Name: use of dual optical tweezers and microfluidics for single-molecule studies
Uploaded: 2022-11-18T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Use of Dual Optical Tweezers and Microfluidics for Single-Molecule Studies at JoVE.com

La ricerca nel laboratorio Bianco è supportata dalle sovvenzioni NIH GM100156 e GM144414 a P.R.B.

1. Allineamento e test della trappola laser con perline di polistirolo
NOTA: per l'installazione, fare riferimento alla Figura 1A,B.
ATTENZIONE: Lo sperimentatore deve indossare occhiali protettivi appropriati o occhiali di sicurezza laser durante l'allineamento del raggio laser. Poiché il sistema di pinzette ottiche qui descritto utilizza sia raggi HeNe che IR, sono necessari due set separati di vetreri...

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	<li>Bianco, P. R., Lu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+insight+into+stalled+replication+fork+rescue+in+Escherichia+coli.">Single-molecule insight into stalled replication fork rescue in Escherichia coli.</a> Nucleic Acids Research. 49 (8), 4220-4238 (2021).</li><li>Kaur, G., Lewis, J. S., van Oijen, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shining+a+spotlight+on+DNA:+Single-molecule+methods+to+visualise+DNA.">Shining a spotlight on DNA: Single-molecule methods to visualise DNA.</a> Molecules. 24 (3), 491 (2019).</li><li>Dame, R. T., Noom, M. C., Wuite, G. 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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micromanipulation+by+multiple+optical+traps+created+by+a+single+fast+scanning+trap+integrated+with+the+bilateral+Confocal+scanning+laser+microscope.">Micromanipulation by multiple optical traps created by a single fast scanning trap integrated with the bilateral Confocal scanning laser microscope.</a> Cytometry. 14, 105-114 (1993).</li><li>Vermeulen, K. C., Mameren, J. v. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calibrating+bead+displacements+in+optical+tweezers+using+acousto-optic+deflectors.">Calibrating bead displacements in optical tweezers using acousto-optic deflectors.</a> Review of Scientific Instruments. 77 (1), 013704 (2006).</li><li>Dufresne, E. 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S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+single-molecule+assay+for+enzymatic+activity+on+flow-stretched+DNA.">Multiplexed single-molecule assay for enzymatic activity on flow-stretched DNA.</a> Nature Methods. 4 (5), 397-399 (2007).</li><li>Tanaka, H., Ishijima, A., Honda, M., Saito, K., Yanagida, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orientation+dependence+of+displacements+by+a+single+one-headed+myosin+relative+to+the+actin+filament.">Orientation dependence of displacements by a single one-headed myosin relative to the actin filament.</a> Biophysical Journal. 75 (4), 1886-1894 (1998).</li><li>Merenda, F., Andrews, D. L., Galves, E. 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R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hop2-Mnd1+condenses+DNA+to+stimulate+the+synapsis+phase+of+DNA+strand+exchange.">Hop2-Mnd1 condenses DNA to stimulate the synapsis phase of DNA strand exchange.</a> Biophysical Journal. 99 (11), 3763-3772 (2010).</li><li>Rye, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+fluorescent+complexes+of+double-stranded+DNA+with+bis-intercalating+asymmetric+cyanine+dyes:+properties+and+applications.">Stable fluorescent complexes of double-stranded DNA with bis-intercalating asymmetric cyanine dyes: properties and applications.</a> Nucleic Acids Research. 20 (11), 2803-2812 (1992).</li></ol>

L'assemblaggio accurato del sistema di flusso è fondamentale per il buon esito degli esperimenti 4,6. Uno degli aspetti più impegnativi del protocollo è il fissaggio dei connettori alla superficie del vetro. Per questo, utilizziamo i seguenti due approcci: connettori per tubi press-fit e assemblaggi nanoport. I connettori press-fit aderiscono facilmente al vetro seguiti dalla spinta dei tubi in PTFE nei fori preformati utilizzando una pinza. Quando è richiest...

