Name: use of dual optical tweezers and microfluidics for single-molecule studies
Uploaded: 2022-11-18T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Use of Dual Optical Tweezers and Microfluidics for Single-Molecule Studies at JoVE.com

Forskning i Bianco laboratoriet er støttet af NIH tilskud GM100156 og GM144414 til P.R.B.

1. Justering og test af laserfælde med polystyrenperler
BEMÆRK: For opsætningen henvises til figur 1A, B.
FORSIGTIG: Eksperimentalisten skal bære passende beskyttelsesbriller eller lasersikkerhedsbriller under laserstrålejustering. Da det optiske pincetsystem, der er beskrevet heri, bruger både HeNe- og IR-stråler, kræves der to separate sæt lasersikkerhedsglasvarer.
<ol><li>HeNe Beam-justeri...

<ol>
	<li>Bianco, P. R., Lu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+insight+into+stalled+replication+fork+rescue+in+Escherichia+coli.">Single-molecule insight into stalled replication fork rescue in Escherichia coli.</a> Nucleic Acids Research. 49 (8), 4220-4238 (2021).</li><li>Kaur, G., Lewis, J. S., van Oijen, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shining+a+spotlight+on+DNA:+Single-molecule+methods+to+visualise+DNA.">Shining a spotlight on DNA: Single-molecule methods to visualise DNA.</a> Molecules. 24 (3), 491 (2019).</li><li>Dame, R. T., Noom, M. C., Wuite, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+chromatin+organization+by+H-NS+protein+unravelled+using+dual+DNA+manipulation.">Bacterial chromatin organization by H-NS protein unravelled using dual DNA manipulation.</a> Nature. 444 (7117), 387-390 (2006).</li><li>Bianco, P. R., Bradfield, J. J., Castanza, L. R., Donnelly, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rad54+oligomers+translocate+and+cross-bridge+double-stranded+DNA+to+stimulate+synapsis.">Rad54 oligomers translocate and cross-bridge double-stranded DNA to stimulate synapsis.</a> Journal of Molecular Biology. 374 (3), 618-640 (2007).</li><li>Amitani, I., Liu, B., Dombrowski, C. C., Baskin, R. J., Kowalczykowski, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Watching+individual+proteins+acting+on+single+molecules+of+DNA.">Watching individual proteins acting on single molecules of DNA.</a> Methods in Enzymology. 472, 261-291 (2010).</li><li>Brewer, L. R., Bianco, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laminar+flow+cells+for+single-molecule+studies+of+DNA-protein+interactions.">Laminar flow cells for single-molecule studies of DNA-protein interactions.</a> Nature Methods. 5 (6), 517-525 (2008).</li><li>Visscher, K., Brakenhoff, G. J., Krol, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micromanipulation+by+multiple+optical+traps+created+by+a+single+fast+scanning+trap+integrated+with+the+bilateral+Confocal+scanning+laser+microscope.">Micromanipulation by multiple optical traps created by a single fast scanning trap integrated with the bilateral Confocal scanning laser microscope.</a> Cytometry. 14, 105-114 (1993).</li><li>Vermeulen, K. C., Mameren, J. v. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calibrating+bead+displacements+in+optical+tweezers+using+acousto-optic+deflectors.">Calibrating bead displacements in optical tweezers using acousto-optic deflectors.</a> Review of Scientific Instruments. 77 (1), 013704 (2006).</li><li>Dufresne, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computer-generated+holographic+optical+tweezers+arrays.">Computer-generated holographic optical tweezers arrays.</a> Review of Scientific Instruments. 72 (3), 1810 (2001).</li><li>Squires, T. M., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidics:+fluid+physics+at+the+nanoliter+scale.">Microfluidics: fluid physics at the nanoliter scale.</a> Reviews of Modern Physics. 77, 977-1026 (2005).</li><li>Weibel, D. B., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+microfluidics+in+chemical+biology.">Applications of microfluidics in chemical biology.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 10 (6), 584-591 (2006).</li><li>Tan, X., Mizuuchi, M., Mizuuchi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+transposition+target+immunity+and+the+determinants+of+the+MuB+distribution+patterns+on+DNA.">DNA transposition target immunity and the determinants of the MuB distribution patterns on DNA.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (35), 13925-13929 (2007).</li><li>Lima, R., Wada, S., Takeda, M., Tsubota, K., Yamaguchi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+confocal+micro-PIV+measurements+of+blood+flow+in+a+square+microchannel:+the+effect+of+the+haematocrit+on+instantaneous+velocity+profiles.">In vitro confocal micro-PIV measurements of blood flow in a square microchannel: the effect of the haematocrit on instantaneous velocity profiles.</a> Journal of Biomechanics. 40 (12), 2752-2757 (2007).</li><li>Bianco, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Processive+translocation+and+DNA+unwinding+by+individual+RecBCD+enzyme+molecules.">Processive translocation and DNA unwinding by individual RecBCD enzyme molecules.</a> Nature. 409 (6818), 374-378 (2001).</li><li>Forget, A. L., Dombrowski, C. C., Amitani, I., Kowalczykowski, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+protein-DNA+interactions+in+3D+using+in+situ+construction,+manipulation+and+visualization+of+individual+DNA+dumbbells+with+optical+traps,+microfluidics+and+fluorescence+microscopy.">Exploring protein-DNA interactions in 3D using in situ construction, manipulation and visualization of individual DNA dumbbells with optical traps, microfluidics and fluorescence microscopy.