Name: use of dual optical tweezers and microfluidics for single-molecule studies
Uploaded: 2022-11-18T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Use of Dual Optical Tweezers and Microfluidics for Single-Molecule Studies at JoVE.com

يتم دعم البحث في مختبر بيانكو من خلال منح المعاهد الوطنية للصحة GM100156 و GM144414 إلى PRB

1. محاذاة مصيدة الليزر واختبارها باستخدام حبات البوليسترين
ملاحظة: للإعداد ، راجع الشكل 1 أ ، ب.
تنبيه: يجب على القائم بالتجربة ارتداء نظارات واقية مناسبة أو نظارات أمان بالليزر أثناء محاذاة شعاع الليزر. نظرا لأن نظام الملقط ا?...

<ol>
	<li>Bianco, P. R., Lu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+insight+into+stalled+replication+fork+rescue+in+Escherichia+coli.">Single-molecule insight into stalled replication fork rescue in Escherichia coli.</a> Nucleic Acids Research. 49 (8), 4220-4238 (2021).</li><li>Kaur, G., Lewis, J. S., van Oijen, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shining+a+spotlight+on+DNA:+Single-molecule+methods+to+visualise+DNA.">Shining a spotlight on DNA: Single-molecule methods to visualise DNA.</a> Molecules. 24 (3), 491 (2019).</li><li>Dame, R. T., Noom, M. C., Wuite, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+chromatin+organization+by+H-NS+protein+unravelled+using+dual+DNA+manipulation.">Bacterial chromatin organization by H-NS protein unravelled using dual DNA manipulation.</a> Nature. 444 (7117), 387-390 (2006).</li><li>Bianco, P. R., Bradfield, J. J., Castanza, L. R., Donnelly, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rad54+oligomers+translocate+and+cross-bridge+double-stranded+DNA+to+stimulate+synapsis.">Rad54 oligomers translocate and cross-bridge double-stranded DNA to stimulate synapsis.</a> Journal of Molecular Biology. 374 (3), 618-640 (2007).</li><li>Amitani, I., Liu, B., Dombrowski, C. C., Baskin, R. J., Kowalczykowski, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Watching+individual+proteins+acting+on+single+molecules+of+DNA.">Watching individual proteins acting on single molecules of DNA.</a> Methods in Enzymology. 472, 261-291 (2010).</li><li>Brewer, L. R., Bianco, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laminar+flow+cells+for+single-molecule+studies+of+DNA-protein+interactions.">Laminar flow cells for single-molecule studies of DNA-protein interactions.</a> Nature Methods. 5 (6), 517-525 (2008).</li><li>Visscher, K., Brakenhoff, G. J., Krol, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micromanipulation+by+multiple+optical+traps+created+by+a+single+fast+scanning+trap+integrated+with+the+bilateral+Confocal+scanning+laser+microscope.">Micromanipulation by multiple optical traps created by a single fast scanning trap integrated with the bilateral Confocal scanning laser microscope.</a> Cytometry. 14, 105-114 (1993).</li><li>Vermeulen, K. C., Mameren, J. v. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calibrating+bead+displacements+in+optical+tweezers+using+acousto-optic+deflectors.">Calibrating bead displacements in optical tweezers using acousto-optic deflectors.</a> Review of Scientific Instruments. 77 (1), 013704 (2006).</li><li>Dufresne, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computer-generated+holographic+optical+tweezers+arrays.">Computer-generated holographic optical tweezers arrays.</a> Review of Scientific Instruments. 72 (3), 1810 (2001).</li><li>Squires, T. M., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidics:+fluid+physics+at+the+nanoliter+scale.">Microfluidics: fluid physics at the nanoliter scale.</a> Reviews of Modern Physics. 77, 977-1026 (2005).</li><li>Weibel, D. B., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+microfluidics+in+chemical+biology.">Applications of microfluidics in chemical biology.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 10 (6), 584-591 (2006).</li><li>Tan, X., Mizuuchi, M., Mizuuchi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+transposition+target+immunity+and+the+determinants+of+the+MuB+distribution+patterns+on+DNA.">DNA transposition target immunity and the determinants of the MuB distribution patterns on DNA.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (35), 13925-13929 (2007).</li><li>Lima, R., Wada, S., Takeda, M., Tsubota, K., Yamaguchi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+confocal+micro-PIV+measurements+of+blood+flow+in+a+square+microchannel:+the+effect+of+the+haematocrit+on+instantaneous+velocity+profiles.">In vitro confocal micro-PIV measurements of blood flow in a square microchannel: the effect of the haematocrit on instantaneous velocity profiles.</a> Journal of Biomechanics. 40 (12), 2752-2757 (2007).</li><li>Bianco, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Processive+translocation+and+DNA+unwinding+by+individual+RecBCD+enzyme+molecules.">Processive translocation and DNA unwinding by individual RecBCD enzyme molecules.</a> Nature. 409 (6818), 374-378 (2001).