La capacità di visualizzare le interazioni proteina-DNA a livello di singola molecola e in tempo reale ha fornito informazioni significative sulla stabilità del genoma 1,2. Oltre a lavorare con singole molecole di DNA una alla volta, la possibilità di visualizzare le transazioni tra singole molecole vicine fornisce ulteriori informazioni 3,4,5. La manipolazione di ulteriori molecole di DNA richiede sia trappole ottiche aggiuntive che celle a flusso microfluidico multicanale di alta qualità6.
Esistono diversi metodi disponibili per generare più di una trappola ottica. Questi includono specchi a scansione galvanometrica, modulatori ottici acustici e ottiche diffrattive, che generano pinzette ottiche olografiche 4,7,8,9. Spesso, specchi a scansione e modulatori ottici acustici producono trappole che multiproprietà. Nella configurazione qui descritta, il fascio di un singolo laser Nd: YAG viene diviso sulla polarizzazione, e quindi gli specchi di scansione laser galvanometrici controllano la posizione di quella che viene definita la trappola mobile (Figura 1) 4. Per facilitare il posizionamento di specchi e filtri per dirigere il fascio di intrappolamento verso l'apertura posteriore dell'obiettivo del microscopio, viene utilizzato un laser HeNe. Ciò rende più facile l'allineamento generale in quanto il fascio HeNe è visibile ad occhio nudo, mentre i raggi infrarossi non lo sono. Il fascio HeNe è anche più sicuro da lavorare rendendo il posizionamento di specchi e altri componenti meno stressante. Inizialmente, il percorso del fascio per questo laser è separato dal raggio di 1064 nm, ma viene introdotto nello stesso percorso del fascio e quindi nell'obiettivo del microscopio. Una volta raggiunto l'allineamento fisico, viene eseguito il posizionamento del fascio di 1064 nm sopra il fascio HeNe e questo è facilitato dall'uso di un visualizzatore a infrarossi e vari strumenti di imaging del fascio per visualizzare la posizione e la qualità del fascio. Quindi, viene introdotto l'espansore del fascio e il raggio infrarosso espanso risultante viene allineato sull'apertura posteriore dell'obiettivo. Infine, l'obiettivo viene rimosso e la potenza in ciascun fascio polarizzato viene misurata e regolata utilizzando piastre d'onda λ/2 per essere uguale (Figura 1C). Le misurazioni della potenza vengono eseguite anche una volta restituito l'obiettivo e in genere c'è una perdita di potenza del 53%. C'è, tuttavia, una potenza sufficiente per formare trappole ottiche fisse e mobili stabili nel piano focale (Figura 1D).
Per visualizzare le transazioni del DNA, le celle a flusso microfluidico svolgono un ruolo chiave in quanto consentono misurazioni controllate a livello di singola molecola con un'elevata risoluzione spaziale e temporale (Figura 2). Il termine microfluidica si riferisce alla capacità di manipolare fluidi in uno o più canali con dimensioni comprese tra 5-500 μm10,11. Il termine flusso si riferisce al fluido effettivo all'interno di un canale e il canale si riferisce al canale fisico in cui si muovono uno o più flussi di fluidi. Il design della cella di flusso a canale singolo ha un canale fisico comune in cui vengono osservate le reazioni e in genere è presente un solo flusso di fluido. Pertanto, questi progetti sono noti come celle di flusso a flusso singolo. Al contrario, le celle a flusso multi-stream sono definite come un dispositivo microfluidico in cui due o più canali di ingresso convergono in un singolo canale fisico comune (Figura 2A). All'interno del canale comune, i flussi fluidi che hanno origine dai singoli canali fluiscono paralleli l'uno all'altro e rimangono separati con una miscelazione minima tra loro che si verifica a causa della diffusione (Figura 2B). Nella maggior parte delle configurazioni sperimentali, una singola pompa spinge i fluidi in ciascun canale alla stessa velocità. Al contrario, quando viene utilizzato lo sterzo di confine, tre o più pompe a controllo indipendente spingono i fluidi attraverso i canali. Tuttavia, ogni pompa funziona a una velocità diversa, ma la portata netta nel canale comune è costante12. Ciò consente la rapida sostituzione dei componenti del canale principale semplicemente modificando la velocità della pompa.
Oltre al flusso laminare, un altro fattore critico è il profilo di velocità parabolica all'interno del flusso di fluido laminare. La velocità di flusso più elevata si verifica nel mezzo del flusso e la più lenta si verifica vicino alle superfici (Figura 2C)13. Questo profilo deve essere considerato per allungare completamente una molecola di DNA che è attaccata a una perla tenuta nel flusso per una visualizzazione precisa del DNA fluorescente e accurate analisi di singole molecole. Qui, il DNA è allungato in forma B e viene tenuto in posizione sotto 0 pN di forza. Per raggiungere questo obiettivo, la messa a fuoco della posizione della trappola ottica dovrebbe essere in una posizione di 10-20 μm dalla superficie inferiore del coperchio (Figura 2D). Bisogna fare attenzione in modo che la molecola di DNA non sia allungata oltre la forma B in quanto ciò può inibire le reazioni enzimatiche. In condizioni tampone tipiche, 1 μm = 3.000 bp di DNA14. Inoltre, intrappolando 10-20 μm dal vetrino, il complesso del DNA viene posizionato lontano dalla superficie, riducendo così al minimo le interazioni superficiali.