</a> Nature Protocol. 8 (3), 525-538 (2013).</li><li>Streets, A. M., Huang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidics+for+biological+measurements+with+single-molecule+resolution.">Microfluidics for biological measurements with single-molecule resolution.</a> Current Opinion in Biotechnology. 25, 69-77 (2014).</li><li>Madariaga-Marcos, J., Corti, R., Hormeno, S., Moreno-Herrero, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+microfluidic+approaches+for+a+fast+and+efficient+reagent+exchange+in+single-molecule+studies.">Characterizing microfluidic approaches for a fast and efficient reagent exchange in single-molecule studies.</a> Scientific Reports. 10 (1), 18069 (2020).</li><li>Grayson, P., Han, L., Winther, T., Phillips, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+observations+of+single+bacteriophage+lambda+DNA+ejections+in+vitro.">Real-time observations of single bacteriophage lambda DNA ejections in vitro.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (37), 14652-14657 (2007).</li><li>Luo, G., Wang, M., Konigsberg, W. H., Xie, X. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+and+ensemble+fluorescence+assays+for+a+functionally+important+conformational+change+in+T7+DNA+polymerase.">Single-molecule and ensemble fluorescence assays for a functionally important conformational change in T7 DNA polymerase.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (31), 12610-12615 (2007).</li><li>Sia, S. K., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+devices+fabricated+in+poly(dimethylsiloxane)+for+biological+studies.">Microfluidic devices fabricated in poly(dimethylsiloxane) for biological studies.</a> Electrophoresis. 24 (21), 3563-3576 (2003).</li><li>Wuite, G. J. L., Davenport, R. J., Rappaport, A., Bustamante, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+integrated+laser+trap/flow+control+video+microscope+for+the+study+of+single+biomolecules.">An integrated laser trap/flow control video microscope for the study of single biomolecules.</a> Biophysical Journal. 79 (2), 1155-1167 (2000).</li><li>Kim, S., Blainey, P. C., Schroeder, C. M., Xie, X. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+single-molecule+assay+for+enzymatic+activity+on+flow-stretched+DNA.">Multiplexed single-molecule assay for enzymatic activity on flow-stretched DNA.</a> Nature Methods. 4 (5), 397-399 (2007).</li><li>Tanaka, H., Ishijima, A., Honda, M., Saito, K., Yanagida, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orientation+dependence+of+displacements+by+a+single+one-headed+myosin+relative+to+the+actin+filament.">Orientation dependence of displacements by a single one-headed myosin relative to the actin filament.</a> Biophysical Journal. 75 (4), 1886-1894 (1998).</li><li>Merenda, F., Andrews, D. L., Galves, E. J., Nienhuis, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Refractive+multiple+optical+tweezers+for+parallel+biochemical+analysis+in+micro-fluidics.">Refractive multiple optical tweezers for parallel biochemical analysis in micro-fluidics.</a> Proceeding of SPIE. , 6483 (2007).</li><li>Brewer, L. R., Corzett, M., Balhorn, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protamine-induced+condensation+and+decondensation+of+the+same+DNA+molecule.">Protamine-induced condensation and decondensation of the same DNA molecule.</a> Science. 286 (5437), 120-123 (1999).</li><li>Ladoux, B., Quivy, J. P., Doyle, P. S., Almouzni, G., Viovy, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+imaging+of+single-molecules:+from+dynamics+of+a+single+DNA+chain+to+the+study+of+complex+DNA-protein+interactions.">Direct imaging of single-molecules: from dynamics of a single DNA chain to the study of complex DNA-protein interactions.</a> Science Progress. 84, 267-290 (2001).</li><li>Bianco, P. R., Bradfield, J. J., Castanza, L. R., Donnelly, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rad54+oligomers+translocate+and+cross-bridge+double-stranded+DNA+to+stimulate+synapsis.">Rad54 oligomers translocate and cross-bridge double-stranded DNA to stimulate synapsis.</a> Journal of Molecular Biology. 374 (3), 618-640 (2007).</li><li>Pezza, R. J., Camerini-Otero, R. D., Bianco, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hop2-Mnd1+condenses+DNA+to+stimulate+the+synapsis+phase+of+DNA+strand+exchange.">Hop2-Mnd1 condenses DNA to stimulate the synapsis phase of DNA strand exchange.</a> Biophysical Journal. 99 (11), 3763-3772 (2010).</li><li>Rye, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+fluorescent+complexes+of+double-stranded+DNA+with+bis-intercalating+asymmetric+cyanine+dyes:+properties+and+applications.">Stable fluorescent complexes of double-stranded DNA with bis-intercalating asymmetric cyanine dyes: properties and applications.</a> Nucleic Acids Research. 20 (11), 2803-2812 (1992).</li></ol>

Den omhyggelige samling af flowsystemet er afgørende for det vellykkede resultat af eksperimenter 4,6. Et af de mest udfordrende aspekter af protokollen er fastgørelsen af stik til glasoverfladen. Til dette bruger vi følgende to tilgange: press-fit fit slangestik og nanoport-samlinger. Press-fit-stik klæber let til glas efterfulgt af at skubbe PTFE-slanger ind i de præformede huller ved hjælp af tang. Når der kræves en mere stabil vedhæftning, foretrækk...

