Name: use of dual optical tweezers and microfluidics for single-molecule studies
Uploaded: 2022-11-18T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Use of Dual Optical Tweezers and Microfluidics for Single-Molecule Studies at JoVE.com

Onderzoek in het Bianco-laboratorium wordt ondersteund door NIH-subsidies GM100156 en GM144414 aan P.R.B.

1. Laserval uitlijning en testen met polystyreen kralen
OPMERKING: Voor de installatie raadpleegt u Figuur 1A,B.
LET OP: De experimentalist moet geschikte beschermende brillen of laserveiligheidsbrillen dragen tijdens het uitlijnen van laserstralen. Aangezien het hierin beschreven optische pincetsysteem zowel HeNe- als IR-stralen gebruikt, zijn twee afzonderlijke sets laserveiligheidsglaswerk vereist....

<ol>
	<li>Bianco, P. R., Lu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+insight+into+stalled+replication+fork+rescue+in+Escherichia+coli.">Single-molecule insight into stalled replication fork rescue in Escherichia coli.</a> Nucleic Acids Research. 49 (8), 4220-4238 (2021).</li><li>Kaur, G., Lewis, J. S., van Oijen, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shining+a+spotlight+on+DNA:+Single-molecule+methods+to+visualise+DNA.">Shining a spotlight on DNA: Single-molecule methods to visualise DNA.</a> Molecules. 24 (3), 491 (2019).</li><li>Dame, R. T., Noom, M. C., Wuite, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+chromatin+organization+by+H-NS+protein+unravelled+using+dual+DNA+manipulation.">Bacterial chromatin organization by H-NS protein unravelled using dual DNA manipulation.</a> Nature. 444 (7117), 387-390 (2006).</li><li>Bianco, P. R., Bradfield, J. J., Castanza, L. R., Donnelly, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rad54+oligomers+translocate+and+cross-bridge+double-stranded+DNA+to+stimulate+synapsis.">Rad54 oligomers translocate and cross-bridge double-stranded DNA to stimulate synapsis.</a> Journal of Molecular Biology. 374 (3), 618-640 (2007).</li><li>Amitani, I., Liu, B., Dombrowski, C. C., Baskin, R. J., Kowalczykowski, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Watching+individual+proteins+acting+on+single+molecules+of+DNA.">Watching individual proteins acting on single molecules of DNA.</a> Methods in Enzymology. 472, 261-291 (2010).</li><li>Brewer, L. R., Bianco, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laminar+flow+cells+for+single-molecule+studies+of+DNA-protein+interactions.">Laminar flow cells for single-molecule studies of DNA-protein interactions.</a> Nature Methods. 5 (6), 517-525 (2008).</li><li>Visscher, K., Brakenhoff, G. J., Krol, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micromanipulation+by+multiple+optical+traps+created+by+a+single+fast+scanning+trap+integrated+with+the+bilateral+Confocal+scanning+laser+microscope.">Micromanipulation by multiple optical traps created by a single fast scanning trap integrated with the bilateral Confocal scanning laser microscope.</a> Cytometry. 14, 105-114 (1993).</li><li>Vermeulen, K. C., Mameren, J. v. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calibrating+bead+displacements+in+optical+tweezers+using+acousto-optic+deflectors.">Calibrating bead displacements in optical tweezers using acousto-optic deflectors.</a> Review of Scientific Instruments. 77 (1), 013704 (2006).</li><li>Dufresne, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computer-generated+holographic+optical+tweezers+arrays.">Computer-generated holographic optical tweezers arrays.</a> Review of Scientific Instruments. 72 (3), 1810 (2001).</li><li>Squires, T. M., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidics:+fluid+physics+at+the+nanoliter+scale.">Microfluidics: fluid physics at the nanoliter scale.</a> Reviews of Modern Physics. 77, 977-1026 (2005).</li><li>Weibel, D. B., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+microfluidics+in+chemical+biology.">Applications of microfluidics in chemical biology.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 10 (6), 584-591 (2006).</li><li>Tan, X., Mizuuchi, M., Mizuuchi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+transposition+target+immunity+and+the+determinants+of+the+MuB+distribution+patterns+on+DNA.">DNA transposition target immunity and the determinants of the MuB distribution patterns on DNA.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (35), 13925-13929 (2007).</li><li>Lima, R., Wada, S., Takeda, M., Tsubota, K., Yamaguchi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+confocal+micro-PIV+measurements+of+blood+flow+in+a+square+microchannel:+the+effect+of+the+haematocrit+on+instantaneous+velocity+profiles.">In vitro confocal micro-PIV measurements of blood flow in a square microchannel: the effect of the haematocrit on instantaneous velocity profiles.</a> Journal of Biomechanics. 40 (12), 2752-2757 (2007).</li><li>Bianco, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Processive+translocation+and+DNA+unwinding+by+individual+RecBCD+enzyme+molecules.">Processive translocation and DNA unwinding by individual RecBCD enzyme molecules.</a> Nature. 409 (6818), 374-378 (2001).</li><li>Forget, A. L., Dombrowski, C. C., Amitani, I., Kowalczykowski, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+protein-DNA+interactions+in+3D+using+in+situ+construction,+manipulation+and+visualization+of+individual+DNA+dumbbells+with+optical+traps,+microfluidics+and+fluorescence+microscopy.">Exploring protein-DNA interactions in 3D using in situ construction, manipulation and visualization of individual DNA dumbbells with optical traps, microfluidics and fluorescence microscopy.