</li><li>Forget, A. L., Dombrowski, C. C., Amitani, I., Kowalczykowski, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+protein-DNA+interactions+in+3D+using+in+situ+construction,+manipulation+and+visualization+of+individual+DNA+dumbbells+with+optical+traps,+microfluidics+and+fluorescence+microscopy.">Exploring protein-DNA interactions in 3D using in situ construction, manipulation and visualization of individual DNA dumbbells with optical traps, microfluidics and fluorescence microscopy.</a> Nature Protocol. 8 (3), 525-538 (2013).</li><li>Streets, A. M., Huang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidics+for+biological+measurements+with+single-molecule+resolution.">Microfluidics for biological measurements with single-molecule resolution.</a> Current Opinion in Biotechnology. 25, 69-77 (2014).</li><li>Madariaga-Marcos, J., Corti, R., Hormeno, S., Moreno-Herrero, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+microfluidic+approaches+for+a+fast+and+efficient+reagent+exchange+in+single-molecule+studies.">Characterizing microfluidic approaches for a fast and efficient reagent exchange in single-molecule studies.</a> Scientific Reports. 10 (1), 18069 (2020).</li><li>Grayson, P., Han, L., Winther, T., Phillips, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+observations+of+single+bacteriophage+lambda+DNA+ejections+in+vitro.">Real-time observations of single bacteriophage lambda DNA ejections in vitro.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (37), 14652-14657 (2007).</li><li>Luo, G., Wang, M., Konigsberg, W. H., Xie, X. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+and+ensemble+fluorescence+assays+for+a+functionally+important+conformational+change+in+T7+DNA+polymerase.">Single-molecule and ensemble fluorescence assays for a functionally important conformational change in T7 DNA polymerase.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (31), 12610-12615 (2007).</li><li>Sia, S. K., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+devices+fabricated+in+poly(dimethylsiloxane)+for+biological+studies.">Microfluidic devices fabricated in poly(dimethylsiloxane) for biological studies.</a> Electrophoresis. 24 (21), 3563-3576 (2003).</li><li>Wuite, G. J. L., Davenport, R. J., Rappaport, A., Bustamante, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+integrated+laser+trap/flow+control+video+microscope+for+the+study+of+single+biomolecules.">An integrated laser trap/flow control video microscope for the study of single biomolecules.</a> Biophysical Journal. 79 (2), 1155-1167 (2000).</li><li>Kim, S., Blainey, P. C., Schroeder, C. M., Xie, X. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+single-molecule+assay+for+enzymatic+activity+on+flow-stretched+DNA.">Multiplexed single-molecule assay for enzymatic activity on flow-stretched DNA.</a> Nature Methods. 4 (5), 397-399 (2007).</li><li>Tanaka, H., Ishijima, A., Honda, M., Saito, K., Yanagida, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orientation+dependence+of+displacements+by+a+single+one-headed+myosin+relative+to+the+actin+filament.">Orientation dependence of displacements by a single one-headed myosin relative to the actin filament.</a> Biophysical Journal. 75 (4), 1886-1894 (1998).</li><li>Merenda, F., Andrews, D. L., Galves, E. J., Nienhuis, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Refractive+multiple+optical+tweezers+for+parallel+biochemical+analysis+in+micro-fluidics.">Refractive multiple optical tweezers for parallel biochemical analysis in micro-fluidics.</a> Proceeding of SPIE. , 6483 (2007).</li><li>Brewer, L. R., Corzett, M., Balhorn, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protamine-induced+condensation+and+decondensation+of+the+same+DNA+molecule.">Protamine-induced condensation and decondensation of the same DNA molecule.</a> Science. 286 (5437), 120-123 (1999).</li><li>Ladoux, B., Quivy, J. P., Doyle, P. S., Almouzni, G., Viovy, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+imaging+of+single-molecules:+from+dynamics+of+a+single+DNA+chain+to+the+study+of+complex+DNA-protein+interactions.">Direct imaging of single-molecules: from dynamics of a single DNA chain to the study of complex DNA-protein interactions.</a> Science Progress. 84, 267-290 (2001).</li><li>Bianco, P. R., Bradfield, J. J., Castanza, L. R., Donnelly, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rad54+oligomers+translocate+and+cross-bridge+double-stranded+DNA+to+stimulate+synapsis.">Rad54 oligomers translocate and cross-bridge double-stranded DNA to stimulate synapsis.</a> Journal of Molecular Biology. 374 (3), 618-640 (2007).</li><li>Pezza, R. J., Camerini-Otero, R. D., Bianco, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hop2-Mnd1+condenses+DNA+to+stimulate+the+synapsis+phase+of+DNA+strand+exchange.">Hop2-Mnd1 condenses DNA to stimulate the synapsis phase of DNA strand exchange.</a> Biophysical Journal. 99 (11), 3763-3772 (2010).</li><li>Rye, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+fluorescent+complexes+of+double-stranded+DNA+with+bis-intercalating+asymmetric+cyanine+dyes:+properties+and+applications.">Stable fluorescent complexes of double-stranded DNA with bis-intercalating asymmetric cyanine dyes: properties and applications.</a> Nucleic Acids Research. 20 (11), 2803-2812 (1992).</li></ol>