Evnen til at visualisere protein-DNA-interaktioner på enkeltmolekyleniveau og i realtid har givet betydelig indsigt i genomstabilitet 1,2. Ud over at arbejde med enkelte DNA-molekyler et ad gangen, giver evnen til at se transaktioner mellem individuelle molekyler i nærheden yderligere indsigt 3,4,5. Manipulation af yderligere DNA-molekyler kræver både yderligere optiske fælder samt højkvalitets, multikanals, mikrofluidiske flowceller6.
Der er flere metoder til rådighed til at generere mere end en optisk fælde. Disse omfatter galvanometerscanningsspejle, akustiske optiske modulatorer og diffraktiv optik, der genererer holografisk optisk pincet 4,7,8,9. Ofte producerer scanningsspejle og akustiske optiske modulatorer fælder, der timeshare. I opsætningen beskrevet her opdeles strålen fra en enkelt Nd: YAG-laser ved polarisering, og derefter styrer galvanometerlaserscanningsspejle positionen af det, der kaldes mobilfælden (figur 1)4. For at lette placeringen af spejle og filtre til at dirigere fangststrålen til mikroskopmålets bagåbning anvendes en HeNe-laser. Dette gør den overordnede justering lettere, da HeNe-strålen er synlig for det blotte øje, mens infrarøde bjælker ikke er det. HeNe-strålen er også sikrere at arbejde med, hvilket gør placeringen af spejle og andre komponenter mindre stressende. I første omgang er strålevejen for denne laser adskilt fra 1064 nm-strålen, men introduceres i samme strålebane og derefter i mikroskopmålet. Når fysisk justering er opnået, udføres placeringen af 1064 nm-strålen oven på HeNe-strålen, og dette lettes ved hjælp af en infrarød seer og forskellige strålebilleddannelsesværktøjer til at visualisere stråleposition og kvalitet. Derefter introduceres stråleekspanderen, og den resulterende ekspanderede infrarøde stråle justeres på målets bagåbning. Endelig fjernes målet, og effekten i hver polariseret stråle måles og justeres ved hjælp af λ/2 bølgeplader til at være ens (figur 1C). Effektmålinger udføres også, når målet er returneret, og typisk er der et strømtab på 53%. Der er dog tilstrækkelig kraft til at danne stabile faste og bevægelige optiske fælder i brændplanet (figur 1D).
For at afbilde DNA-transaktioner spiller mikrofluidiske flowceller en nøglerolle, da de tillader kontrollerede målinger på enkeltmolekyleniveau med høj rumlig og tidsmæssig opløsning (figur 2). Udtrykket mikrofluidisk refererer til evnen til at manipulere væsker i en eller flere kanaler med dimensioner fra 5-500 μm10,11. Udtrykket strøm refererer til den faktiske væske inden for en kanal, og kanalen refererer til den fysiske kanal, hvor en væskestrøm eller strømme bevæger sig. Enkeltkanals flowcelledesign har en fælles, fysisk kanal, hvor reaktioner observeres, og der er typisk kun en væskestrøm til stede. Således er disse designs kendt som single-stream flowceller. I modsætning hertil defineres multi-stream flowceller som en mikrofluidisk enhed, hvor to eller flere indgangskanaler konvergerer til en enkelt, fælles, fysisk kanal (figur 2A). Inden for den fælles kanal strømmer væskestrømmene, der stammer fra de enkelte kanaler, parallelt med hinanden og forbliver adskilt med kun minimal blanding mellem dem, der forekommer på grund af diffusion (figur 2B). I de fleste eksperimentelle opsætninger skubber en enkelt pumpe væsker ind i hver kanal med samme hastighed. I modsætning hertil, når der anvendes grænsestyring, skubber tre eller flere uafhængigt styrede pumper væsker gennem kanalerne. Hver pumpe arbejder dog med en anden hastighed, men nettostrømningshastigheden i den fælles kanal er konstant12. Dette muliggør hurtig udskiftning af hovedkanalkomponenter ved blot at ændre pumpehastigheden.
Ud over laminær strømning er en anden kritisk faktor den parabolske hastighedsprofil i den laminære væskestrøm. Den højeste strømningshastighed forekommer midt i strømmen, og den langsomste forekommer ved siden af overfladerne (figur 2C)13. Denne profil skal betragtes som fuldt ud at strække et DNA-molekyle, der er fastgjort til en perle, der holdes i strømmen for præcis visualisering af fluorescerende DNA og nøjagtige enkeltmolekyleanalyser. Her strækkes DNA'et til B-form og holdes på plads under 0 pN kraft. For at opnå dette skal fokuseringen af den optiske fældeposition være til en position 10-20 μm fra bunddækseloverfladen (figur 2D). Der skal udvises forsigtighed, så DNA-molekylet ikke strækkes ud over B-form, da dette kan hæmme enzymreaktioner. Under typiske bufferforhold er 1 μm = 3.000 bp DNA14. Ved at fange 10-20 μm fra dækslippet placeres DNA-komplekset desuden langt fra overfladen, hvilket minimerer overfladeinteraktioner.
Mange metoder er blevet brugt til at skabe mikrofluidiske enhedskanaler, og disse kan gøres i laboratoriet, eller flowceller kan købes fra kommercielle kilder 6,15,16,17. De optimale materialer, der anvendes til at konstruere flowcellerne, skal være mekanisk stive, optisk gennemsigtige med lav fluorescens og uigennemtrængelige for organiske opløsningsmidler6. Ofte bruges borosilikatflydeglas eller smeltet silica til at give et stabilt flowmiljø i længere tid, der er egnet til optisk fangst, visualisering og kraftdetektion. Disse materialer tillader også anvendelse af ikke-vandige opløsningsmidler (f.eks. Methanol af spektrofotometrisk kvalitet) for at forenkle overfladebefugtning og fjernelse af luftbobler og denatureringsmidler (f.eks. 6M guanidiniumhydrochlorid) eller vaskemidler til at rense flowcellen. Endelig varierer metoderne til at indføre væsker i flowceller fra komplekse vakuumpumpesystemer til enkeltsprøjtepumper 14,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27. I den her beskrevne fremgangsmåde anvendes en sprøjtepumpe, der kan rumme op til 10 sprøjter (figur 3A). Dette giver fleksibilitet til at bruge enkeltkanals flowceller eller flowceller med flere indløbskanaler. Her anvendes en trekanals flowcelle og parres med sprøjter, der holdes på plads på sprøjtepumpen ved hjælp af poly-ether-ether-keton (PEEK) slange (figur 3A-C). Strømmen af væsker styres af firevejskoblingsventiler og tjener således til at minimere indførelsen af bobler i flowcellen (figur 3A, D). Derudover anbefales Hamilton gastætte sprøjter, der har stive glasvægge og polytetrafluorethylen (PTFE)-belagte stempler, da de giver usædvanlig glat stempelbevægelse, der er afgørende for at opnå et jævnt flow14,27.