</a> Nature Protocol. 8 (3), 525-538 (2013).</li><li>Streets, A. M., Huang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidics+for+biological+measurements+with+single-molecule+resolution.">Microfluidics for biological measurements with single-molecule resolution.</a> Current Opinion in Biotechnology. 25, 69-77 (2014).</li><li>Madariaga-Marcos, J., Corti, R., Hormeno, S., Moreno-Herrero, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+microfluidic+approaches+for+a+fast+and+efficient+reagent+exchange+in+single-molecule+studies.">Characterizing microfluidic approaches for a fast and efficient reagent exchange in single-molecule studies.</a> Scientific Reports. 10 (1), 18069 (2020).</li><li>Grayson, P., Han, L., Winther, T., Phillips, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+observations+of+single+bacteriophage+lambda+DNA+ejections+in+vitro.">Real-time observations of single bacteriophage lambda DNA ejections in vitro.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (37), 14652-14657 (2007).</li><li>Luo, G., Wang, M., Konigsberg, W. H., Xie, X. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+and+ensemble+fluorescence+assays+for+a+functionally+important+conformational+change+in+T7+DNA+polymerase.">Single-molecule and ensemble fluorescence assays for a functionally important conformational change in T7 DNA polymerase.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (31), 12610-12615 (2007).</li><li>Sia, S. K., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+devices+fabricated+in+poly(dimethylsiloxane)+for+biological+studies.">Microfluidic devices fabricated in poly(dimethylsiloxane) for biological studies.</a> Electrophoresis. 24 (21), 3563-3576 (2003).</li><li>Wuite, G. J. L., Davenport, R. J., Rappaport, A., Bustamante, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+integrated+laser+trap/flow+control+video+microscope+for+the+study+of+single+biomolecules.">An integrated laser trap/flow control video microscope for the study of single biomolecules.</a> Biophysical Journal. 79 (2), 1155-1167 (2000).</li><li>Kim, S., Blainey, P. C., Schroeder, C. M., Xie, X. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+single-molecule+assay+for+enzymatic+activity+on+flow-stretched+DNA.">Multiplexed single-molecule assay for enzymatic activity on flow-stretched DNA.</a> Nature Methods. 4 (5), 397-399 (2007).</li><li>Tanaka, H., Ishijima, A., Honda, M., Saito, K., Yanagida, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orientation+dependence+of+displacements+by+a+single+one-headed+myosin+relative+to+the+actin+filament.">Orientation dependence of displacements by a single one-headed myosin relative to the actin filament.</a> Biophysical Journal. 75 (4), 1886-1894 (1998).</li><li>Merenda, F., Andrews, D. L., Galves, E. J., Nienhuis, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Refractive+multiple+optical+tweezers+for+parallel+biochemical+analysis+in+micro-fluidics.">Refractive multiple optical tweezers for parallel biochemical analysis in micro-fluidics.</a> Proceeding of SPIE. , 6483 (2007).</li><li>Brewer, L. R., Corzett, M., Balhorn, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protamine-induced+condensation+and+decondensation+of+the+same+DNA+molecule.">Protamine-induced condensation and decondensation of the same DNA molecule.</a> Science. 286 (5437), 120-123 (1999).</li><li>Ladoux, B., Quivy, J. P., Doyle, P. S., Almouzni, G., Viovy, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+imaging+of+single-molecules:+from+dynamics+of+a+single+DNA+chain+to+the+study+of+complex+DNA-protein+interactions.">Direct imaging of single-molecules: from dynamics of a single DNA chain to the study of complex DNA-protein interactions.</a> Science Progress. 84, 267-290 (2001).</li><li>Bianco, P. R., Bradfield, J. J., Castanza, L. R., Donnelly, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rad54+oligomers+translocate+and+cross-bridge+double-stranded+DNA+to+stimulate+synapsis.">Rad54 oligomers translocate and cross-bridge double-stranded DNA to stimulate synapsis.</a> Journal of Molecular Biology. 374 (3), 618-640 (2007).</li><li>Pezza, R. J., Camerini-Otero, R. D., Bianco, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hop2-Mnd1+condenses+DNA+to+stimulate+the+synapsis+phase+of+DNA+strand+exchange.">Hop2-Mnd1 condenses DNA to stimulate the synapsis phase of DNA strand exchange.</a> Biophysical Journal. 99 (11), 3763-3772 (2010).</li><li>Rye, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+fluorescent+complexes+of+double-stranded+DNA+with+bis-intercalating+asymmetric+cyanine+dyes:+properties+and+applications.">Stable fluorescent complexes of double-stranded DNA with bis-intercalating asymmetric cyanine dyes: properties and applications.</a> Nucleic Acids Research. 20 (11), 2803-2812 (1992).</li></ol>

De zorgvuldige assemblage van het stroomsysteem is van cruciaal belang voor het succesvolle resultaat van experimenten 4,6. Een van de meest uitdagende aspecten van het protocol is de bevestiging van connectoren aan het glasoppervlak. Hiervoor gebruiken we de volgende twee benaderingen: press-fit tubing connectoren en nanoport assemblies. Press-fit connectoren hechten zich gemakkelijk aan glas, gevolgd door het duwen van PTFE-buizen in de voorgevormde gaten met b...