يعد التجميع الدقيق لنظام التدفق أمرا بالغ الأهمية لنجاح نتائج التجارب 4,6. أحد أكثر جوانب البروتوكول تحديا هو ربط الموصلات بالسطح الزجاجي. لهذا ، نستخدم النهجين التاليين: موصلات الأنابيب المناسبة للضغط وتجميعات المنافذ النانوية. تلتصق الموصلات المناسبة لل?...

قدمت القدرة على تصور تفاعلات البروتين والحمض النووي على مستوى الجزيء الواحد وفي الوقت الفعلي نظرة ثاقبة مهمة لاستقرار الجينوم 1,2. بالإضافة إلى العمل مع جزيئات مفردة من الحمض النووي واحدا تلو الآخر ، فإن القدرة على عرض المعاملات بين الجزيئات الفردية القريبة توفر رؤية إضافية3،4،5. يتطلب التلاعب بجزيئات الحمض النووي الإضافية كلا من الفخاخ البصرية الإضافية بالإضافة إلى خلايا تدفق الموائع الدقيقة عالية الجودة ومتعددة القنوات6.
هناك العديد من الطرق المتاحة لإنشاء أكثر من مصيدة بصرية واحدة. وتشمل هذه مرايا مسح الجلفانومتر ، ومعدلات البصريات الصوتية ، والبصريات الحيود ، والتي تولد ملاقط بصرية ثلاثية الأبعاد4،7،8،9. في كثير من الأحيان ، تنتج مرايا المسح الضوئي والمعدلات البصرية الصوتية مصائد تشارك بالوقت. في الإعداد الموضح هنا ، يتم تقسيم شعاع ليزر Nd: YAG واحد على الاستقطاب ، ثم تتحكم مرايا المسح الضوئي بالليزر الجلفانومتر في موضع ما يسمى بالمصيدة المتنقلة (الشكل 1) 4. لتسهيل وضع المرايا والمرشحات لتوجيه شعاع الاصطياد إلى الفتحة الخلفية لهدف المجهر ، يتم استخدام ليزر HeNe. هذا يجعل المحاذاة الكلية أسهل لأن شعاع HeNe مرئي للعين المجردة ، في حين أن أشعة الأشعة تحت الحمراء ليست كذلك. يعد شعاع HeNe أيضا أكثر أمانا للعمل مع جعل وضع المرايا والمكونات الأخرى أقل إرهاقا. في البداية ، يكون مسار شعاع هذا الليزر منفصلا عن شعاع 1064 نانومتر ، ولكن يتم إدخاله في نفس مسار الحزمة ، ثم في هدف المجهر. بمجرد تحقيق المحاذاة المادية ، يتم وضع شعاع 1064 نانومتر أعلى شعاع HeNe ويتم تسهيل ذلك من خلال استخدام عارض الأشعة تحت الحمراء وأدوات تصوير الحزمة المختلفة لتصور موضع الحزمة وجودتها. بعد ذلك ، يتم إدخال موسع الحزمة ، ويتم محاذاة شعاع الأشعة تحت الحمراء الموسع الناتج على الفتحة الخلفية للهدف. أخيرا ، تتم إزالة الهدف ويتم قياس القدرة في كل حزمة مستقطبة وتعديلها باستخدام ألواح موجية λ / 2 لتكون متساوية (الشكل 1C). يتم إجراء قياسات الطاقة أيضا بمجرد إرجاع الهدف وعادة ما يكون هناك فقدان للطاقة بنسبة 53٪. ومع ذلك ، هناك طاقة كافية لتشكيل مصائد بصرية ثابتة ومتحركة مستقرة في المستوى البؤري (الشكل 1D).
لتصوير معاملات الحمض النووي ، تلعب خلايا تدفق الموائع الدقيقة دورا رئيسيا لأنها تسمح بالقياسات الخاضعة للرقابة على مستوى الجزيء الواحد بدقة مكانية وزمانية عالية (الشكل 2). يشير مصطلح الموائع الدقيقة إلى القدرة على معالجة السوائل في قناة واحدة أو أكثر بأبعاد تتراوح من 5-500 ميكرومتر10,11. يشير مصطلح التيار إلى السائل الفعلي داخل القناة وتشير القناة إلى القناة المادية التي يتحرك فيها تيار أو تيارات مائعة. يحتوي تصميم خلية التدفق أحادية القناة على قناة مادية مشتركة حيث يتم ملاحظة التفاعلات وعادة ما يكون هناك تيار سائل واحد فقط. وبالتالي ، تعرف هذه التصميمات باسم خلايا التدفق أحادية الدفق. في المقابل ، يتم تعريف خلايا التدفق متعددة الدفق على أنها جهاز موائع دقيقة تتلاقى فيه قناتان أو أكثر من قنوات الدخول في قناة مادية واحدة مشتركة (الشكل 2 أ). داخل القناة المشتركة ، تتدفق تيارات السوائل التي تنشأ من القنوات الفردية بالتوازي مع بعضها البعض ، وتظل منفصلة مع حدوث الحد الأدنى من الاختلاط بينها بسبب الانتشار (الشكل 2 ب). في معظم الإعدادات التجريبية ، تدفع مضخة واحدة السوائل إلى كل قناة بنفس السرعة. في المقابل ، عند استخدام التوجيه الحدودي ، تقوم ثلاث مضخات أو أكثر يتم التحكم فيها بشكل مستقل بدفع السوائل عبر القنوات. ومع ذلك ، تعمل كل مضخة بسرعة مختلفة ولكن معدل التدفق الصافي في القناة المشتركة ثابت12. هذا يسمح بالتبادل السريع لمكونات القناة الرئيسية ببساطة عن طريق تغيير سرعة المضخة.
بالإضافة إلى التدفق الصفحي ، هناك عامل حاسم آخر هو ملف تعريف سرعة القطع المكافئ داخل تيار السائل الرقائقي. تحدث أعلى سرعة تدفق في منتصف التيار ويحدث الأبطأ بجوار الأسطح (الشكل 2C)13. يجب اعتبار هذا المظهر الجانبي لتمديد جزيء الحمض النووي المرتبط بخرزة مثبتة في التيار بالكامل من أجل التصور الدقيق للحمض النووي الفلوري والتحليلات الدقيقة لجزيء واحد. هنا ، يمتد الحمض النووي إلى الشكل B ويتم تثبيته في مكانه تحت 0 pN من القوة. لتحقيق ذلك ، يجب أن يكون تركيز موضع المصيدة الضوئية على موضع 10-20 ميكرومتر من سطح الغطاء السفلي (الشكل 2D). يجب توخي الحذر حتى لا يمتد جزيء الحمض النووي إلى ما بعد الشكل B لأن هذا يمكن أن يمنع تفاعلات الإنزيم. في ظل ظروف المخزن المؤقت النموذجية ، 1 ميكرومتر = 3000 نقطة أساس من الحمض النووي14. علاوة على ذلك ، من خلال محاصرة 10-20 ميكرومتر من الغطاء ، يتم وضع مركب الحمض النووي بعيدا عن السطح وبالتالي تقليل التفاعلات السطحية.
تم استخدام العديد من الطرق لإنشاء قنوات جهاز الموائع الدقيقة ويمكن القيام بذلك في المختبر أو يمكن شراء خلايا التدفق من المصادر التجارية6،15،16،17. يجب أن تكون المواد المثلى المستخدمة لبناء خلايا التدفق صلبة ميكانيكيا ، وشفافة بصريا مع مضان منخفض ، وغير منفذة للمذيبات العضوية6. في كثير من الأحيان ، يتم استخدام الزجاج المصقول البورسليكات ، أو السيليكا المنصهرة لتوفير بيئة تدفق مستقرة لفترة طويلة مناسبة للاصطياد البصري والتصور واكتشاف القوة. تسمح هذه المواد أيضا باستخدام المذيبات غير المائية (على سبيل المثال ، الميثانول من الدرجة الطيفية) لتبسيط ترطيب السطح وإزالة فقاعات الهواء ، والمواد المسخة (على سبيل المثال ، 6M guanidinium hydrochloride) أو المنظفات لتنظيف خلية التدفق. أخيرا ، تختلف الطرق المستخدمة لإدخال السوائل في خلايا التدفق من أنظمة مضخات التفريغ المعقدة إلى مضخات المحاقن المفردة 14،18،19،20،21،22،23،24،25،26،27. في النهج الموضح هنا ، يتم استخدام مضخة حقنة يمكنها استيعاب ما يصل إلى 10 محاقن (الشكل 3 أ). يوفر هذا المرونة لاستخدام خلايا التدفق أحادية القناة أو خلايا التدفق ذات قنوات مدخل متعددة. هنا ، يتم استخدام خلية تدفق ثلاثية القنوات ويتم تزاوجها مع المحاقن المثبتة في مكانها على مضخة المحقنة باستخدام أنابيب poly-ether-ether-ketone (PEEK) (الشكل 3A-C). يتم التحكم في تدفق السوائل بواسطة صمامات تبديل رباعية الاتجاهات وبالتالي تعمل على تقليل إدخال الفقاعات في خلية التدفق (الشكل 3 أ ، د). بالإضافة إلى ذلك ، يوصى باستخدام محاقن هاملتون محكمة الغاز التي لها جدران زجاجية صلبة وغطاسات مطلية بالبولي تترافلوروإيثيلين (PTFE) ، لأنها توفر حركة مكبس سلسة بشكل استثنائي ضرورية للحصول على تدفق سلس14,27.