I det beskrevne eksperimentelle system er flowceller med to til fem indløbskanaler blevet anvendt. Antallet af indløbskanaler dikteres af det eksperiment, der udføres. Til undersøgelsen af RecBCD og Hop2-Mnd1 var to strømkanaler tilstrækkelige14,28. For helicasen blev enzymet bundet til den frie ende af DNA'et og oversat til en strøm indeholdende magnesium og ATP for at initiere translokation og afvikling. For Hop2-Mnd1 blev optisk fanget DNA oversat til den tilstødende væskestrøm indeholdende proteiner og buffer ± divalente metalioner. Brugen af trekanals flowceller gør det muligt for en at fange DNA i strøm 1, oversætte DNA'et til stream 2 for at tillade proteinbinding at forekomme og derefter at streame 3, hvor ATP er til stede, for eksempel for at initiere reaktioner. En variation af ovenstående er at bruge fluorescerende mærket protein i kanal 2, hvilket resulterer i, at væskestrømmen er helt hvid og udelukker visualisering af DNA'et. Når dette molekyle oversættes til strøm 3, er både proteiner og DNA nu synlige, når reaktioner initieres.
Brugen af firevejskoblingsventiler til styring af væskestrømmen er en kritisk komponent i systemet for at eliminere bobler i flowcellerne. Bobler er skadelige for stabil væskestrøm, da de trækker sig sammen og udvider sig på uforudsigelige måder, hvilket resulterer i hurtige ændringer i strømningshastighed og introduktion af turbulens. Når ventilerne er placeret mellem sprøjter og indløbsrør, afbrydes strømningsvejen ved at skifte ventilposition, når sprøjterne skiftes ud. Når den nye sprøjte sættes på plads, kan stemplet trykkes manuelt, så >6 μL skubbes ud (ventilens døde volumen), og dette eliminerer bobler næsten helt.
Fastgørelsen af forbindelser til flowceller er ofte det hastighedsbegrænsende trin i flowcellebrug. Vi beskriver brugen af to typer stik: aftagelige kendt som press-fit og permanente (nanoport-samlinger). De aftagelige stik er enkle at klæbe til en flowcelle, og forskellige typer fleksible slanger ud over den anbefalede PTFE kan testes med disse stik. Dette er en hurtig og omkostningseffektiv måde at teste slanger og stik på uden at ofre dyrere glasflowceller. I modsætning hertil er nanoport-samlinger fastgjort permanent, modstår tryk op til 1.000 psi, og i vores hænder er deres anvendelse begrænset til PEEK-rør med forskellige diametre. Dette er ikke en ulempe, da PEEK-slanger fortrinsvis anvendes. En enkelt glasstrømningscelle med permanente samlinger fastgjort kan genbruges i mere end 1 år med omhyggelig brug.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100x objective</td>
			<td>Leica</td>
			<td>506318 or 506038</td>
			<td>Oil immersion lenses; Imaging and optical trapping only; Plan APO objectives optimized for fluorescence imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X Objective</td>
			<td>Leica</td>
			<td>506263</td>
			<td>Used to locate laser beams spots during alignment; to find focus and X-Y position in flow cell</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mm fluorescent beads</td>
			<td>Bangs Labs</td>
			<td>FSDG004</td>
			<td>Used for tap performance, focal position determination</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mm polystyrene beads</td>
			<td>Bangs Labs</td>
			<td>CPO1004</td>
			<td>Used for trap performance evaluation and binding to biotinylated molecules</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>63x objective</td>
			<td>Leica</td>
			<td>506081</td>
			<td>Used to locate laser beams spots during alignment and to find focus and X-y position in flow cell; can be used for optical trapping as it has an identical back aperture diameter to the 100X; oil immersion lens</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alignment laser</td>
			<td>Lumentum</td>
			<td>1100 series</td>
			<td>10mW HeNe laser that is visible to the naked eye that is used to position optics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beam alignment camera</td>
			<td>Amscope</td>
			<td>MU303</td>
			<td>A simple, inexpensive and software controlled camera for imaging of the beam position</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera control and Image capture software</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>HCImage</td>
			<td>Coordinates activities of the Lambda DG4 with the camera to facilitate rapid wavelength switching</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera; Orca flash 4</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>c13440-20cu</td>
			<td>CCD camera for imaging of single-molecule experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C-mount for the beam alignment camera</td>
			<td>Spot imaging solutions</td>
			<td>DE50CMT</td>
			<td>Provides optimal positioning of the camera for imaging of laser beams during alignment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C-mount for the Orca Flash 4 camera</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Has a retainer ring to hold an IR blocking filter in place. This eliminates reflected IR beam from the optical traps and facilitates clearer imaging of trapped objects.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy5&#160; fluorescence filter cube</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>cy5-404a-lsc-zero</td>
			<td>Used in conjunction with Lambda DG4 to image Cy5 only</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fitc-Txred&#160; fluorescence filter cube</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>fitc/txred-2x-b-000</td>
			<td>Used in conjunction with Lambda DG4 to image FITC and TXRed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluidics tubing</td>
			<td>Grace Bio</td>
			<td>46004</td>
			<td>PTFE tubing as an alternate to PEEK; works well on some flow cells. Can be used with PDMS flow cells or glass flow cells when Grace Bio fit tubing connectors are used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP fluorescence filter cube</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>gfp-3035b-lsc-zero</td>
			<td>Used in conjunction with Lambda DG4 to image GFP only</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass flow cells</td>
			<td>Translume</td>
			<td>Custom</td>
			<td>Clear flow channels for imaging (Fig. 2E)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass glue</td>
			<td>Loctite</td>
			<td>233841</td>
