पता लगाने और विश्लेषण करने के लिए संकल्प प्राप्त करने के लिए संघर्ष करता है। बीड-आधारित फ्लो साइटोमेट्री एक और अनुकूलन है जो अक्सर ईवी विश्लेषण के लिए नियोजित होता है, लेकिन यह एकल कण का पता लगाने की संभावना को हटा देता है और कैप्चर आधारित पूर्वाग्रहों का परिचय देताहै।
ईवी विश्लेषण के लिए साइड स्कैटर (एसएस) चैनल में ~ 45 एनएम की पहचान की कम सीमा से लाभान्वित, एनएफसीएम एसएस ट्रिगरिंग का उपयोग करता है। इसे 'कण प्रथम' विश्लेषण के रूप में माना जा सकता है क्योंकि इसका मतलब है कि घटनाओं को प्रतिदीप्ति तीव्रता के विश्लेषण से पहले एक निर्धारित सीमा को पार करते हुए एक एसएस संकेत प्रदान करना चाहिए। यह अवक्रमित झिल्ली और फ्लोरोफोरे एकत्रीकरण जैसे झूठे सकारात्मक को हटा देता है, और बरकरार ईवी15 पर विश्लेषण केंद्रित करता है। एसएस माप का उपयोग चार-मोडल सिलिका नैनोस्फीयर मानक19 की तुलना में व्यक्तिगत कणों को आकार देने के लिए भी किया जाता है। प्रतिदीप्ति माप दो और डिटेक्टरों पर लिया जाता है, जिससे ईवी उप-आबादी20 की पहचान करने के लिए कण एकाग्रता, आकार और मार्करों की उपस्थिति या रुचि के अन्य लक्ष्यों का वर्णन करने के लिए प्रत्येक कण के लिए तीन साथ-साथ माप की अनुमति मिलती है।
निम्नलिखित प्रयोग में, एसएस और फ्लोरोसेंट (एफएल) माप का उपयोग >45 एनएम कणों को मापने, झिल्ली सकारात्मक ईवी के उप-समूह को दिखाने और ईवी उप-आबादी पर सीडी 9, सीडी 63, सीडी 81 प्रस्तुति की पहचान करने के लिए किया जाता है। एसएस द्वारा मापे गए कुल कणों के हिस्से के रूप में इन उप-आबादी की एकाग्रता और उनके अनुपात दोनों का वर्णन किया गया है, जैसा कि उनके आकार प्रोफाइल हैं।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>APC Anti-CD81 antibody (M38)</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab233259</td>
			<td>Anti-Human CD81 APC 
			conjugated antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC Anti-CD9 antibody (EM-04)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab82392</td>
			<td>Anti-mouse CD9 APC 
			conjugated antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC Anti-CD9 antibody (MEM-61), prediluted</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab82389</td>
			<td>Anti-Human CD9 APC 
			conjugated antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC anti-mouse CD63 antibody</td>
			<td>biolegend</td>
			<td>143905</td>
			<td>Anti-Mouse CD63 APC 
			conjugated antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC anti-mouse/rat CD81 antibody</td>
			<td>biolegend</td>
			<td>104909</td>
			<td>Anti-Mouse CD81 APC 
			conjugated antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD63 monoclonal antibody (MEM-259), APC</td>
			<td>invitrogen Via Fisherscientific</td>
			<td>A15712</td>
			<td>Anti-Human CD63 APC 
			conjugated antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Celline AD1000 bioreactor</td>
			<td>Merck</td>
			<td>Z688037-5EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cleaning solution</td>
			<td>NanoFCM</td>
			<td>17159</td>
			<td>In house cleaning solution for nanoanalyser</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVs from C2C12</td>
			<td>Gifted</td>
			<td></td>
			<td>Mouse line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVs from SW620</td>
			<td>Gifted</td>
			<td></td>
			<td>Human line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Memglow - Fluorogenic Membrane Probe</td>
			<td>Cytoskeleton</td>
			<td>MG01</td>
			<td>non toxic cell membrane dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoAnalyzer</td>
			<td>NanoFCM</td>
			<td></td>
			<td>nano-flow cytometer for measurement of single particles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS, pH 7.2</td>
			<td>Gibco Via Fisherscientific</td>
			<td>12549079</td>
			<td>Salt solution for dilution of samples and antibodies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Snaplock Microtubes, 0.60mL</td>
			<td>Axygen Via Fisherscientific</td>
			<td>11371944</td>
			<td>Tubes required to load sample into nanoanalyser</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single extracellular vesicle transmembrane protein characterization by nano-flow cytometry