Molti metodi sono stati utilizzati per creare canali di dispositivi microfluidici e questi possono essere fatti in laboratorio o celle di flusso possono essere acquistati da fonti commerciali 6,15,16,17. I materiali ottimali utilizzati per costruire le celle di flusso devono essere meccanicamente rigidi, otticamente trasparenti con bassa fluorescenza e impermeabili ai solventi organici6. Spesso, il vetro float borosilicato o la silice fusa vengono utilizzati per fornire un ambiente di flusso stabile per un tempo prolungato adatto per l'intrappolamento ottico, la visualizzazione e il rilevamento della forza. Questi materiali consentono anche l'uso di solventi non acquosi (ad esempio, metanolo spettrofotometrico) per semplificare la bagnatura superficiale e la rimozione delle bolle d'aria e denaturanti (ad esempio, 6M guanidinium cloridrato) o detergenti per pulire la cella di flusso. Infine, i metodi utilizzati per introdurre fluidi nelle celle di flusso variano da complessi sistemi di pompe per vuoto a pompe a siringa singola 14,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27. Nell'approccio qui descritto, viene utilizzata una pompa a siringa che può contenere fino a 10 siringhe (Figura 3A). Ciò offre la flessibilità di utilizzare celle di flusso a canale singolo o celle di flusso con più canali di ingresso. Qui, viene utilizzata una cella di flusso a tre canali che viene accoppiata a siringhe tenute in posizione sulla pompa a siringa utilizzando tubi in poli-etere-etere-chetone (PEEK) (Figura 3A-C). Il flusso dei fluidi è controllato da valvole di commutazione a quattro vie e serve quindi a ridurre al minimo l'introduzione di bolle nella cella di flusso (Figura 3A,D). Inoltre, si raccomandano siringhe a tenuta di gas Hamilton con pareti di vetro rigide e stantuffi rivestiti in politetrafluoroetilene (PTFE), in quanto forniscono un movimento eccezionalmente regolare dello stantuffo che è essenziale per ottenere un flusso regolare14,27.
Nel sistema sperimentale descritto sono state utilizzate celle di flusso con canali di ingresso da due a cinque. Il numero di canali di ingresso è dettato dall'esperimento in corso. Per lo studio di RecBCD e Hop2-Mnd1, due canali di flusso erano sufficienti14,28. Per l'elicasi, l'enzima è stato legato all'estremità libera del DNA e tradotto in un flusso contenente magnesio e ATP per avviare la traslocazione e lo svolgimento. Per Hop2-Mnd1, il DNA intrappolato otticamente è stato tradotto nel flusso fluido adiacente contenente proteine e tampone ± ioni metallici bivalenti. L'uso di cellule a flusso a tre canali consente di intrappolare il DNA nel flusso 1, tradurre il DNA nel flusso 2 per consentire il legame proteico e quindi di flusso 3 dove è presente ATP, ad esempio, per avviare reazioni. Una variazione di quanto sopra è quella di utilizzare proteine marcate con fluorescenza nel canale 2, che si traduce in un flusso fluido completamente bianco e preclude la visualizzazione del DNA. Quando questa molecola viene tradotta nel flusso 3, sia le proteine che il DNA sono ora visibili quando vengono avviate le reazioni.
L'uso di valvole di commutazione a quattro vie per controllare il flusso del fluido è un componente critico del sistema per eliminare le bolle nelle celle di flusso. Le bolle sono dannose per il flusso stabile del fluido in quanto si contraggono e si espandono in modi imprevedibili con conseguenti rapidi cambiamenti nella velocità del flusso e l'introduzione di turbolenza. Quando le valvole sono posizionate tra siringhe e tubi di ingresso, il percorso del flusso viene scollegato cambiando la posizione della valvola quando le siringhe vengono sostituite. Quando la nuova siringa viene posizionata, lo stantuffo può essere premuto manualmente in modo che vengano espulsi >6 μL (il volume morto della valvola) e questo elimina quasi completamente le bolle.
Il collegamento di connettori alle celle di flusso è spesso la fase limitante nell'uso delle celle di flusso. Descriviamo l'uso di due tipi di connettori: rimovibili noti come press-fit e permanenti (assemblaggi nanoport). I connettori rimovibili sono semplici da aderire a una cella di flusso e diversi tipi di tubi flessibili oltre al PTFE consigliato possono essere testati con questi connettori. Questo è un modo rapido ed economico per testare tubi e connettori senza sacrificare celle di flusso in vetro più costose. Al contrario, i gruppi nanoport sono fissati in modo permanente, resistono a pressioni fino a 1.000 psi, e, nelle nostre mani, il loro uso è limitato a tubi in PEEK di diversi diametri. Questo non è uno svantaggio in quanto viene preferibilmente utilizzato il tubo PEEK. Una singola cella di flusso in vetro con assemblaggi permanenti collegati può essere riutilizzata per più di 1 anno con un uso attento.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>100x objective</td>