De mogelijkheid om eiwit-DNA-interacties op het niveau van één molecuul en in realtime te visualiseren, heeft een significant inzicht gegeven in de genoomstabiliteit 1,2. Naast het één voor één werken met enkele DNA-moleculen, biedt de mogelijkheid om transacties tussen individuele moleculen in de buurt te bekijken extra inzicht 3,4,5. De manipulatie van extra DNA-moleculen vereist zowel extra optische vallen als hoogwaardige, meerkanaals, microfluïdische stromingscellen6.
Er zijn verschillende methoden beschikbaar om meer dan één optische val te genereren. Deze omvatten galvanometerscanspiegels, akoestische optische modulatoren en diffractieve optica, die holografische optische pincetten genereren 4,7,8,9. Vaak produceren scanspiegels en akoestische optische modulatoren vallen die timeshare zijn. In de hier beschreven opstelling wordt de straal van een enkele Nd:YAG-laser gesplitst op polarisatie en vervolgens bepalen galvanometerlaserscanspiegels de positie van wat de mobiele val wordt genoemd (figuur 1)4. Om de positionering van spiegels en filters te vergemakkelijken om de vangstraal naar de achterste opening van het microscoopobjectief te richten, wordt een HeNe-laser gebruikt. Dit maakt de algehele uitlijning gemakkelijker omdat de HeNe-straal zichtbaar is voor het blote oog, terwijl infraroodstralen dat niet zijn. De HeNe-straal is ook veiliger om mee te werken, waardoor de positionering van spiegels en andere componenten minder stressvol is. Aanvankelijk is het straalpad voor deze laser gescheiden van de 1064 nm-straal, maar wordt in hetzelfde straalpad en vervolgens in het microscoopobjectief geïntroduceerd. Zodra fysieke uitlijning is bereikt, wordt de 1064 nm-straal bovenop de HeNe-straal geplaatst en dit wordt vergemakkelijkt door het gebruik van een infraroodviewer en verschillende straalbeeldvormingstools om de positie en kwaliteit van de bundel te visualiseren. Vervolgens wordt de bundelexpander geïntroduceerd en wordt de resulterende uitgebreide infraroodstraal uitgelijnd op de achterste opening van het objectief. Ten slotte wordt het doel verwijderd en wordt het vermogen in elke gepolariseerde bundel gemeten en aangepast met behulp van λ/2 golfplaten om gelijk te zijn (figuur 1C). Vermogensmetingen worden ook gedaan zodra het doel is geretourneerd en meestal is er een vermogensverlies van 53%. Er is echter voldoende vermogen om stabiele vaste en bewegende optische vallen in het brandpuntsvlak te vormen (figuur 1D).
Om DNA-transacties in beeld te brengen, spelen microfluïdische stromingscellen een sleutelrol omdat ze gecontroleerde metingen op het niveau van één molecuul met een hoge ruimtelijke en temporele resolutie mogelijk maken (figuur 2). De term microfluïdisch verwijst naar het vermogen om vloeistoffen te manipuleren in een of meer kanalen met afmetingen variërend van 5-500 μm10,11. De term stroom verwijst naar de werkelijke vloeistof in een kanaal en het kanaal verwijst naar het fysieke kanaal waarin een vloeistofstroom of stromen bewegen. Single-channel flow cell design heeft een gemeenschappelijk, fysiek kanaal waar reacties worden waargenomen en er is meestal slechts één vloeistofstroom aanwezig. Deze ontwerpen staan dus bekend als single-stream flow cellen. Multi-stream flowcellen daarentegen worden gedefinieerd als een microfluïdisch apparaat waarin twee of meer toegangskanalen samenkomen in een enkel, gemeenschappelijk, fysiek kanaal (figuur 2A). Binnen het gemeenschappelijke kanaal stromen de vloeistofstromen die afkomstig zijn van de afzonderlijke kanalen parallel aan elkaar en blijven gescheiden met slechts minimale vermenging tussen hen als gevolg van diffusie (figuur 2B). In de meeste experimentele opstellingen duwt een enkele pomp vloeistoffen met dezelfde snelheid in elk kanaal. Wanneer daarentegen grensbesturing wordt gebruikt, duwen drie of meer onafhankelijk geregelde pompen vloeistoffen door de kanalen. Elke pomp werkt echter met een ander toerental, maar het nettodebiet in het gemeenschappelijke kanaal is constant12. Dit maakt de snelle uitwisseling van hoofdkanaalcomponenten mogelijk door simpelweg de pompsnelheid te wijzigen.
Naast laminaire stroming is een andere kritische factor het parabolische snelheidsprofiel in de laminaire vloeistofstroom. De hoogste stroomsnelheid vindt plaats in het midden van de stroom en de langzaamste vindt plaats naast de oppervlakken (figuur 2C)13. Dit profiel moet worden beschouwd als een volledig uitrekken van een DNA-molecuul dat is bevestigd aan een kraal die in de stroom wordt gehouden voor nauwkeurige visualisatie van fluorescerend DNA en nauwkeurige analyses van één molecuul. Hier wordt het DNA uitgerekt tot B-vorm en op zijn plaats gehouden onder 0 pN kracht. Om dit te bereiken, moet de focus van de optische valpositie op een positie zijn die 10-20 μm van het onderste coverslipoppervlak ligt (figuur 2D). Er moet voor worden gezorgd dat het DNA-molecuul niet verder wordt uitgerekt dan B-vorm, omdat dit enzymreacties kan remmen. Onder typische bufferomstandigheden is 1 μm = 3.000 bp DNA14. Bovendien wordt het DNA-complex, door 10-20 μm van de coverslip te vangen, ver van het oppervlak geplaatst, waardoor oppervlakte-interacties worden geminimaliseerd.
Veel methoden zijn gebruikt om microfluïdische apparaatkanalen te creëren en deze kunnen in het laboratorium worden gedaan of stroomcellen kunnen worden gekocht bij commerciële bronnen 6,15,16,17. De optimale materialen die worden gebruikt om de stromingscellen te construeren, moeten mechanisch stijf, optisch transparant met een lage fluorescentie en ongevoelig voor organische oplosmiddelenzijn 6. Vaak worden borosilicaat floatglas of gesmolten silica gebruikt om gedurende langere tijd een stabiele stroomomgeving te bieden die geschikt is voor optische vangmethoden, visualisatie en krachtdetectie. Deze materialen maken ook het gebruik van niet-waterige oplosmiddelen (bijv. methanol van spectrofotometrische kwaliteit) mogelijk om oppervlaktebevochtiging en verwijdering van luchtbellen te vereenvoudigen, en denaturanten (bijv. 6M guanidiniumhydrochloride) of detergentia om de stroomcel te reinigen. Ten slotte variëren de methoden die worden gebruikt om vloeistoffen in stroomcellen te introduceren van complexe vacuümpompsystemen tot pompen met één spuit 14,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27. In de hier beschreven aanpak wordt een spuitpomp gebruikt die plaats biedt aan maximaal 10 spuiten (figuur 3A). Dit biedt flexibiliteit om eenkanaalsstroomcellen of stroomcellen met meerdere inlaatkanalen te gebruiken. Hier wordt een driekanaals flowcel gebruikt en gekoppeld aan spuiten die op hun plaats worden gehouden op de spuitpomp met behulp van poly-ether-ether-keton (PEEK) -slang (figuur 3A-C). De vloeistofstroom wordt geregeld door vierweg schakelkleppen en dient zo om de introductie van bellen in de stroomcel te minimaliseren (figuur 3A, D). Bovendien worden Hamilton gastdichte spuiten met stijve glazen wanden en polytetrafluorethyleen (PTFE)-gecoate plunjers aanbevolen omdat ze een uitzonderlijk soepele zuigerbeweging bieden die essentieel is voor het verkrijgen van een soepele stroom14,27.