एकल कण लक्षण वर्णन बाह्य पुटिकाओं में अनुसंधान के लिए तेजी से प्रासंगिक हो गया है, थोक विश्लेषण तकनीकों और पहली पीढ़ी के कण विश्लेषण से नैनो-फ्लो साइटोमेट्री (एनएफसीएम) जैसे व्यापक बहु-पैरामीटर माप तक प्रगति कर रहा है। एनएफसीएम फ्लो साइटोमेट्री का एक रूप है जो विशेष रूप से नैनो-कण विश्लेषण के लिए डिज़ाइन किए गए इंस्ट्रूमेंटेशन का उपयोग करता है, जिससे हजारों ईवी को धुंधला तकनीकों के उपयोग के साथ और बिना प्रति मिनट विशेषता दी जा सकती है। उच्च रिज़ॉल्यूशन साइड स्कैटर (एसएस) का पता लगाने से 45 एनएम से बड़े सभी जैविक कणों के लिए आकार और एकाग्रता निर्धारित करने की अनुमति मिलती है, जबकि एक साथ प्रतिदीप्ति (एफएल) का पता लगाने से लेबल मार्करों और रुचि के लक्ष्यों की उपस्थिति की पहचान होती है। लेबल की गई उप-आबादी को तब कणों / एमएल की मात्रात्मक इकाइयों में या साइड स्कैटर द्वारा पहचाने गए कुल कणों के प्रतिशत के रूप में वर्णित किया जा सकता है।
यहां, वातानुकूलित सेल कल्चर मीडिया (सीसीएम) से प्राप्त ईवी को एक लिपिड डाई दोनों के साथ लेबल किया जाता है, ताकि झिल्ली के साथ कणों की पहचान की जा सके, और सीडी 9, सीडी 63 और सीडी 81 के लिए विशिष्ट एंटीबॉडी सामान्य ईवी मार्करों के रूप में। तुलना सामग्री के माप, एक एकाग्रता मानक और सिलिका नैनोस्फीयर के आकार मानक, साथ ही लेबल नमूना सामग्री का विश्लेषण 1 मिनट के विश्लेषण में किया जाता है। सॉफ्टवेयर का उपयोग तब लेबलिंग से स्वतंत्र सभी कणों की एकाग्रता और आकार वितरण प्रोफ़ाइल को मापने के लिए किया जाता है, इससे पहले कि प्रत्येक लेबल के लिए सकारात्मक कणों का निर्धारण किया जाए।
एक साथ एसएस और एफएल डिटेक्शन का उपयोग कई अलग-अलग ईवी स्रोतों और लेबलिंग लक्ष्यों, बाहरी और आंतरिक दोनों के साथ लचीले ढंग से किया जा सकता है, जो व्यापक और मात्रात्मक तरीके से ईवी नमूनों का वर्णन करते हैं।

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Single Extracellular Vesicle Transmembrane Protein Characterization by Nano-Flow Cytometry

ईवी लक्षण वर्णन उपकरण की नवीनतम पीढ़ी एक साथ कई मापदंडों में एकल ईवी विश्लेषण करने में सक्षम हैं। नैनो-फ्लो साइटोमेट्री लेबलिंग के बिना 45 एनएम से बड़े सभी जैविक कणों को मापता है और विभिन्न फ्लोरोसेंट लेबलिंग तकनीकों द्वारा उप-आबादी की विशिष्ट विशेषताओं की पहचान करता है।

नैनो-फ्लो साइटोमेट्री द्वारा एकल बाह्य पुटिका ट्रांसमेम्ब्रेन प्रोटीन लक्षण वर्णन

Single particle characterization has become increasingly relevant for research into extracellular vesicles, progressing from bulk analysis techniques and ...