في النظام التجريبي الموصوف ، تم استخدام خلايا التدفق مع قناتين إلى خمس قنات. يتم تحديد عدد قنوات المدخل من خلال التجربة التي يتم إجراؤها. لدراسة RecBCD و Hop2-Mnd1 ، كانت قناتان دفق كافية14,28. بالنسبة إلى اللولب ، كان الإنزيم مرتبطا بالطرف الحر من الحمض النووي وترجم إلى تيار يحتوي على المغنيسيوم و ATP لبدء النقل والتفكيك. بالنسبة إلى Hop2-Mnd1 ، تمت ترجمة الحمض النووي المحاصر بصريا إلى تيار السائل المجاور الذي يحتوي على البروتينات والمخزن المؤقت ± أيونات المعادن ثنائية التكافؤ. يتيح استخدام خلايا التدفق ثلاثية القنوات للمرء حبس الحمض النووي في التيار 1 ، وترجمة الحمض النووي إلى التيار 2 للسماح بحدوث ارتباط البروتين ، ثم التدفق 3 حيث يوجد ATP ، على سبيل المثال ، لبدء التفاعلات. الاختلاف في ما سبق هو استخدام البروتين الموسوم بالفلورسنت في القناة 2 ، مما يؤدي إلى أن يكون تيار السائل أبيض تماما ويمنع تصور الحمض النووي. عندما يترجم هذا الجزيء إلى تيار 3 ، يكون كل من البروتينات والحمض النووي مرئيا الآن عند بدء التفاعلات.
يعد استخدام صمامات التبديل رباعية الاتجاهات للتحكم في تدفق السوائل مكونا مهما في النظام للقضاء على الفقاعات في خلايا التدفق. الفقاعات ضارة بتدفق السوائل المستقر لأنها تتقلص وتتوسع بطرق غير متوقعة مما يؤدي إلى تغيرات سريعة في سرعة التدفق وإدخال الاضطراب. عندما يتم وضع الصمامات بين المحاقن وأنابيب المدخل ، يتم فصل مسار التدفق عن طريق تبديل موضع الصمام عند تغيير المحاقن. عندما يتم وضع المحقنة الجديدة في مكانها ، يمكن الضغط على المكبس يدويا بحيث يتم إخراج >6 ميكرولتر (الحجم الميت للصمام) وهذا يزيل الفقاعات بالكامل تقريبا.
غالبا ما يكون ربط الموصلات بخلايا التدفق هو خطوة تحديد المعدل في استخدام خلايا التدفق. وصفنا استخدام نوعين من الموصلات: قابلة للإزالة تعرف باسم press-fit وأخرى دائمة (تجميعات nanoport). الموصلات القابلة للإزالة سهلة الالتصاق بخلية التدفق ويمكن اختبار أنواع مختلفة من الأنابيب المرنة بالإضافة إلى PTFE الموصى بها باستخدام هذه الموصلات. هذه طريقة سريعة وفعالة من حيث التكلفة لاختبار الأنابيب والموصلات دون التضحية بخلايا تدفق الزجاج الأكثر تكلفة. في المقابل ، يتم إرفاق مجموعات المنافذ النانوية بشكل دائم ، وتتحمل ضغوطا تصل إلى 1000 رطل / بوصة مربعة ، وفي أيدينا ، يقتصر استخدامها على أنابيب PEEK بأقطار مختلفة. هذا ليس عيبا حيث يفضل استخدام أنابيب PEEK. يمكن إعادة استخدام خلية تدفق زجاجية واحدة مع تجميعات دائمة مرفقة لأكثر من 1 سنة مع الاستخدام الدقيق.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100x objective</td>
			<td>Leica</td>
			<td>506318 or 506038</td>
			<td>Oil immersion lenses; Imaging and optical trapping only; Plan APO objectives optimized for fluorescence imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X Objective</td>
			<td>Leica</td>
			<td>506263</td>
			<td>Used to locate laser beams spots during alignment; to find focus and X-Y position in flow cell</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mm fluorescent beads</td>
			<td>Bangs Labs</td>
			<td>FSDG004</td>
			<td>Used for tap performance, focal position determination</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mm polystyrene beads</td>
			<td>Bangs Labs</td>
			<td>CPO1004</td>
			<td>Used for trap performance evaluation and binding to biotinylated molecules</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>63x objective</td>
			<td>Leica</td>
			<td>506081</td>
			<td>Used to locate laser beams spots during alignment and to find focus and X-y position in flow cell; can be used for optical trapping as it has an identical back aperture diameter to the 100X; oil immersion lens</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alignment laser</td>
			<td>Lumentum</td>
			<td>1100 series</td>
			<td>10mW HeNe laser that is visible to the naked eye that is used to position optics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beam alignment camera</td>
			<td>Amscope</td>
			<td>MU303</td>
			<td>A simple, inexpensive and software controlled camera for imaging of the beam position</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera control and Image capture software</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>HCImage</td>
			<td>Coordinates activities of the Lambda DG4 with the camera to facilitate rapid wavelength switching</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera; Orca flash 4</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>c13440-20cu</td>
			<td>CCD camera for imaging of single-molecule experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C-mount for the beam alignment camera</td>
			<td>Spot imaging solutions</td>
			<td>DE50CMT</td>
			<td>Provides optimal positioning of the camera for imaging of laser beams during alignment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C-mount for the Orca Flash 4 camera</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Has a retainer ring to hold an IR blocking filter in place. This eliminates reflected IR beam from the optical traps and facilitates clearer imaging of trapped objects.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy5&#160; fluorescence filter cube</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>cy5-404a-lsc-zero</td>
			<td>Used in conjunction with Lambda DG4 to image Cy5 only</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fitc-Txred&#160; fluorescence filter cube</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>fitc/txred-2x-b-000</td>
			<td>Used in conjunction with Lambda DG4 to image FITC and TXRed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluidics tubing</td>
			<td>Grace Bio</td>
			<td>46004</td>
			<td>PTFE tubing as an alternate to PEEK; works well on some flow cells. Can be used with PDMS flow cells or glass flow cells when Grace Bio fit tubing connectors are used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP fluorescence filter cube</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>gfp-3035b-lsc-zero</td>
			<td>Used in conjunction with Lambda DG4 to image GFP only</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass flow cells</td>
			<td>Translume</td>
			<td>Custom</td>
			<td>Clear flow channels for imaging (Fig. 2E)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass glue</td>
			<td>Loctite</td>
			<td>233841</td>
			<td>Securely and easily bonds Nanoport assemblies to glass flow cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass/PDMS sandwich flow cells</td>
			<td>CIDRA Precision services</td>
			<td>Custom design</td>