In het beschreven experimentele systeem zijn flowcellen met twee tot vijf inlaatkanalen gebruikt. Het aantal inlaatkanalen wordt bepaald door het experiment dat wordt uitgevoerd. Voor het onderzoek van RecBCD en Hop2-Mnd1 waren twee stroomkanalen voldoende14,28. Voor de helicase werd het enzym gebonden aan het vrije uiteinde van het DNA en vertaald in een stroom met magnesium en ATP om translocatie en afwikkeling te initiëren. Voor Hop2-Mnd1 werd optisch gevangen DNA vertaald in de aangrenzende vloeistofstroom met eiwitten en buffer ± tweewaardige metaalionen. Het gebruik van driekanaals flowcellen stelt iemand in staat om DNA in stroom 1 te vangen, het DNA te vertalen naar stroom 2 om eiwitbinding mogelijk te maken en vervolgens 3 te streamen waar ATP aanwezig is, bijvoorbeeld om reacties te initiëren. Een variatie op het bovenstaande is om fluorescerend getagd eiwit in kanaal 2 te gebruiken, wat resulteert in een volledig witte vloeistofstroom en visualisatie van het DNA uitsluit. Wanneer dit molecuul wordt vertaald in stroom 3, zijn zowel eiwitten als DNA nu zichtbaar wanneer reacties worden geïnitieerd.
Het gebruik van vierweg schakelkleppen om de vloeistofstroom te regelen is een cruciaal onderdeel van het systeem om bellen in de stroomcellen te elimineren. Bellen zijn schadelijk voor een stabiele vloeistofstroom omdat ze samentrekken en op onvoorspelbare manieren uitzetten, wat resulteert in snelle veranderingen in stroomsnelheid en de introductie van turbulentie. Wanneer de kleppen tussen spuiten en inlaatslangen zijn geplaatst, wordt het stroompad losgekoppeld door de kleppositie te wijzigen wanneer spuiten worden vervangen. Wanneer de nieuwe spuit op zijn plaats wordt gezet, kan de zuiger handmatig worden ingedrukt, zodat >6 μL wordt uitgeworpen (het dode volume van de klep) en dit elimineert bijna volledig bubbels.
De bevestiging van connectoren aan stroomcellen is vaak de snelheidsbeperkende stap in het gebruik van stroomcellen. We beschrijven het gebruik van twee soorten connectoren: verwijderbaar bekend als press-fit en permanente connectoren (nanopoortassemblages). De verwijderbare connectoren zijn eenvoudig te hechten aan een flowcel en verschillende soorten flexibele buizen naast de aanbevolen PTFE kunnen met deze connectoren worden getest. Dit is een snelle en kosteneffectieve manier om slangen en connectoren te testen zonder duurdere glazen stromingscellen op te offeren. Nanopoortassemblages daarentegen worden permanent bevestigd, zijn bestand tegen drukken tot 1.000 psi en in onze handen is het gebruik ervan beperkt tot PEEK-buizen van verschillende diameters. Dit is geen nadeel aangezien peek buizen bij voorkeur worden gebruikt. Een enkele glazen flowcel met permanente assemblages kan bij zorgvuldig gebruik meer dan 1 jaar worden hergebruikt.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100x objective</td>
			<td>Leica</td>
			<td>506318 or 506038</td>
			<td>Oil immersion lenses; Imaging and optical trapping only; Plan APO objectives optimized for fluorescence imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X Objective</td>
			<td>Leica</td>
			<td>506263</td>
			<td>Used to locate laser beams spots during alignment; to find focus and X-Y position in flow cell</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mm fluorescent beads</td>
			<td>Bangs Labs</td>
			<td>FSDG004</td>
			<td>Used for tap performance, focal position determination</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mm polystyrene beads</td>
			<td>Bangs Labs</td>
			<td>CPO1004</td>
			<td>Used for trap performance evaluation and binding to biotinylated molecules</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>63x objective</td>
			<td>Leica</td>
			<td>506081</td>
			<td>Used to locate laser beams spots during alignment and to find focus and X-y position in flow cell; can be used for optical trapping as it has an identical back aperture diameter to the 100X; oil immersion lens</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alignment laser</td>
			<td>Lumentum</td>
			<td>1100 series</td>
			<td>10mW HeNe laser that is visible to the naked eye that is used to position optics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beam alignment camera</td>
			<td>Amscope</td>
			<td>MU303</td>
			<td>A simple, inexpensive and software controlled camera for imaging of the beam position</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera control and Image capture software</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>HCImage</td>
			<td>Coordinates activities of the Lambda DG4 with the camera to facilitate rapid wavelength switching</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera; Orca flash 4</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>c13440-20cu</td>
			<td>CCD camera for imaging of single-molecule experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C-mount for the beam alignment camera</td>
			<td>Spot imaging solutions</td>
			<td>DE50CMT</td>
			<td>Provides optimal positioning of the camera for imaging of laser beams during alignment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C-mount for the Orca Flash 4 camera</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Has a retainer ring to hold an IR blocking filter in place. This eliminates reflected IR beam from the optical traps and facilitates clearer imaging of trapped objects.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy5&#160; fluorescence filter cube</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>cy5-404a-lsc-zero</td>
			<td>Used in conjunction with Lambda DG4 to image Cy5 only</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fitc-Txred&#160; fluorescence filter cube</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>fitc/txred-2x-b-000</td>
			<td>Used in conjunction with Lambda DG4 to image FITC and TXRed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluidics tubing</td>
			<td>Grace Bio</td>
			<td>46004</td>
			<td>PTFE tubing as an alternate to PEEK; works well on some flow cells. Can be used with PDMS flow cells or glass flow cells when Grace Bio fit tubing connectors are used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP fluorescence filter cube</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>gfp-3035b-lsc-zero</td>