ईवी का गहन लक्षण वर्णन चुनौतीपूर्ण हो सकता है, जिसमें व्यक्तिगत मापदंडों का वर्णन करने के लिए कई उपकरणों की आवश्यकता होती है। नैनो-फ्लो साइटोमेट्री जैसी एकल तकनीक में इन प्रमुख मानदंडों को मापना एक साथ कई ईवी उप-आबादी का वर्णन करता है। इसलिए प्रत्येक ईवी को उनके प्रतिदीप्ति का निर्धारण करने से पहले 14 नैनोमीटर से बड़े कणों को व्यक्तिगत रूप से पहचाना जाता है।यह झूठे सकारात्मक को हटाकर एक मजबूत डेटा सेट करता है। नैनो-फ्लो साइटोमेट्री को विभिन्न स्रोतों से ईवी पर लागू किया जा सकता है, जिसमें प्लाज्मा, सीएसएफ और संस्कृति माध्यम से समृद्ध शामिल हैं। इस तकनीक का उपयोग वायरस, लिपिड नैनोकणों और नैनोमटेरियल्स के विश्लेषण के लिए भी किया जाता है।लेबलिंग प्रोटोकॉल को अनुकूलित करना महत्वपूर्ण है। यह बफर में छोड़े गए किसी भी अवशिष्ट प्रतिदीप्ति की तुलना में एक कण से जुड़े किसी भी प्रतिदीप्ति को अधिकतम करता है। शुरू करने के लिए, उपकरण को चालू करें, नैनो-फ्लो प्रोफेशन लोड करें और शीथ फ्लो ड्रॉपडाउन मेनू से स्टार्ट अप का चयन करें, लोडिंग बे में पानी लोड करें, और शीथ फ्लो ड्रॉपडाउन मेनू से बूस्टिंग का चयन करें।क्यूसी मोतियों को 0.6 माइक्रोलीटर ट्यूब में आसुत जल में एक से 100 तक पतला करें, और नमूना को सिस्टम में पेश करने के लिए इसे लोडिंग बे में रखें। फिर पिछले नमूने, पानी या सफाई समाधान को पूरी तरह से बदलने के लिए पहले दिखाए गए अनुसार 45 सेकंड के लिए नमूने को बढ़ावा दें। बूस्ट करते समय, क्यूसी बीड्स के लिए प्रीसेट टेम्पलेट पर लेजर पावर को 250 नैनोमीटर एफएल क्यूसी मानक पर सेट करें।बाद में, सिस्टम दबाव को कम करने के लिए, उसी ड्रॉपडाउन मेनू से नमूना दबाव का चयन करें और निरंतर दबाव बनाए रखने के लिए ऑटो-सैंपलिंग दबाव को एक किलो पास्कल पर सेट करें। फिर अधिग्रहण नियंत्रणों से टाइम टू रिकॉर्ड का चयन करके एक मिनट का विश्लेषण शुरू करें। डेटा को डॉट प्लॉट पर प्लॉट किया जाएगा, जिसमें साइड स्कैटर तीव्रता के लिए लॉग स्केल और एक चयनित फ्लोरेसेंस तीव्रता दिखाई जाएगी।फ़ाइल सहेजने से पहले, फ़ाइल नाम और नमूना कमजोर पड़ने डालें. इसके बाद, लोडिंग बे से ट्यूब को हटाने के लिए अनलोड का चयन करें। क्यूसी मोतियों को सफाई समाधान के 150 माइक्रोलीटर के साथ बदलें और बूस्टिंग का चयन करके 30 सेकंड से अधिक समय तक साफ करें।150 माइक्रोलीटर पानी युक्त ट्यूब का उपयोग करके, पानी में नोक डुबोकर केशिका टिप से किसी भी अतिरिक्त सफाई समाधान को हटा दें। फिर आकार मानक मोतियों को पानी में एक से 100 तक पतला करें और लोडिंग बे में 100 माइक्रोलीटर लोड करें। अब, लेजर पावर को प्रीसेट टेम्पलेट, एस 16 एक्सो 68 से 155 नैनोमीटर पर सेट करें।यह सेटिंग आकार मानक और 200 नैनोमीटर से छोटे ईवी वाले नमूने दोनों के लिए है। नमूनाकरण का चयन करें और एक मिनट के लिए नमूना रिकॉर्ड करने के लिए आगे बढ़ें। तीसरा माप या तो पानी या पीबीएस नमूने के साथ एक रिक्त माप अवमूल्यन बनाने के लिए करें, सॉफ्टवेयर द्वारा हटाने के लिए झूठी सकारात्मकता की पहचान करें।