			<td>Flow cells built according to your specifications; imaging channels are clear (Fig. 2C)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton Cleaning solution</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>18311</td>
			<td>Gentle but efficient cleaning solution for glass flow cells; does not bubble when used carefully</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Illumination system</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>Lamda DG4</td>
			<td>Discontinued so recommend Lambda 721</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Illumination system</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>Lamda DG4</td>
			<td>Discontinued so recommend Lambda 721</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image analysis software</td>
			<td>Media cybernetics</td>
			<td>Image Pro Premiere</td>
			<td>Analysis of images and single molecule tracking</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image analysis software</td>
			<td>Fiji/NIH Image/Image J</td>
			<td>Shareware</td>
			<td>Analysis of images and single molecule tracking</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image display card</td>
			<td>Melles Griot</td>
			<td>06 DLA 001</td>
			<td>Alternate product from Thorlabs: VRC5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immersion oil</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>444960</td>
			<td>Immersol 518 F fluorescence free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser beam alignment tools</td>
			<td>Thor labs</td>
			<td>FMP05/M; dgo5-1500-h1; BHM1&#160;</td>
			<td>Used to ensure beams are horizontal and at the correct height</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser beam viewer</td>
			<td>Canadian Photonics labs</td>
			<td>IR 3150</td>
			<td>Used to image IR beam spots on mirrors and&#160; targets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser power meter</td>
			<td>Thor labs</td>
			<td></td>
			<td>Measurement of laser output as well as trap strength</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser safety glasses (HeNe)</td>
			<td>Thor labs</td>
			<td>LG7 or 8</td>
			<td>Blocks &#62;3 OD units of light of wavelengths &#62;600 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser safety glasses (IR)</td>
			<td>Thor labs</td>
			<td>LG11</td>
			<td>Blocks &#62;7 OD units of light of wavelengths &#179;1000 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mcherry&#160; fluorescence filter cube</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>mcherry-a-lsc-zero</td>
			<td>Used in conjunction with Lambda DG4 to image mcherry only</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DMIRE2</td>
			<td>DIC port removed to accommodate Dichroic trapping/alignment mirror</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope control software&#160;</td>
			<td>UCSF/shareware</td>
			<td>uManager</td>
			<td>Controls the microscope, permits focal alignment of objectives as well as stage control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanoport assembly</td>
			<td>IDEX</td>
			<td>N333</td>
			<td>Connectors that are bonded to flow cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical table support</td>
			<td>Thor Labs</td>
			<td>PA52502</td>
			<td>Active isolation table support</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optics and lenses</td>
			<td>Solar TII</td>
			<td>Various</td>
			<td>Interference mirrors, telescopes and lenses custom designed for the system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDMS flow cells</td>
			<td>ufluidix</td>
			<td>Custom</td>
			<td>Flow cells built according to your specifications; imaging channels are clear (Figs. 2B and D)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEEK tubing</td>
			<td>IDEX</td>
			<td>1532</td>
			<td>Provides excellent connection to flow cells and switching valves</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pinkel fluorescence filter cube</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>lf488/543/635-3x-a-000</td>
			<td>Used in conjunction with Lambda DG4 to image multiple fluorophores rapidly</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Press fit tubing connectors</td>
			<td>GraceBio</td>
			<td>46003</td>
			<td>Clear silicone connector with adhesive that binds well to glass</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scanning mirrors</td>
			<td>GSI Lumonics</td>
			<td>VM500</td>
			<td>Used to provide control of the second optical trap. GSI Lumonics no longer exists. Similar mirrors can be purchased from Cambridge Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stage</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stage micrometer</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>68042-08</td>
			<td>Provides on screen ruler for positioning of the beam and system calibration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Switching valves</td>
			<td>IDEX</td>
			<td>V-101T</td>
			<td>Control direction of fluid flow and eliminate introduction of bubbles into flow cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe and valve manifold</td>
			<td>Machine shop</td>
			<td>None</td>
			<td>Custom built</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pump</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>PHD 2000</td>
			<td>Controls fluid flow through flow cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pump software</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>70-6000</td>
			<td>Flow control provides seamless, programmable control of fluid flow</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>81320</td>
			<td>Gas-tight, PTFE Luer Lock, glass barrels with Teflon-coated plungers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Table top</td>
			<td>Thor Labs</td>
			<td>T36H</td>
			<td>Optical table top or breadboard</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trapping laser</td>
			<td>Newport/Spectra Physics</td>
			<td>J-series; BL106C</td>
			<td>Nd:YAG laser; 1064 nm; 5W laser</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