			<td>Leica</td>
			<td>506318 or 506038</td>
			<td>Oil immersion lenses; Imaging and optical trapping only; Plan APO objectives optimized for fluorescence imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X Objective</td>
			<td>Leica</td>
			<td>506263</td>
			<td>Used to locate laser beams spots during alignment; to find focus and X-Y position in flow cell</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mm fluorescent beads</td>
			<td>Bangs Labs</td>
			<td>FSDG004</td>
			<td>Used for tap performance, focal position determination</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mm polystyrene beads</td>
			<td>Bangs Labs</td>
			<td>CPO1004</td>
			<td>Used for trap performance evaluation and binding to biotinylated molecules</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>63x objective</td>
			<td>Leica</td>
			<td>506081</td>
			<td>Used to locate laser beams spots during alignment and to find focus and X-y position in flow cell; can be used for optical trapping as it has an identical back aperture diameter to the 100X; oil immersion lens</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alignment laser</td>
			<td>Lumentum</td>
			<td>1100 series</td>
			<td>10mW HeNe laser that is visible to the naked eye that is used to position optics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beam alignment camera</td>
			<td>Amscope</td>
			<td>MU303</td>
			<td>A simple, inexpensive and software controlled camera for imaging of the beam position</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera control and Image capture software</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>HCImage</td>
			<td>Coordinates activities of the Lambda DG4 with the camera to facilitate rapid wavelength switching</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera; Orca flash 4</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>c13440-20cu</td>
			<td>CCD camera for imaging of single-molecule experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C-mount for the beam alignment camera</td>
			<td>Spot imaging solutions</td>
			<td>DE50CMT</td>
			<td>Provides optimal positioning of the camera for imaging of laser beams during alignment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C-mount for the Orca Flash 4 camera</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Has a retainer ring to hold an IR blocking filter in place. This eliminates reflected IR beam from the optical traps and facilitates clearer imaging of trapped objects.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy5&#160; fluorescence filter cube</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>cy5-404a-lsc-zero</td>
			<td>Used in conjunction with Lambda DG4 to image Cy5 only</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fitc-Txred&#160; fluorescence filter cube</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>fitc/txred-2x-b-000</td>
			<td>Used in conjunction with Lambda DG4 to image FITC and TXRed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluidics tubing</td>
			<td>Grace Bio</td>
			<td>46004</td>
			<td>PTFE tubing as an alternate to PEEK; works well on some flow cells. Can be used with PDMS flow cells or glass flow cells when Grace Bio fit tubing connectors are used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP fluorescence filter cube</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>gfp-3035b-lsc-zero</td>
			<td>Used in conjunction with Lambda DG4 to image GFP only</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass flow cells</td>
			<td>Translume</td>
			<td>Custom</td>
			<td>Clear flow channels for imaging (Fig. 2E)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass glue</td>
			<td>Loctite</td>
			<td>233841</td>
			<td>Securely and easily bonds Nanoport assemblies to glass flow cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass/PDMS sandwich flow cells</td>
			<td>CIDRA Precision services</td>
			<td>Custom design</td>
			<td>Flow cells built according to your specifications; imaging channels are clear (Fig. 2C)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton Cleaning solution</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>18311</td>
			<td>Gentle but efficient cleaning solution for glass flow cells; does not bubble when used carefully</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Illumination system</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>Lamda DG4</td>
			<td>Discontinued so recommend Lambda 721</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Illumination system</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>Lamda DG4</td>
			<td>Discontinued so recommend Lambda 721</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image analysis software</td>
			<td>Media cybernetics</td>
			<td>Image Pro Premiere</td>
			<td>Analysis of images and single molecule tracking</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image analysis software</td>
			<td>Fiji/NIH Image/Image J</td>
			<td>Shareware</td>