			<td>Used in conjunction with Lambda DG4 to image GFP only</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass flow cells</td>
			<td>Translume</td>
			<td>Custom</td>
			<td>Clear flow channels for imaging (Fig. 2E)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass glue</td>
			<td>Loctite</td>
			<td>233841</td>
			<td>Securely and easily bonds Nanoport assemblies to glass flow cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass/PDMS sandwich flow cells</td>
			<td>CIDRA Precision services</td>
			<td>Custom design</td>
			<td>Flow cells built according to your specifications; imaging channels are clear (Fig. 2C)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton Cleaning solution</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>18311</td>
			<td>Gentle but efficient cleaning solution for glass flow cells; does not bubble when used carefully</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Illumination system</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>Lamda DG4</td>
			<td>Discontinued so recommend Lambda 721</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Illumination system</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>Lamda DG4</td>
			<td>Discontinued so recommend Lambda 721</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image analysis software</td>
			<td>Media cybernetics</td>
			<td>Image Pro Premiere</td>
			<td>Analysis of images and single molecule tracking</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image analysis software</td>
			<td>Fiji/NIH Image/Image J</td>
			<td>Shareware</td>
			<td>Analysis of images and single molecule tracking</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image display card</td>
			<td>Melles Griot</td>
			<td>06 DLA 001</td>
			<td>Alternate product from Thorlabs: VRC5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immersion oil</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>444960</td>
			<td>Immersol 518 F fluorescence free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser beam alignment tools</td>
			<td>Thor labs</td>
			<td>FMP05/M; dgo5-1500-h1; BHM1&#160;</td>
			<td>Used to ensure beams are horizontal and at the correct height</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser beam viewer</td>
			<td>Canadian Photonics labs</td>
			<td>IR 3150</td>
			<td>Used to image IR beam spots on mirrors and&#160; targets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser power meter</td>
			<td>Thor labs</td>
			<td></td>
			<td>Measurement of laser output as well as trap strength</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser safety glasses (HeNe)</td>
			<td>Thor labs</td>
			<td>LG7 or 8</td>
			<td>Blocks &#62;3 OD units of light of wavelengths &#62;600 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser safety glasses (IR)</td>
			<td>Thor labs</td>
			<td>LG11</td>
			<td>Blocks &#62;7 OD units of light of wavelengths &#179;1000 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mcherry&#160; fluorescence filter cube</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>mcherry-a-lsc-zero</td>
			<td>Used in conjunction with Lambda DG4 to image mcherry only</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DMIRE2</td>
			<td>DIC port removed to accommodate Dichroic trapping/alignment mirror</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope control software&#160;</td>
			<td>UCSF/shareware</td>
			<td>uManager</td>
			<td>Controls the microscope, permits focal alignment of objectives as well as stage control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanoport assembly</td>
			<td>IDEX</td>
			<td>N333</td>
			<td>Connectors that are bonded to flow cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical table support</td>
			<td>Thor Labs</td>
			<td>PA52502</td>
			<td>Active isolation table support</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optics and lenses</td>
			<td>Solar TII</td>
			<td>Various</td>
			<td>Interference mirrors, telescopes and lenses custom designed for the system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDMS flow cells</td>
			<td>ufluidix</td>
			<td>Custom</td>
			<td>Flow cells built according to your specifications; imaging channels are clear (Figs. 2B and D)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEEK tubing</td>
			<td>IDEX</td>
			<td>1532</td>
			<td>Provides excellent connection to flow cells and switching valves</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pinkel fluorescence filter cube</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>lf488/543/635-3x-a-000</td>
			<td>Used in conjunction with Lambda DG4 to image multiple fluorophores rapidly</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Press fit tubing connectors</td>
			<td>GraceBio</td>
			<td>46003</td>
			<td>Clear silicone connector with adhesive that binds well to glass</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scanning mirrors</td>
			<td>GSI Lumonics</td>
			<td>VM500</td>
			<td>Used to provide control of the second optical trap. GSI Lumonics no longer exists. Similar mirrors can be purchased from Cambridge Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stage</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stage micrometer</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>68042-08</td>
			<td>Provides on screen ruler for positioning of the beam and system calibration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Switching valves</td>
			<td>IDEX</td>
			<td>V-101T</td>
			<td>Control direction of fluid flow and eliminate introduction of bubbles into flow cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe and valve manifold</td>
			<td>Machine shop</td>
			<td>None</td>
			<td>Custom built</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pump</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>PHD 2000</td>
			<td>Controls fluid flow through flow cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pump software</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>70-6000</td>
			<td>Flow control provides seamless, programmable control of fluid flow</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>81320</td>
			<td>Gas-tight, PTFE Luer Lock, glass barrels with Teflon-coated plungers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Table top</td>
			<td>Thor Labs</td>
			<td>T36H</td>
			<td>Optical table top or breadboard</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trapping laser</td>
			<td>Newport/Spectra Physics</td>
			<td>J-series; BL106C</td>
			<td>Nd:YAG laser; 1064 nm; 5W laser</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