use of dual optical tweezers and microfluidics for single-molecule studies

الكيمياء الحيوية البصرية هي تقنية قوية لمراقبة الخصائص العشوائية للإنزيمات المفردة أو مجمعات الإنزيم التي يتم حجبها في المتوسط الذي يحدث في دراسات المرحلة السائبة. لتحقيق التصور ، يتم تركيز الملقط البصري المزدوج ، حيث يتم تثبيت أحد المصيدة والآخر متحرك ، في قناة واحدة لغرفة الموائع الدقيقة متعددة التيارات الموضوعة على مرحلة مجهر مضان مقلوب. تحبس الملقط البصري جزيئات مفردة من الحمض النووي المسمى بالفلورسنت وتدفق السوائل عبر الغرفة وتتجاوز الخرز المحبوس ، وتمتد الحمض النووي إلى شكل B (تحت الحد الأدنى من القوة ، أي 0 pN) مع ملاحظة الحمض النووي كخيط أبيض على خلفية سوداء. يتم نقل جزيئات الحمض النووي من تيار إلى آخر ، عن طريق ترجمة المرحلة المتعامدة مع التدفق لتمكين بدء التفاعلات بطريقة خاضعة للرقابة. لتحقيق النجاح ، يتم تزاوج أجهزة الموائع الدقيقة ذات القنوات الواضحة بصريا مع المحاقن الزجاجية المثبتة في مكانها في مضخة حقنة. تستخدم النتائج المثلى الموصلات المرتبطة بشكل دائم بخلية التدفق ، وهي أنابيب صلبة ميكانيكيا ومقاومة كيميائيا ، ومتصلة بصمامات التبديل التي تقضي على الفقاعات التي تمنع التدفق الصفحي.

يتم إجراء الاختبار الأولي لمحاذاة المصيدة وقوتها باستخدام حبات البوليسترين غير الفلورية 1 ميكرومتر. نظرا لأن معظم الأبحاث التي أجريت في المختبر تستخدم مضان ، فإننا نختبر قوة المصيدة باستخدام 1 ميكرومتر ، حبات البوليسترين الخضراء التنين (الشكل 1D ، E). بعد ذلك يتغير ...

Watch this Scientific Journal Video about Use of Dual Optical Tweezers and Microfluidics for Single-Molecule Studies at JoVE.com

Use of Dual Optical Tweezers and Microfluidics for Single-Molecule Studies

يتم تسهيل الكيمياء الحيوية البصرية أحادية الجزيء التي تمت دراستها من خلال غرف الموائع الدقيقة بشكل كبير باستخدام برميل زجاجي ، ومحاقن مانعة لتسرب الغاز ، ووصلات مستقرة للأنابيب بخلايا التدفق ، والقضاء على الفقاعات عن طريق وضع صمامات التبديل بين المحاقن والأنابيب. يصف البروتوكول الفخاخ البصرية المزدوجة التي تمكن من تصور معاملات الحمض النووي والتفاعلات بين الجزيئات.