			<td>Analysis of images and single molecule tracking</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image display card</td>
			<td>Melles Griot</td>
			<td>06 DLA 001</td>
			<td>Alternate product from Thorlabs: VRC5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immersion oil</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>444960</td>
			<td>Immersol 518 F fluorescence free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser beam alignment tools</td>
			<td>Thor labs</td>
			<td>FMP05/M; dgo5-1500-h1; BHM1&#160;</td>
			<td>Used to ensure beams are horizontal and at the correct height</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser beam viewer</td>
			<td>Canadian Photonics labs</td>
			<td>IR 3150</td>
			<td>Used to image IR beam spots on mirrors and&#160; targets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser power meter</td>
			<td>Thor labs</td>
			<td></td>
			<td>Measurement of laser output as well as trap strength</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser safety glasses (HeNe)</td>
			<td>Thor labs</td>
			<td>LG7 or 8</td>
			<td>Blocks &#62;3 OD units of light of wavelengths &#62;600 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser safety glasses (IR)</td>
			<td>Thor labs</td>
			<td>LG11</td>
			<td>Blocks &#62;7 OD units of light of wavelengths &#179;1000 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mcherry&#160; fluorescence filter cube</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>mcherry-a-lsc-zero</td>
			<td>Used in conjunction with Lambda DG4 to image mcherry only</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DMIRE2</td>
			<td>DIC port removed to accommodate Dichroic trapping/alignment mirror</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope control software&#160;</td>
			<td>UCSF/shareware</td>
			<td>uManager</td>
			<td>Controls the microscope, permits focal alignment of objectives as well as stage control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanoport assembly</td>
			<td>IDEX</td>
			<td>N333</td>
			<td>Connectors that are bonded to flow cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical table support</td>
			<td>Thor Labs</td>
			<td>PA52502</td>
			<td>Active isolation table support</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optics and lenses</td>
			<td>Solar TII</td>
			<td>Various</td>
			<td>Interference mirrors, telescopes and lenses custom designed for the system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDMS flow cells</td>
			<td>ufluidix</td>
			<td>Custom</td>
			<td>Flow cells built according to your specifications; imaging channels are clear (Figs. 2B and D)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEEK tubing</td>
			<td>IDEX</td>
			<td>1532</td>
			<td>Provides excellent connection to flow cells and switching valves</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pinkel fluorescence filter cube</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>lf488/543/635-3x-a-000</td>
			<td>Used in conjunction with Lambda DG4 to image multiple fluorophores rapidly</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Press fit tubing connectors</td>
			<td>GraceBio</td>
			<td>46003</td>
			<td>Clear silicone connector with adhesive that binds well to glass</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scanning mirrors</td>
			<td>GSI Lumonics</td>
			<td>VM500</td>
			<td>Used to provide control of the second optical trap. GSI Lumonics no longer exists. Similar mirrors can be purchased from Cambridge Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stage</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stage micrometer</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>68042-08</td>
			<td>Provides on screen ruler for positioning of the beam and system calibration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Switching valves</td>
			<td>IDEX</td>
			<td>V-101T</td>
			<td>Control direction of fluid flow and eliminate introduction of bubbles into flow cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe and valve manifold</td>
			<td>Machine shop</td>
			<td>None</td>
			<td>Custom built</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pump</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>PHD 2000</td>
			<td>Controls fluid flow through flow cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pump software</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>70-6000</td>
			<td>Flow control provides seamless, programmable control of fluid flow</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>81320</td>
			<td>Gas-tight, PTFE Luer Lock, glass barrels with Teflon-coated plungers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Table top</td>
			<td>Thor Labs</td>
			<td>T36H</td>
			<td>Optical table top or breadboard</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trapping laser</td>
			<td>Newport/Spectra Physics</td>
			<td>J-series; BL106C</td>
			<td>Nd:YAG laser; 1064 nm; 5W laser</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