एनएफसीएम विश्लेषण के लिए पीबीएस में अनलेबल ईवी नमूनों को एक गुना 10 से आठवें से पांच गुना 10 से आठवें कण प्रति मिलीलीटर की उपयुक्त कण एकाग्रता सीमा तक पतला करें। और पतला नमूना के 10 से 100 माइक्रोलीटर को लोडिंग बे में लोड करें। यदि कण एकाग्रता अज्ञात है, तो ईवी नमूने के एक से 100 कमजोर पड़ने से शुरू करें।नमूना एकाग्रता को बूस्टिंग के दौरान सीसीडी कैमरे पर लेजर स्पॉट के आकार से या नमूनाकरण के दौरान घटना के फटने के निशान के अवलोकन से जल्दी से अनुमानित किया जा सकता है। एक बार लोड किए गए नमूने को 45 सेकंड के लिए बढ़ाया जाता है, तो एक मिनट के लिए रिकॉर्ड करें और फ़ाइल को सहेजें जैसा कि पहले दिखाया गया है। रिकॉर्डिंग के बाद, इस डेटा का विश्लेषण शुरू करें, अधिग्रहण टैब से विश्लेषण टैब पर स्विच करें और सहेजी गई एनएफए फ़ाइलों को खोलें।सटीक नमूना माप के लिए, नमूना तुलना के साथ-साथ रिक्त स्थान के लिए मान सेट करने के लिए नमूना माप से पहले लिए गए दो मानक मापों का उपयोग करें। आकार मानक फ़ाइल का चयन करके और सेट थ्रेशोल्ड टूल का उपयोग करके साइड स्कैटर से व्यास रूपांतरण के लिए आकार मानक वक्र बनाएं। घटना विस्फोट ट्रेस में दिखाई देने वाली दहलीज, किसी घटना को महत्वपूर्ण माने जाने के लिए आवश्यक न्यूनतम सिग्नल तीव्रता की पहचान करती है।थ्रेशोल्ड सेट के साथ, एक्स-अक्ष पर डॉट प्लॉट पैरामीटर, एसएस-एच या एसएस-ए और वाई अक्ष पर एफआईटीसी-ए की जांच करें। मानक वक्र जनरेशन टूल खोलें और साइज़िंग टेम्पलेट के रूप में S16 EXO 68 से 155 नैनोमीटर का चयन करें। पीक साइड स्कैटर तीव्रता को 68, 91, 113, या 155 नैनोमीटर व्यास कणों के रूप में पहचानने के लिए पीक्स पर क्लिक करें।खिड़की को बंद करने से पहले, जांचें कि व्यास वक्र में बिखरी हुई तरफ एक के करीब आर मान के साथ उत्पन्न हुई है या नहीं। एकाग्रता मानक निर्धारित करें। सहेजी गई फ़ाइल का चयन करें, गणना मानक पर क्लिक करें और मानक की कण एकाग्रता इनपुट करें।मानक जानकारी सेट करें। ईवी नमूना फ़ाइल का चयन करें और सीमा सेट करें। रिक्त फ़ाइल का चयन करें और नमूना गणना से हटाने के लिए झूठे सकारात्मक की संख्या की पहचान करने के लिए रिक्त सेट पर क्लिक करें।एक बार पीडीएफ जनरेशन टूल खुल जाने के बाद, नमूने के आकार, एकाग्रता और कमजोर पड़ने की जांच करें। फिर नमूने की एकाग्रता और कणों के आकार वितरण को दिखाएं। पांडुलिपि में वर्णित ईवी नमूनों को लेबल करने के बाद, लेबल किए गए नमूने का एक माइक्रोलीटर लें और 0.6 मिलीलीटर ट्यूब में पीबीएस में एक से 50 तक पतला करें।नमूने को लोडिंग बे में लोड करें और 45 सेकंड के लिए बूस्टिंग दबाव लागू करें। इसके अलावा, सुनिश्चित करें कि सही लेजर सेटिंग्स और उपयुक्त लेंस लोड किए गए हैं। अब, नमूना दबाव पर स्विच करें और रिकॉर्ड करने के लिए समय का चयन करें।