			<td>Securely and easily bonds Nanoport assemblies to glass flow cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass/PDMS sandwich flow cells</td>
			<td>CIDRA Precision services</td>
			<td>Custom design</td>
			<td>Flow cells built according to your specifications; imaging channels are clear (Fig. 2C)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton Cleaning solution</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>18311</td>
			<td>Gentle but efficient cleaning solution for glass flow cells; does not bubble when used carefully</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Illumination system</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>Lamda DG4</td>
			<td>Discontinued so recommend Lambda 721</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Illumination system</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>Lamda DG4</td>
			<td>Discontinued so recommend Lambda 721</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image analysis software</td>
			<td>Media cybernetics</td>
			<td>Image Pro Premiere</td>
			<td>Analysis of images and single molecule tracking</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image analysis software</td>
			<td>Fiji/NIH Image/Image J</td>
			<td>Shareware</td>
			<td>Analysis of images and single molecule tracking</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image display card</td>
			<td>Melles Griot</td>
			<td>06 DLA 001</td>
			<td>Alternate product from Thorlabs: VRC5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immersion oil</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>444960</td>
			<td>Immersol 518 F fluorescence free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser beam alignment tools</td>
			<td>Thor labs</td>
			<td>FMP05/M; dgo5-1500-h1; BHM1&#160;</td>
			<td>Used to ensure beams are horizontal and at the correct height</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser beam viewer</td>
			<td>Canadian Photonics labs</td>
			<td>IR 3150</td>
			<td>Used to image IR beam spots on mirrors and&#160; targets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser power meter</td>
			<td>Thor labs</td>
			<td></td>
			<td>Measurement of laser output as well as trap strength</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser safety glasses (HeNe)</td>
			<td>Thor labs</td>
			<td>LG7 or 8</td>
			<td>Blocks &#62;3 OD units of light of wavelengths &#62;600 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser safety glasses (IR)</td>
			<td>Thor labs</td>
			<td>LG11</td>
			<td>Blocks &#62;7 OD units of light of wavelengths &#179;1000 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mcherry&#160; fluorescence filter cube</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>mcherry-a-lsc-zero</td>
			<td>Used in conjunction with Lambda DG4 to image mcherry only</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DMIRE2</td>
			<td>DIC port removed to accommodate Dichroic trapping/alignment mirror</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope control software&#160;</td>
			<td>UCSF/shareware</td>
			<td>uManager</td>
			<td>Controls the microscope, permits focal alignment of objectives as well as stage control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanoport assembly</td>
			<td>IDEX</td>
			<td>N333</td>
			<td>Connectors that are bonded to flow cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical table support</td>
			<td>Thor Labs</td>
			<td>PA52502</td>
			<td>Active isolation table support</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optics and lenses</td>
			<td>Solar TII</td>
			<td>Various</td>
			<td>Interference mirrors, telescopes and lenses custom designed for the system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDMS flow cells</td>
			<td>ufluidix</td>
			<td>Custom</td>
			<td>Flow cells built according to your specifications; imaging channels are clear (Figs. 2B and D)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEEK tubing</td>
			<td>IDEX</td>
			<td>1532</td>
			<td>Provides excellent connection to flow cells and switching valves</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pinkel fluorescence filter cube</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>lf488/543/635-3x-a-000</td>
			<td>Used in conjunction with Lambda DG4 to image multiple fluorophores rapidly</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Press fit tubing connectors</td>
			<td>GraceBio</td>
			<td>46003</td>
			<td>Clear silicone connector with adhesive that binds well to glass</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scanning mirrors</td>
			<td>GSI Lumonics</td>
			<td>VM500</td>
			<td>Used to provide control of the second optical trap. GSI Lumonics no longer exists. Similar mirrors can be purchased from Cambridge Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stage</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stage micrometer</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>68042-08</td>
			<td>Provides on screen ruler for positioning of the beam and system calibration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Switching valves</td>
			<td>IDEX</td>
			<td>V-101T</td>
			<td>Control direction of fluid flow and eliminate introduction of bubbles into flow cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe and valve manifold</td>
			<td>Machine shop</td>
			<td>None</td>
			<td>Custom built</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pump</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>PHD 2000</td>
			<td>Controls fluid flow through flow cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pump software</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>70-6000</td>
			<td>Flow control provides seamless, programmable control of fluid flow</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>81320</td>
			<td>Gas-tight, PTFE Luer Lock, glass barrels with Teflon-coated plungers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Table top</td>
			<td>Thor Labs</td>
			<td>T36H</td>
			<td>Optical table top or breadboard</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trapping laser</td>
			<td>Newport/Spectra Physics</td>
			<td>J-series; BL106C</td>
			<td>Nd:YAG laser; 1064 nm; 5W laser</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