use of dual optical tweezers and microfluidics for single-molecule studies

La biochimica visiva è una potente tecnica per osservare le proprietà stocastiche di singoli enzimi o complessi enzimatici che sono oscurati nella media che avviene negli studi in fase di massa. Per ottenere la visualizzazione, le pinzette ottiche doppie, in cui una trappola è fissa e l'altra è mobile, sono focalizzate in un canale di una camera microfluidica multi-flusso posizionata sul palco di un microscopio a fluorescenza invertita. Le pinzette ottiche intrappolano singole molecole di DNA marcato fluorescentmente e il fluido scorre attraverso la camera e oltre le perle intrappolate, allunga il DNA in forma B (sotto una forza minima, cioè 0 pN) con l'acido nucleico osservato come una stringa bianca su uno sfondo nero. Le molecole di DNA vengono spostate da un flusso all'altro, traslando lo stadio perpendicolarmente al flusso per consentire l'avvio delle reazioni in modo controllato. Per raggiungere il successo, i dispositivi microfluidici con canali otticamente trasparenti sono accoppiati a siringhe di vetro tenute in posizione in una pompa a siringa. I risultati ottimali utilizzano connettori legati in modo permanente alla cella di flusso, tubi meccanicamente rigidi e resistenti agli agenti chimici e collegati a valvole di commutazione che eliminano le bolle che impediscono il flusso laminare.

Il test iniziale dell'allineamento e della resistenza della trappola viene eseguito con perle di polistirene non fluorescente da 1 μm. Poiché la maggior parte della ricerca condotta in laboratorio utilizza la fluorescenza, testiamo ulteriormente la resistenza della trappola utilizzando perline di polistirene verde drago da 1 μm (Figura 1D, E). Successivamente il lavoro cambia l'intrappolamento ottico dei complessi DNA-perline in cui il DNA viene colorato con il colorante ...