एक मिनट के अधिग्रहण के बाद, डेटा फ़ाइल को नाम दें और सहेजें। नमूना अनलोड करें, इसे सफाई समाधान से बदलें, और पहले दिखाए गए अगले लेबल वाले नमूने को लोड करने से पहले 30 सेकंड से अधिक समय तक सफाई समाधान को बढ़ावा दें। पीडीएफ पीढ़ी के लिए, पहले दिखाए गए मानकों के समान मानकों को लागू करें।केवल रिक्त माप अलग तरह से सेट किया जाएगा। नमूना फ़ाइल का चयन करें और सीमा सेट करें। गेटिंग टूल का चयन करें और प्रतिदीप्ति सकारात्मक आबादी को अलग करने वाली रेखा खींचने के लिए बाएं क्लिक का उपयोग करें।प्रतिनिधित्व के लिए नाम और रंग सेट करें. रिक्त फ़ाइल सेट करें और प्रत्येक अलग-अलग आबादी से हटाने के लिए झूठे सकारात्मक की संख्या की पहचान करने के लिए सेट रिक्त पर क्लिक करें। पीडीएफ जनरेशन टूल खोलें और फ्लोरेसेंस पॉजिटिव सबपॉपुलेशन के आकार वितरण, एकाग्रता और प्रतिशत की पहचान करें।डॉट प्लॉट पर, हरे या लाल चैनल से प्रतिदीप्ति माप दिखाने के लिए वाई-अक्ष को बदलें। रिक्त स्थान सेट करें और पीडीएफ उत्पन्न करें जैसा कि पहले दिखाया गया है। डॉट प्लॉट पर, एक्स-अक्ष को एफआईटीसी और वाई अक्ष को एपीसी पर सेट करें।डबल फ्लोरोसेंट पॉजिटिव आबादी की पहचान करने के लिए क्वाड्रंट टूल का उपयोग करें। प्रतिनिधि होने के लिए नाम और रंग सेट करें, फिर पीडीएफ फाइल खोलें और फ्लोरोसेंट उप-आबादी का चयन करें। C2C12 व्युत्पन्न EV ने लगभग 50% CD9, 30% CD63 प्रस्तुति दिखाई, और 70% आबादी ने तीन EV मार्करों में से कम से कम एक प्रस्तुत किया।एकल टेट्रास्पैनिन-लेबल ईवी उप-आबादी के लिए आकार प्रोफाइल ने कुल कण आबादी की तुलना में लगभग 75 से 85 नैनोमीटर का बड़ा औसत आकार और 65 नैनोमीटर ईवी से कम दिखाया। SW620-व्युत्पन्न ईवी ने लगभग 40% CD9, 7% CD63 प्रस्तुति और 42% कणों को तीन मार्करों में से कम से कम एक के रूप में दिखाया। एसडब्ल्यू 620-व्युत्पन्न, टेट्रास्पैनिन-लेबल ईवी ने अलग-अलग टेट्रास्पैनिन पॉजिटिव उप-आबादी के बीच समान वितरण के साथ 90 से 110 नैनोमीटर के बीच अधिक सामान्य वितरण और बड़ा औसत व्यास दिखाया।मेम्ब्रेन लेबलिंग ने बार-बार C2C12 और SW620-व्युत्पन्न ईवी की 80% सकारात्मकता दिखाई। साइड स्कैटर तीव्रता C2C12 और SW620 दोनों के डॉट प्लॉट पर FITC तीव्रता के साथ सहसंबद्ध है। डबल सकारात्मक प्रतिशत टेट्रास्पैनिन सकारात्मक प्रतिशत के समान हैं।और सीडी 63 लेबलिंग झिल्ली लेबलिंग के लिए सबसे कमजोर सहसंबंध दिखाती है। अतिरिक्त झिल्ली लेबलिंग के साथ और बिना एंटीबॉडी लेबलिंग के बीच प्रतिशत सकारात्मकता माप समान थे। सी 2 सी 12-व्युत्पन्न ईवी की फ्लोरोसेंट आबादी के लिए औसत प्रतिदीप्ति तीव्रता ने सीडी 9 ईवी की तुलना में सीडी 63 और सीडी 81 की कम प्रस्तुति का सुझाव दिया, जबकि एसडब्ल्यू 620 ने दिखाया कि सभी तीन एंटीबॉडी का उपयोग किसी भी व्यक्तिगत एंटीबॉडी लेबल की तुलना में अधिक प्रतिदीप्ति संकेत प्रदान करता है, इस प्रोटोकॉल में, सामान्य ईवी मार्करों को फ्लोरोसेंटली लेबल किया गया है, लेकिन ईवी मूल दिखाने के लिए कई एंटीबॉडी लक्ष्यों को चुना जा सकता है। ईवी फ़ंक्शन, या रोग की स्थिति।