use of dual optical tweezers and microfluidics for single-molecule studies

Visuel biokemi er en kraftfuld teknik til at observere de stokastiske egenskaber af enkeltenzymer eller enzymkomplekser, der er skjult i gennemsnittet, der finder sted i bulkfasestudier. For at opnå visualisering fokuseres dobbelt optisk pincet, hvor den ene fælde er fastgjort, og den anden er mobil, i en kanal i et multi-stream mikrofluidisk kammer placeret på scenen af et omvendt fluorescensmikroskop. Den optiske pincet fanger enkelte molekyler af fluorescerende mærket DNA og væskestrøm gennem kammeret og forbi de fangede perler, strækker DNA'et til B-form (under minimal kraft, dvs. 0 pN) med nukleinsyren observeret som en hvid streng mod en sort baggrund. DNA-molekyler flyttes fra en strøm til den næste ved at oversætte scenen vinkelret på strømmen for at muliggøre initiering af reaktioner på en kontrolleret måde. For at opnå succes parres mikrofluidiske enheder med optisk klare kanaler med glassprøjter, der holdes på plads i en sprøjtepumpe. Optimale resultater bruger stik, der er permanent bundet til flowcellen, slanger, der er mekanisk stive og kemisk resistente, og som er forbundet med koblingsventiler, der eliminerer bobler, der forhindrer laminær strømning.

Den indledende test af fældejusteringen og styrken udføres med 1 μm, ikke-fluorescerende polystyrenperler. Da det meste af den forskning, der udføres i laboratoriet, bruger fluorescens, tester vi yderligere fældestyrke ved hjælp af 1 μm, Dragon grønne polystyrenperler (figur 1D, E). Herefter ændres arbejdet til optisk fangst af DNA-perlekomplekser, hvor DNA'et farves med det bis-interkalerende farvestof YOYO-114,29<sup class="xref"...