use of dual optical tweezers and microfluidics for single-molecule studies

Visuele biochemie is een krachtige techniek voor het observeren van de stochastische eigenschappen van afzonderlijke enzymen of enzymcomplexen die worden verduisterd in de middeling die plaatsvindt in bulkfasestudies. Om visualisatie te bereiken, worden dubbele optische pincetten, waarbij de ene val vast is en de andere mobiel is, gericht in één kanaal van een multi-stream microfluïdische kamer die op het podium van een omgekeerde fluorescentiemicroscoop is geplaatst. Het optische pincet vangt enkele moleculen van fluorescerend gelabeld DNA en vloeistof stroomt door de kamer en langs de gevangen kralen, rekt het DNA uit tot B-vorm (onder minimale kracht, d.w.z. 0 pN) waarbij het nucleïnezuur wordt waargenomen als een witte string tegen een zwarte achtergrond. DNA-moleculen worden van de ene stroom naar de andere verplaatst, door het stadium loodrecht op de stroom te vertalen om het initiëren van reacties op een gecontroleerde manier mogelijk te maken. Om succes te behalen, worden microfluïdische apparaten met optisch heldere kanalen gekoppeld aan glazen spuiten die op hun plaats worden gehouden in een spuitpomp. Optimale resultaten maken gebruik van connectoren die permanent aan de stroomcel zijn bevestigd, buizen die mechanisch stijf en chemisch resistent zijn en die zijn verbonden met schakelkleppen die bellen elimineren die laminaire stroming belemmeren.

De eerste tests van de uitlijning en sterkte van de val worden uitgevoerd met 1 μm, niet-fluorescerende polystyreenparels. Omdat het grootste deel van het onderzoek dat in het laboratorium wordt gedaan fluorescentie gebruikt, testen we de valsterkte verder met behulp van 1 μm, Dragon groene polystyreen kralen (figuur 1D, E). Daarna verandert het werk in optische vangst van DNA-kraalcomplexen waarbij het DNA wordt gekleurd met de bis-intercalerende kleurstof YOYO-1<sup clas...

Watch this Scientific Journal Video about Use of Dual Optical Tweezers and Microfluidics for Single-Molecule Studies at JoVE.com

Use of Dual Optical Tweezers and Microfluidics for Single-Molecule Studies

Visuele, single-molecule biochemie bestudeerd door microfluïdische kamers wordt aanzienlijk vergemakkelijkt met behulp van glazen vaten, gasdichte spuiten, stabiele verbindingen van slangen met stroomcellen en eliminatie van bellen door schakelkleppen tussen de spuiten en slangen te plaatsen. Het protocol beschrijft dubbele optische vallen die visualisatie van DNA-transacties en intermoleculaire interacties mogelijk maken.