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Use of Dual Optical Tweezers and Microfluidics for Single-Molecule Studies

La biochimica visiva a singola molecola studiata attraverso camere microfluidiche è notevolmente facilitata utilizzando barili di vetro, siringhe a tenuta di gas, connessioni stabili di tubi alle celle di flusso ed eliminazione delle bolle posizionando valvole di commutazione tra le siringhe e i tubi. Il protocollo descrive due trappole ottiche che consentono la visualizzazione delle transazioni del DNA e delle interazioni intermolecolari.

Uso di pinzette ottiche doppie e microfluidica per studi a singola molecola

Visual biochemistry is a powerful technique for observing the stochastic properties of single enzymes or enzyme complexes that are obscured in the ...

Il collegamento delle porte per accoppiarsi alle siringhe con tubi è fondamentale perché, quando è fatto bene, non ci sono perdite, non ci sono bolle nella cella di flusso e gli esperimenti possono essere eseguiti ripetutamente utilizzando la stessa cella di flusso per un periodo di un anno con un uso attento. Qui, verranno presentati due semplici metodi per collegare i connettori alle celle di flusso. Questi sono facili, sono riproducibili e consentono allo sperimentatore di adattare facilmente la cella di flusso alle proprie esigenze senza troppi problemi.L'uso di queste cellule a flusso è stato fatto pensando a esperimenti su singole molecole. In particolare, ciò che chiamiamo biochimica visiva, ma possono essere utilizzati in qualsiasi studio in cui è richiesta la microfluidica e in situazioni in cui deve essere utilizzato il flusso del fluido della lamina. Quindi, per evitare errori, invece di utilizzare preziose celle di flusso per stabilire le tecniche, suggerirei di esercitarsi prima su un vetrino o su un vetrino.Ciò consentirà di avere un'idea del vetro o dei materiali PDMS per sapere come gestirli e quanta forza applicare quando si inseriscono tubi o si incollano i connettori. Ciò richiederà il sacrificio di alcuni connettori, ma sono molto più economici delle celle di flusso. Iniziare posizionando la cella di flusso su una superficie piana pulita.Tenere il tubo in PTFE a tre millimetri dall'estremità libera con una pinza e spingere il tubo nella porta. Ripetere questa procedura per ciascuna delle porte rimanenti. Collegare le porte di ingresso alla pompa della siringa e l'uscita a una bottiglia di scarto.Riempire ogni siringa di vetro con un millilitro di metanolo spettrofotometrico e collegarli a una valvola di commutazione. Assicurarsi che la valvola abbia l'uscita diretta allo spreco e spurgare ogni linea con 50 microlitri di metanolo. Commutare la posizione di uscita sulla cella di flusso e pompare 800 microlitri di metanolo attraverso la cella di flusso a una portata di 100 microlitri all'ora per bagnare le superfici ed eliminare le bolle.Il giorno dopo, ripeti questo processo usando 800 microlitri di acqua ultrapura. La cella di flusso è ora pronta per l'uso. Se è necessario utilizzare connettori per tubi pressabili, rimuovere con cautela il nastro adesivo da un lato del connettore e posizionarlo sopra il foro nel vetrino del microscopio.Premere verso il basso per alcuni secondi. Ripetere il processo per i connettori rimanenti. Quindi posizionare la cella di flusso su una superficie piana e pulita.Tenere il tubo in PTFE a tre millimetri dall'estremità libera e spingere il tubo nel foro della porta. Ripetere questa procedura per ciascuna delle porte rimanenti. Collegare i tubi dagli ingressi alle valvole di commutazione.Posizionare l'accessorio su una superficie piana pulita o su un collettore personalizzato per mantenere la cella di flusso e i connettori in posizione durante l'incollaggio. Posizionare la cella di flusso sulla sezione incassata del collettore, quindi posizionare una piccola quantità di colla di vetro sul fondo del gruppo e inserire il sigillo. Posizionare la porta nano su uno dei fori di ingresso sul vetrino del microscopio.Spingere delicatamente verso il basso e tenere in posizione senza movimenti laterali. Ripetere il processo per le porte