استخدام الملقط البصري المزدوج والموائع الدقيقة للدراسات أحادية الجزيء

Visual biochemistry is a powerful technique for observing the stochastic properties of single enzymes or enzyme complexes that are obscured in the ...

يعد ربط المنافذ بالتزاوج مع المحاقن مع الأنابيب أمرا بالغ الأهمية لأنه عندما يتم ذلك بشكل صحيح ، لا توجد تسريبات ، ولا توجد فقاعات في خلية التدفق ، ويمكن إجراء التجارب بشكل متكرر باستخدام نفس خلية التدفق على مدى عام واحد مع الاستخدام الدقيق. هنا ، سيتم تقديم طريقتين بسيطتين لإرفاق الموصلات بخلايا التدفق. هذه سهلة ، وقابلة للتكرار ، وتسمح للمحقق بتكييف خلية التدفق بسهولة مع احتياجاتهم دون الكثير من المتاعب.تم استخدام خلايا التدفق هذه مع وضع تجارب جزيء واحد في الاعتبار. على وجه الخصوص ، ما نسميه الكيمياء الحيوية البصرية ، ولكن يمكن استخدامها في أي دراسة تتطلب الموائع الدقيقة وفي الحالات التي يتم فيها استخدام تدفق سائل الصفيحة. لذلك ، لتجنب الأخطاء ، بدلا من استخدام خلايا التدفق القيمة لإنشاء التقنيات ، أقترح التدرب على شريحة زجاجية أو زلة غطاء أولا.سيمكن ذلك المرء من التعرف على الزجاج أو مواد PDMS لمعرفة كيفية التعامل معها ومقدار القوة التي يجب تطبيقها عند إدخال الأنابيب أو ربط الموصلات. سيتطلب ذلك التضحية ببعض الموصلات ولكنها أرخص بكثير من خلايا التدفق. ابدأ بوضع خلية التدفق على سطح مستو نظيف.امسك أنبوب PTFE بثلاثة ملليمترات من الطرف الحر بالملقط وادفع الأنبوب إلى المنفذ. كرر هذا الإجراء لكل منفذ من المنافذ المتبقية. قم بتوصيل منافذ المدخل بمضخة المحقنة والمخرج بزجاجة نفايات.املأ كل حقنة زجاجية بملليلتر واحد من الميثانول الضوئي الطيفي ، وأرفقها بصمام التبديل. تأكد من أن الصمام يحتوي على مخرج موجه للنفايات وتطهير كل خط ب 50 ميكرولتر من الميثانول. قم بتبديل موضع المخرج إلى خلية التدفق وضخ 800 ميكرولتر من الميثانول عبر خلية التدفق بمعدل تدفق 100 ميكرولتر في الساعة لتبليل الأسطح والقضاء على الفقاعات.في اليوم التالي ، كرر هذه العملية باستخدام 800 ميكرولتر من الماء عالي النقاء. خلية التدفق جاهزة الآن للاستخدام. إذا كان سيتم استخدام موصلات أنابيب مناسبة للضغط ، فقم بإزالة الشريط اللاصق بعناية من جانب واحد من الموصل وضعه فوق الفتحة الموجودة في شريحة المجهر.اضغط لأسفل لبضع ثوان. كرر العملية للموصلات المتبقية. ثم ضع خلية التدفق على سطح مستو نظيف.امسك أنبوب PTFE على بعد ثلاثة ملليمترات من الطرف الحر وادفع الأنبوب إلى الفتحة الموجودة في المنفذ. كرر هذا الإجراء لكل منفذ من المنافذ المتبقية. قم بتوصيل الأنابيب من المداخل بصمامات التبديل.ضع الملحق إما على سطح نظيف ومسطح أو على مشعب مصمم خصيصا لتثبيت خلية التدفق والموصلات في مكانها أثناء حدوث الترابط. ضع خلية التدفق على الجزء الغائر من المشعب ثم ضع كمية صغيرة من الغراء الزجاجي في الجزء السفلي من المجموعة وأدخل الختم. ضع منفذ النانو فوق أحد فتحات الدخول على شريحة المجهر.ادفع برفق لأسفل وثبت في مكانه بدون حركة جانبية. كرر العملية للمنافذ المتبقية. السماح ليجف أو المشبك في مكانه في المشعب.قم بإزالة خلية التدفق برفق من المشعب وتأكد من محاذاة التجميعات جيدا مع منافذ الدخول في خلية التدفق. ضع خلية تدفق على مرحلة المجهر وقم بتوصيل الأنبوب باستخدام موصلات الإصبع الضيقة. املأ كل حقنة زجاجية بملليلتر واحد من الميثانول الطيفي الضوئي.قم بتوصيل كل حقنة بصمام التبديل. تأكد من أن الصمام يحتوي على مخرج موجه للنفايات وتطهير كل خط ب 50 ميكرولتر من الميثانول. قم بتبديل موضع المخرج إلى خلية التدفق وضخ 800 ميكرولتر من الميثانول عبر خلية التدفق بمعدل تدفق 100 ميكرولتر في الساعة.في اليوم التالي ، كرر هذه العملية باستخدام 800 ميكرولتر من الماء عالي النقاء. يظهر قياس خرج الطاقة هنا. يتم قياس خرج الطاقة من الليزر قبل تثبيت رأس الليزر في التخطيط البصري.بمجرد الانتهاء من محاذاة المصيدة، يتم قياس قدرة الحزمة بعد هدف 100 x لكل مصيدة. توضح الصور الاصطياد البصري المستقر لخرزات فلورية ميكرومتر واحد. هنا F هو فخ ثابت ، و M هو فخ متنقل.مع مصيدة المحمول في وضع المسح تتحرك من خلال دائرة صغيرة أو كبيرة في 30 هرتز. تدفق السوائل داخل خلية التدفق رقائقي. يوضح الرسم التخطيطي خلية التدفق من الأعلى لإثبات أن الانتشار بين القنوات هو المصدر الرئيسي للخلط بين تيارات السوائل المجاورة.تشير الأسهم الزرقاء إلى اتجاه التدفق والتدفقات الفردية ملونة وبيضاء ورمادية فاتحة وبيضاء. يشار إلى المناطق المتسعة للانتشار العرضي بين القنوات باللون الأحمر. يظهر الجزء الداخلي صورة مضان لتيارات السوائل المجاورة عند تكبير 10 مرات مع مجمعات خرزة الحمض النووي الفلورية في التيار السفلي والمخازن المؤقتة فقط في التيار العلوي.البقع البيضاء في التيار العلوي هي ضوضاء لقطة من كاميرا CCD. ملف تعريف التدفق وخلايا التدفق الصفحي مكافئ. يتم عرض خلية التدفق من الجانب ويشار إلى اتجاه التدفق فوق كل خلية.تتأثر سرعة الخرزة الخطية بسرعة المضخة وتركيز السكروز. تتأثر القوة المعارضة على الخرزة بلزوجة المحلول. يؤثر قطر الخرزة على القوة على الخرز تحت التدفق.عند محاولة هذا الإجراء ، تأكد من أن المنطقة التي تعمل فيها نظيفة وأنك قمت بتنظيف الأسطح الزجاجية باستخدام الميثانول أو الأسيتون من الدرجة الطيفية. في هذه المرحلة ، يجب أن يكون لديك خلية تدفق يتم تصنيعها إلى مضخة المحقنة الخاصة بك وأنت الآن جاهز لتقديم الحلول الخاصة بك وبدء تجارب الملقط البصري. مكن استخدام خلايا التدفق ، التي يمكن استخدامها لفترات طويلة من الزمن ، الباحثين من التحقيق في مجموعة متنوعة من تفاعلات الجزيء الواحد حيث يتم قياس أي من القوى ، ويتم تصور التفاعلات عن طريق التألق أو مزيج من الاثنين معا.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