Gebruik van dual optische pincet en microfluïdica voor single-molecule studies

Visual biochemistry is a powerful technique for observing the stochastic properties of single enzymes or enzyme complexes that are obscured in the ...

De bevestiging van poorten om te paren aan spuiten met slangen is van cruciaal belang omdat, wanneer het goed wordt gedaan, er geen lekken zijn, er geen bellen in de stroomcel zijn en experimenten herhaaldelijk kunnen worden gedaan met dezelfde stroomcel gedurende een periode van een jaar met zorgvuldig gebruik. Hier worden twee eenvoudige methoden gepresenteerd om de connectoren aan stroomcellen te bevestigen. Deze zijn eenvoudig, ze zijn reproduceerbaar en stellen de onderzoeker in staat om de stroomcel gemakkelijk aan te passen aan hun behoeften zonder al te veel moeite.Het gebruik van deze flowcellen werd gedaan met experimenten met één molecuul in het achterhoofd. In het bijzonder wat we visuele biochemie noemen, maar ze kunnen worden gebruikt in elke studie waar microfluïdica vereist is en in situaties waarin lamina-vloeistofstroom moet worden gebruikt. Dus, om fouten te voorkomen, in plaats van waardevolle flowcellen te gebruiken om de technieken vast te stellen, zou ik aanraden om eerst op een glazen dia of een cover slip te oefenen.Dit zal iemand in staat stellen om een gevoel te krijgen voor het glas of de PDMS-materialen om te weten hoe ze moeten worden behandeld en hoeveel kracht moet worden uitgeoefend bij het inbrengen van buizen of het verlijmen van de connectoren. Dit vereist het opofferen van enkele connectoren, maar ze zijn veel goedkoper dan de stroomcellen. Begin met het plaatsen van de stroomcel op een schoon vlak oppervlak.Houd de PTFE-buis drie millimeter van het vrije uiteinde met een tang en duw de buis in de poort. Herhaal deze procedure voor elk van de resterende poorten. Sluit de inlaatpoorten aan op de spuitpomp en de uitlaat op een afvalfles.Vul elke glazen spuit met een milliliter spectrofotometrische methanol van kwaliteit en bevestig ze aan een schakelklep. Zorg ervoor dat de uitlaat naar afval is gericht en spoel elke lijn met 50 microliter methanol. Schakel de uitlaatpositie naar de stroomcel en pomp 800 microliter methanol door de stroomcel met een stroomsnelheid van 100 microliter per uur om de oppervlakken nat te maken en bellen te elimineren.Herhaal dit proces de volgende dag met behulp van 800 microliter ultrapuur water. De flowcel is nu klaar voor gebruik. Als u buisconnectoren voor persfitting wilt gebruiken, verwijdert u de plakband voorzichtig van één kant van de connector en plaatst u deze over het gat in de microscoopglaas.Druk een paar seconden naar beneden. Herhaal het proces voor de resterende connectoren. Plaats de flowcel vervolgens op een schoon vlak oppervlak.Houd de PTFE-buis drie millimeter van het vrije uiteinde en duw de buis in het gat in de poort. Herhaal deze procedure voor elk van de resterende poorten. Bevestig slangen van de inlaten aan de schakelkleppen.Plaats het hulpstuk op een schoon, vlak oppervlak of op een speciaal gebouwd spruitstuk om de stroomcel en connectoren op hun plaats te houden terwijl de verlijming plaatsvindt. Plaats de stroomcel op het verzonken gedeelte van het spruitstuk en plaats vervolgens een kleine hoeveelheid glaslijm op de bodem van de assemblage en plaats de afdichting. Plaats de nanopoort boven een van de ingangsgaten op de microscoopglaasjes.Duw zachtjes naar beneden en houd op zijn plaats zonder zijdelingse beweging. Herhaal het proces voor de resterende poorten. Laat drogen of klem op zijn plaats in het spruitstuk.Verwijder de stroomcel voorzichtig uit het spruitstuk en zorg ervoor dat de assemblages goed zijn uitgelijnd met de ingangspoorten in de stroomcel. Plaats een flowcel op het microscooppodium en bevestig de slang met behulp van de vingerdichte connectoren. Vul elke glazen spuit met een milliliter spectrofotometrische methanol.Bevestig elke spuit aan een schakelklep. Zorg ervoor dat de uitlaat naar afval is gericht en spoel elke lijn met 50 microliter methanol. Schakel de uitlaatpositie naar de stroomcel en pomp 800 microliter methanol door de stroomcel met een debiet van 100 microliter per uur.Herhaal dit proces de volgende dag met behulp van 800 microliter ultrapuur water. Meting van het uitgangsvermogen wordt hier weergegeven. Het uitgangsvermogen van de laser wordt gemeten voordat de laserkop in de optische lay-out wordt geïnstalleerd.Zodra de valuitlijning is voltooid, wordt het straalvermogen gemeten na het doel van 100 x voor elke val. De beelden tonen de stabiele optische vansluiting van één micrometer fluorescerende kralen. Hier is F een vaste val en M een mobiele valstrik.Met de mobiele val in de scanmodus die door een kleine of grote cirkel beweegt bij 30 hertz. De vloeistofstroom in de stromingscel is laminair. Het schema toont de stroomcel van bovenaf om aan te tonen dat de interkanaaldiffusie de belangrijkste bron is van vermenging tussen de aangrenzende vloeistofstromen.Blauwe pijlen geven de stroomrichting aan en de afzonderlijke stromen zijn gekleurd, wit, lichtgrijs en wit. De verbredingsgebieden van transversale diffusie tussen kanalen worden rood aangegeven. De inzet toont een fluorescentiebeeld van de aangrenzende vloeistofstromen bij 10 keer vergroting met fluorescerende gelabelde DNA-kraalcomplexen in de onderste stroom en buffers alleen in de bovenste stroom.De witte vlekken in de bovenste stroom zijn geschoten ruis van de CCD-camera. Het stromingsprofiel en de laminaire stromingscellen zijn parabolisch. De stroomcel wordt vanaf de zijkant bekeken en de richting van de stroom wordt boven elke cel aangegeven.Lineaire kraalsnelheid wordt beïnvloed door pompsnelheid en sucroseconcentratie. De tegengestelde kracht op een kraal wordt beïnvloed door de viscositeit van de oplossing. De diameter van de kraal beïnvloedt de kracht op kralen onder stroming.Wanneer u deze procedure probeert, moet u ervoor zorgen dat het gebied waarin u werkt schoon is en dat u de glasoppervlakken hebt gereinigd met spectrometrische methanol of aceton. In dit stadium zou u een stroomcel moeten hebben die naar uw spuitpomp wordt gebracht en u bent nu klaar om uw oplossingen te introduceren en optische pincetexperimenten te starten. Het gebruik van flowcellen, die gedurende langere tijd kunnen worden gebruikt, heeft onderzoekers in staat gesteld om een verscheidenheid aan reacties van één molecuul te onderzoeken waarbij beide krachten worden gemeten, reacties worden gevisualiseerd door fluorescentie of een combinatie van beide.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