Watch this Scientific Journal Video about Use of Dual Optical Tweezers and Microfluidics for Single-Molecule Studies at JoVE.com

Use of Dual Optical Tweezers and Microfluidics for Single-Molecule Studies

Visuel, enkeltmolekyle biokemi studeret gennem mikrofluidiske kamre lettes i høj grad ved hjælp af glastønde, gastætte sprøjter, stabile forbindelser af slanger til flowceller og eliminering af bobler ved at placere skifteventiler mellem sprøjterne og slangerne. Protokollen beskriver dobbelte optiske fælder, der muliggør visualisering af DNA-transaktioner og intermolekylære interaktioner.

Brug af dobbelt optisk pincet og mikrofluidik til enkeltmolekylestudier

Visual biochemistry is a powerful technique for observing the stochastic properties of single enzymes or enzyme complexes that are obscured in the ...

Fastgørelsen af porte til at parre sig til sprøjter med slanger er kritisk, fordi når det gøres rigtigt, er der ingen lækager, der er ingen bobler i flowcellen, og eksperimenter kan udføres gentagne gange ved hjælp af den samme flowcelle over en periode på et år med omhyggelig brug. Her vil to enkle metoder blive præsenteret for at fastgøre stikkene til flowceller. Disse er lette, de er reproducerbare og giver efterforskeren mulighed for nemt at tilpasse flowcellen til deres behov uden for mange problemer.Brugen af disse flowceller blev udført med enkeltmolekyleeksperimenter i tankerne. Især det, vi kalder visuel biokemi, men de kan bruges i enhver undersøgelse, hvor mikrofluidik er påkrævet, og i situationer, hvor laminavæskestrøm skal bruges. Så for at undgå fejl, i stedet for at bruge værdifulde flowceller til at etablere teknikkerne, vil jeg foreslå at øve på et glasglas eller en dækslip først.Dette vil gøre det muligt for en at få en fornemmelse af glasset eller PDMS-materialerne for at vide, hvordan man håndterer dem, og hvor meget kraft der skal påføres, når man indsætter slanger eller limer stikkene. Dette vil kræve at ofre nogle stik, men de er meget billigere end flowcellerne. Begynd med at placere flowcellen på en ren plan overflade.Hold PTFE-slangen tre millimeter fra den frie ende med tang, og skub slangen ind i porten. Gentag denne procedure for hver af de resterende porte. Tilslut indløbsportene til sprøjtepumpen og udløbet til en affaldsflaske.Fyld hver glassprøjte med en milliliter spektrofotometrisk, methanol af høj kvalitet, og fastgør dem til en koblingsventil. Sørg for, at ventilen har udløbet rettet mod affald, og rens hver ledning med 50 mikroliter methanol. Skift udløbspositionen til flowcellen, og pump 800 mikroliter methanol gennem flowcellen med en strømningshastighed på 100 mikroliter i timen for at våde overfladerne og eliminere bobler.Den næste dag gentages denne proces ved hjælp af 800 mikroliter ultrarent vand. Flowcellen er nu klar til brug. Hvis der skal anvendes tryktilpasningsrør, skal du forsigtigt fjerne klæbebåndet fra den ene side af stikket og placere det over hullet i mikroskopglasset.Tryk ned i et par sekunder. Gentag processen for de resterende connectorer. Placer derefter flowcellen på en ren flad overflade.Hold PTFE-slangen tre millimeter fra den frie ende, og skub slangen ind i hullet i porten. Gentag denne procedure for hver af de resterende porte. Fastgør slanger fra indløbene til koblingsventilerne.Placer tilbehøret enten på en ren, flad overflade eller på en specialbygget manifold for at holde flowcellen og stikkene på plads, mens bindingen finder sted. Placer flowcellen på den forsænkede del af manifolden, anbring derefter en lille mængde glaslim på bunden af samlingen, og indsæt tætningen. Placer nanoporten over et af indgangshullerne på mikroskopglasset.Skub forsigtigt ned og hold på plads uden lateral bevægelse. Gentag processen for de resterende porte. Lad tørre eller klemme på plads i manifolden.Fjern forsigtigt flowcellen fra manifolden, og sørg for, at samlingerne flugter godt med indgangsportene i flowcellen. Placer en flowcelle på mikroskoptrinnet, og fastgør slangen ved hjælp af de fingertætte stik. Fyld hver glassprøjte med en milliliter spektrofotometrisk methanol.Fastgør hver sprøjte til en skifteventil. Sørg for, at ventilen har udløbet rettet mod affald, og rens hver ledning med 50 mikroliter methanol. Skift udløbspositionen til flowcellen, og pump 800 mikroliter methanol gennem flowcellen med en strømningshastighed på 100 mikroliter i timen.Den næste dag gentages denne proces ved hjælp af 800 mikroliter ultrarent vand. Måling af effekten er vist her. Effekten fra laseren måles, før laserhovedet installeres i det optiske layout.Når fældejusteringen er udført, måles stråleeffekten efter 100 x målet for hver fælde. Billederne viser den stabile optiske fangst af et mikrometer fluorescerende perler. Her er F en fast fælde, og M er en mobilfælde.Med mobilfælden i scanningstilstand, der bevæger sig gennem en lille eller stor cirkel ved 30 hertz. Væskestrømmen i flowcellen er laminær. Skemaet viser flowcellen fra toppen for at demonstrere, at diffusionen mellem kanaler er den vigtigste kilde til blanding mellem de tilstødende væskestrømme.Blå pile angiver strømningsretningen, og de enkelte strømme er farvede, hvide, lysegrå og hvide. De bredere regioner med tværgående diffusion mellem kanaler er angivet med rødt. Indsatsen viser et fluorescensbillede af de tilstødende væskestrømme ved 10 gange forstørrelse med fluorescerende mærkede DNA-perlekomplekser i den nedre strøm og buffere kun i den øvre strøm.De hvide pletter i den øvre strøm er skudstøj fra CCD-kameraet. Flowprofilen og laminære flowceller er parabolske. Strømningscellen ses fra siden, og strømningsretningen er angivet over hver celle.Lineær perlehastighed påvirkes af pumpehastighed og saccharosekoncentration. Den modsatte kraft på en perle påvirkes af opløsningsviskositeten. Perlediameter påvirker kraften på perler under flow.Når du forsøger denne procedure, skal du sørge for, at det område, du arbejder i, er rent, og at du har renset glasoverfladerne med spektrometrisk methanol eller acetone. På dette tidspunkt skal du have en flowcelle, der er lavet til din sprøjtepumpe, og du er nu klar til at introducere dine løsninger og begynde optiske pinceteksperimenter. Brugen af flowceller, som kan bruges i længere tid, har gjort det muligt for forskere at undersøge en række enkeltmolekylereaktioner, hvor enten kræfter måles, reaktioner visualiseres ved fluorescens eller en kombination af begge.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