rimanenti. Lasciare asciugare o bloccare in posizione nel collettore.Rimuovere delicatamente la cella di flusso dal collettore e assicurarsi che gli assiemi siano ben allineati con le porte di ingresso nella cella di flusso. Posizionare una cella di flusso sul palco del microscopio e collegare il tubo utilizzando i connettori a tenuta di dito. Riempire ogni siringa di vetro con un millilitro di metanolo spettrofotometrico.Collegare ogni siringa a una valvola di commutazione. Assicurarsi che la valvola abbia l'uscita diretta allo spreco e spurgare ogni linea con 50 microlitri di metanolo. Commutare la posizione di uscita sulla cella di flusso e pompare 800 microlitri di metanolo attraverso la cella di flusso a una portata di 100 microlitri all'ora.Il giorno dopo, ripeti questo processo usando 800 microlitri di acqua ultrapura. La misurazione della potenza erogata è mostrata qui. La potenza erogata dal laser viene misurata prima di installare la testa laser nel layout ottico.Una volta terminato l'allineamento della trappola, la potenza del fascio viene misurata dopo l'obiettivo 100 x per ogni trappola. Le immagini dimostrano l'intrappolamento ottico stabile di perle fluorescenti di un micrometro. Qui F è una trappola fissa e M è una trappola mobile.Con la trappola mobile in modalità di scansione che si muove attraverso un cerchio piccolo o grande a 30 hertz. Il flusso del fluido all'interno della cella di flusso è laminare. Lo schema mostra la cella di flusso dall'alto per dimostrare che la diffusione intercanale è la principale fonte di miscelazione tra i flussi di fluido adiacenti.Le frecce blu indicano la direzione del flusso e i singoli flussi sono colorati, bianchi, grigio chiaro e bianchi. Le regioni di diffusione trasversale in allargamento tra i canali sono indicate in rosso. L'inserto mostra un'immagine a fluorescenza dei flussi fluidi adiacenti a 10 volte l'ingrandimento con complessi di perline di DNA marcati con fluorescenza nel flusso inferiore e tamponi solo nel flusso superiore.Le macchie bianche nel flusso superiore sono rumore ripreso dalla telecamera CCD. Il profilo di flusso e le celle a flusso laminare sono parabolici. La cella di flusso è vista lateralmente e la direzione del flusso è indicata sopra ogni cella.La velocità lineare del tallone è influenzata dalla velocità della pompa e dalla concentrazione di saccarosio. La forza opposta su un tallone è influenzata dalla viscosità della soluzione. Il diametro del tallone influenza la forza sulle perle sotto flusso.Quando si tenta questa procedura, assicurarsi che l'area in cui si sta lavorando sia pulita e di aver pulito le superfici di vetro con metanolo o acetone di grado spettrometrico. In questa fase, dovresti avere una cella di flusso che viene fatta alla tua pompa a siringa e ora sei pronto per introdurre le tue soluzioni e iniziare gli esperimenti di pinzetta ottica. L'uso di celle a flusso, che possono essere utilizzate per lunghi periodi di tempo, ha permesso ai ricercatori di studiare una varietà di reazioni a singola molecola in cui vengono misurate le forze, le reazioni vengono visualizzate mediante fluorescenza o una combinazione di entrambe.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

An Efficient Method for the Isolation of Highly Purified RNA from Seeds for Use in Quantitative Transcriptome Analysis

Un metodo efficace per l&#39;isolamento di RNA altamente purificato da semi per l&#39;utilizzo in Quantitative Analysis trascrittoma

Plant seeds accumulate large amounts of storage reserves comprising biodegradable organic matter. Humans rely on seed storage reserves for food and as ...

Ricerca

Biochimica

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FRET di alta precisione a singolo livello molecolare per la determinazione della struttura biomolecola

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Single-molecule Manipulation of G-quadruplexes by Magnetic Tweezers

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Proteome-wide Quantification of Labeling Homogeneity at the Single Molecule Level

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