An Efficient Method for the Isolation of Highly Purified RNA from Seeds for Use in Quantitative Transcriptome Analysis

Een efficiënte methode voor het isoleren van zeer gezuiverde RNA uit zaden voor gebruik in Quantitative Analysis Transcriptome

Plant seeds accumulate large amounts of storage reserves comprising biodegradable organic matter. Humans rely on seed storage reserves for food and as ...

High Precision FRET at Single-molecule Level for Biomolecule Structure Determination

High Precision FRET op single-molecuul niveau voor biomolecule structuur bepaling

A protocol on how to perform high-precision interdye distance measurements using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) at the single-molecule ...

Single-molecule Manipulation of G-quadruplexes by Magnetic Tweezers

Single-molecuul manipulatie van G-quadruplexes door magnetische pincet

Non-canonical nucleic acid secondary structure G-quadruplexes (G4) are involved in diverse cellular processes, such as DNA replication, transcription, RNA ...

Covalent Immobilization of Proteins for the Single Molecule Force Spectroscopy

Covalente immobilisatie van eiwitten voor de enkel molecuul Force spectroscopie

In recent years, atomic force microscopy (AFM) based single molecule force spectroscopy (SMFS) extended our understanding of molecular properties and ...

Proteome-wide Quantification of Labeling Homogeneity at the Single Molecule Level

Proteoom bestrijkende kwantificering van Labeling homogeniteit op het niveau van één molecuul

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a ...

Production of Dynein and Kinesin Motor Ensembles on DNA Origami Nanostructures for Single Molecule Observation

Productie van Dynein en Kinesin motor ensembles op DNA origami nanostructuren voor observatie van enkelvoudige moleculen

Cytoskeletal motors are responsible for a wide variety of functions in eukaryotic cells, including mitosis, cargo transport, cellular motility, and ...

OaAEP1-Mediated Enzymatic Synthesis and Immobilization of Polymerized Protein for Single-Molecule Force Spectroscopy

OaAEP1-Gemedeerde Enzymatische Synthese en Immobilisatie van gepolymeriseerd eiwit voor Single-Molecule Force Spectroscopie

Chemical and bio-conjugation techniques have been developed rapidly in recent years and allow the building of protein polymers. However, a controlled ...

Conventional BODIPY Conjugates for Live-Cell Super-Resolution Microscopy and Single-Molecule Tracking

Conventionele BODIPY Conjugates voor Live-Cell Super-Resolution Microscopie en Single-Molecule Tracking

Single molecule localization microscopy (SMLM) techniques overcome the optical diffraction limit of conventional fluorescence microscopy and can resolve ...

Single Cell Analysis Of Transcriptionally Active Alleles By Single Molecule FISH

Single cell analyse van transcriptioneel actieve allelen door single molecule FISH

Gene transcription is an essential process in cell biology, and allows cells to interpret and respond to internal and external cues. Traditional bulk ...

Making Precise and Accurate Single-Molecule FRET Measurements using the Open-Source smfBox

Nauwkeurige en nauwkeurige FRET-metingen met één molecuul uitvoeren met behulp van de Open-Source smfBox

The smfBox is a recently developed cost-effective, open-source instrument for single-molecule F&#246;rster Resonance Energy Transfer (smFRET), which makes ...