An Efficient Method for the Isolation of Highly Purified RNA from Seeds for Use in Quantitative Transcriptome Analysis

En effektiv metode til isolering af stærkt Renset RNA fra Frø til brug i Kvantitative Transkriptomet Analysis

Plant seeds accumulate large amounts of storage reserves comprising biodegradable organic matter. Humans rely on seed storage reserves for food and as ...

High Precision FRET at Single-molecule Level for Biomolecule Structure Determination

High Precision FRET på enkeltmolekyliveau for biomolekylstrukturbestemmelse

A protocol on how to perform high-precision interdye distance measurements using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) at the single-molecule ...

Single-molecule Manipulation of G-quadruplexes by Magnetic Tweezers

Enkelt-molekyle Manipulation af G-quadruplexes af magnetiske pincet

Non-canonical nucleic acid secondary structure G-quadruplexes (G4) are involved in diverse cellular processes, such as DNA replication, transcription, RNA ...

Covalent Immobilization of Proteins for the Single Molecule Force Spectroscopy

Kovalente immobilisering af proteiner for enkelt molekyle kraft spektroskopi

In recent years, atomic force microscopy (AFM) based single molecule force spectroscopy (SMFS) extended our understanding of molecular properties and ...

Proteome-wide Quantification of Labeling Homogeneity at the Single Molecule Level

Proteom-wide kvantificering af mærkning homogenitet på enkelt-molekyle niveau

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a ...

Production of Dynein and Kinesin Motor Ensembles on DNA Origami Nanostructures for Single Molecule Observation

Produktion af dynein og Kinesin motor ensembler på DNA origami nanostrukturer til observation af et enkelt molekyle

Cytoskeletal motors are responsible for a wide variety of functions in eukaryotic cells, including mitosis, cargo transport, cellular motility, and ...

OaAEP1-Mediated Enzymatic Synthesis and Immobilization of Polymerized Protein for Single-Molecule Force Spectroscopy

OaAEP1-Medieret enzymatisk syntese og immobilisering af polymeriseret protein til enkeltmolekylet spektroskopi

Chemical and bio-conjugation techniques have been developed rapidly in recent years and allow the building of protein polymers. However, a controlled ...

Conventional BODIPY Conjugates for Live-Cell Super-Resolution Microscopy and Single-Molecule Tracking

Konventionelle BODIPY konjugatter til Live-Cell Super-Resolution mikroskopi og Single-Molecule Tracking

Single molecule localization microscopy (SMLM) techniques overcome the optical diffraction limit of conventional fluorescence microscopy and can resolve ...

Single Cell Analysis Of Transcriptionally Active Alleles By Single Molecule FISH

Enkeltcelleanalyse af transskriptionsaktive alleler efter enkeltmolekyle FISH

Gene transcription is an essential process in cell biology, and allows cells to interpret and respond to internal and external cues. Traditional bulk ...

Making Precise and Accurate Single-Molecule FRET Measurements using the Open-Source smfBox

Præcis og præcis enkeltmolekyle FRET-målinger ved hjælp af Open Source smfBox

The smfBox is a recently developed cost-effective, open-source instrument for single-molecule F&#246;rster Resonance Energy Transfer (smFRET), which makes ...