Research

JoVE Journal

Biology

IP-FCM:  Immunoprecipitation Detected by Flow Cytometry

आईपी ​​FCM: प्रवाह cytometry द्वारा पता लगाया गया immunoprecipitation

Immunoprecipitation detected by flow cytometry (IP-FCM) is an efficient method for detecting and quantifying protein-protein interactions. The basic ...

Transmembrane Domain Oligomerization Propensity determined by ToxR Assay

Transmembrane डोमेन Oligomerization प्रवृत्ति ToxR परख द्वारा निर्धारित

The oversimplified view of protein transmembrane domains as merely anchors in phospholipid bilayers has long since been disproven.  In many cases ...

Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae

Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae

और सिस्टिक फाइब्रोसिस transmembrane प्रवाहकत्त्व नियामक में प्रोटीन की अभिव्यक्ति और शोधन Saccharomyces cerevisiae

The  cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) is a chloride  channel, that when mutated, can give rise to cystic fibrosis in  ...

Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein Expressed in Saccharomyces cerevisiae

Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein Expressed in Saccharomyces cerevisiae

में अभिव्यक्त किए जाते हैं सिस्टिक फाइब्रोसिस transmembrane प्रवाहकत्त्व नियामक प्रोटीन का शुद्धीकरण<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Defects in the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) protein cause cystic fibrosis (CF), an autosomal recessive disease that ...

Characterization of G Protein-coupled Receptors by a Fluorescence-based Calcium Mobilization Assay

एक प्रतिदीप्ति आधारित कैल्शियम अभिप्रेरण परख द्वारा जी प्रोटीन युग्मित रिसेप्टर्स की विशेषता

For more than 20 years, reverse pharmacology has been the preeminent strategy to discover the activating ligands of orphan G protein-coupled receptors ...

High Efficiency Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells to Cardiomyocytes and Characterization by Flow Cytometry

फ्लो द्वारा उच्च क्षमता cardiomyocytes को मानव pluripotent स्टेम कोशिकाओं के भेदभाव और विशेषता

There is an urgent need to develop approaches for repairing the damaged heart, discovering new therapeutic drugs that do not have toxic effects on the ...

Techniques for the Analysis of Extracellular Vesicles Using Flow Cytometry

फ्लो का प्रयोग कोशिकी vesicles के विश्लेषण के लिए तकनीक

Extracellular Vesicles (EVs) are small, membrane-derived vesicles found in bodily fluids that are highly involved in cell-cell communication and help ...

Detecting and Characterizing Protein Self-Assembly In Vivo by Flow Cytometry

प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा विवो में प्रोटीन स्व-असेम्बली का पता लगाने और विशेषता

Protein self-assembly governs protein function and compartmentalizes cellular processes in space and time. Current methods to study it suffer from ...

Quantification of Cellular Densities and Antigenic Properties using Magnetic Levitation

चुंबकीय उत्तोलन का उपयोग करके सेलुलर घनत्व और एंटीजेनिक गुणों का मात्राकरण

The described method was developed based on the principles of magnetic levitation, which separates cells and particles based on their density and magnetic ...

Extracellular Vesicle Uptake Assay via Confocal Microscope Imaging Analysis

Extracellular Vesicle Uptake Assay via Confocal Microscope Imaging Analysis

Confocal माइक्रोस्कोप इमेजिंग विश्लेषण के माध्यम से बाह्य कोशिकीय पुटिका अपटेक परख

There is a need for practical assays to visualize and quantify the cells' extracellular vesicle (EV) uptake. EV uptake plays a role in intercellular ...