An Efficient Method for the Isolation of Highly Purified RNA from Seeds for Use in Quantitative Transcriptome Analysis

وسيلة فعالة لعزل الحمض النووي الريبي العالية النقاء من بذور للاستخدام في التحليل الكمي Transcriptome على

Plant seeds accumulate large amounts of storage reserves comprising biodegradable organic matter. Humans rely on seed storage reserves for food and as ...

High Precision FRET at Single-molecule Level for Biomolecule Structure Determination

عالية الدقة حنق في مستوى جزيء واحد لجزيء الجزيئي تحديد هيكل

A protocol on how to perform high-precision interdye distance measurements using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) at the single-molecule ...

Single-molecule Manipulation of G-quadruplexes by Magnetic Tweezers

التلاعب جزيء واحد من كوادروبليكسيس ز بملاقط مغناطيسية

Non-canonical nucleic acid secondary structure G-quadruplexes (G4) are involved in diverse cellular processes, such as DNA replication, transcription, RNA ...

Covalent Immobilization of Proteins for the Single Molecule Force Spectroscopy

تجميد التساهمية من البروتينات للتحليل الطيفي قوة جزيء واحد

In recent years, atomic force microscopy (AFM) based single molecule force spectroscopy (SMFS) extended our understanding of molecular properties and ...

Proteome-wide Quantification of Labeling Homogeneity at the Single Molecule Level

تحديد كمية البروتين على نطاق المنظومة وسم التجانس على مستوى جزيء واحد

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a ...

Production of Dynein and Kinesin Motor Ensembles on DNA Origami Nanostructures for Single Molecule Observation

إنتاج Dynein و Kinesin موتور الفرق علي الحمض النووي اوريغامي النانو لرصد جزيء واحد

Cytoskeletal motors are responsible for a wide variety of functions in eukaryotic cells, including mitosis, cargo transport, cellular motility, and ...

OaAEP1-Mediated Enzymatic Synthesis and Immobilization of Polymerized Protein for Single-Molecule Force Spectroscopy

OaAEP1 بوساطة التوليف الأنزيمي وتجميد البروتين المبلمر للمطاطي للقوة أحادية الجزيء

Chemical and bio-conjugation techniques have been developed rapidly in recent years and allow the building of protein polymers. However, a controlled ...

Conventional BODIPY Conjugates for Live-Cell Super-Resolution Microscopy and Single-Molecule Tracking

التقليدية BODIPY Conjugates ليعيش الخلية فائقة القرار المجهر وتتبع جزيء واحد

Single molecule localization microscopy (SMLM) techniques overcome the optical diffraction limit of conventional fluorescence microscopy and can resolve ...

Single Cell Analysis Of Transcriptionally Active Alleles By Single Molecule FISH

تحليل خلية واحدة من الأليل النشطة نسخيا بواسطة جزيء واحد FISH

Gene transcription is an essential process in cell biology, and allows cells to interpret and respond to internal and external cues. Traditional bulk ...

Making Precise and Accurate Single-Molecule FRET Measurements using the Open-Source smfBox

إجراء قياسات دقيقة ودقيقة أحادية الجزيء FRET باستخدام smfBox مفتوح المصدر

The smfBox is a recently developed cost-effective, open-source instrument for single-molecule F&#246;rster Resonance Energy Transfer (smFRET), which makes ...