Name: use of dual optical tweezers and microfluidics for single-molecule studies
Uploaded: 2022-11-18T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Use of Dual Optical Tweezers and Microfluidics for Single-Molecule Studies at JoVE.com

Forskning i Bianco-laboratoriet støttes av NIH-tilskudd GM100156 og GM144414 til PRB.

1. Laserfellejustering og testing med polystyrenperler
MERK: For oppsettet, se figur 1A,B.
FORSIKTIG: Eksperimentalisten bør bruke passende vernebriller eller lasersikkerhetsbriller under laserstrålejustering. Siden det optiske pinsettsystemet som er beskrevet her, bruker både HeNe- og IR-stråler, kreves det to separate sett med lasersikkerhetsglass.
<ol><li>HeNe Beam-justering<ol><li>Plasser alle...

<ol>
	<li>Bianco, P. R., Lu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+insight+into+stalled+replication+fork+rescue+in+Escherichia+coli.">Single-molecule insight into stalled replication fork rescue in Escherichia coli.</a> Nucleic Acids Research. 49 (8), 4220-4238 (2021).</li><li>Kaur, G., Lewis, J. S., van Oijen, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shining+a+spotlight+on+DNA:+Single-molecule+methods+to+visualise+DNA.">Shining a spotlight on DNA: Single-molecule methods to visualise DNA.</a> Molecules. 24 (3), 491 (2019).</li><li>Dame, R. T., Noom, M. C., Wuite, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+chromatin+organization+by+H-NS+protein+unravelled+using+dual+DNA+manipulation.">Bacterial chromatin organization by H-NS protein unravelled using dual DNA manipulation.</a> Nature. 444 (7117), 387-390 (2006).</li><li>Bianco, P. R., Bradfield, J. J., Castanza, L. R., Donnelly, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rad54+oligomers+translocate+and+cross-bridge+double-stranded+DNA+to+stimulate+synapsis.">Rad54 oligomers translocate and cross-bridge double-stranded DNA to stimulate synapsis.</a> Journal of Molecular Biology. 374 (3), 618-640 (2007).</li><li>Amitani, I., Liu, B., Dombrowski, C. C., Baskin, R. J., Kowalczykowski, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Watching+individual+proteins+acting+on+single+molecules+of+DNA.">Watching individual proteins acting on single molecules of DNA.</a> Methods in Enzymology. 472, 261-291 (2010).</li><li>Brewer, L. R., Bianco, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laminar+flow+cells+for+single-molecule+studies+of+DNA-protein+interactions.">Laminar flow cells for single-molecule studies of DNA-protein interactions.</a> Nature Methods. 5 (6), 517-525 (2008).</li><li>Visscher, K., Brakenhoff, G. J., Krol, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micromanipulation+by+multiple+optical+traps+created+by+a+single+fast+scanning+trap+integrated+with+the+bilateral+Confocal+scanning+laser+microscope.">Micromanipulation by multiple optical traps created by a single fast scanning trap integrated with the bilateral Confocal scanning laser microscope.</a> Cytometry. 14, 105-114 (1993).</li><li>Vermeulen, K. C., Mameren, J. v. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calibrating+bead+displacements+in+optical+tweezers+using+acousto-optic+deflectors.">Calibrating bead displacements in optical tweezers using acousto-optic deflectors.</a> Review of Scientific Instruments. 77 (1), 013704 (2006).</li><li>Dufresne, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computer-generated+holographic+optical+tweezers+arrays.">Computer-generated holographic optical tweezers arrays.</a> Review of Scientific Instruments. 72 (3), 1810 (2001).</li><li>Squires, T. M., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidics:+fluid+physics+at+the+nanoliter+scale.">Microfluidics: fluid physics at the nanoliter scale.</a> Reviews of Modern Physics. 77, 977-1026 (2005).</li><li>Weibel, D. B., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+microfluidics+in+chemical+biology.">Applications of microfluidics in chemical biology.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 10 (6), 584-591 (2006).</li><li>Tan, X., Mizuuchi, M., Mizuuchi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+transposition+target+immunity+and+the+determinants+of+the+MuB+distribution+patterns+on+DNA.">DNA transposition target immunity and the determinants of the MuB distribution patterns on DNA.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (35), 13925-13929 (2007).</li><li>Lima, R., Wada, S., Takeda, M., Tsubota, K., Yamaguchi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+confocal+micro-PIV+measurements+of+blood+flow+in+a+square+microchannel:+the+effect+of+the+haematocrit+on+instantaneous+velocity+profiles.">In vitro confocal micro-PIV measurements of blood flow in a square microchannel: the effect of the haematocrit on instantaneous velocity profiles.</a> Journal of Biomechanics. 40 (12), 2752-2757 (2007).</li><li>Bianco, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Processive+translocation+and+DNA+unwinding+by+individual+RecBCD+enzyme+molecules.">Processive translocation and DNA unwinding by individual RecBCD enzyme molecules.</a> Nature. 409 (6818), 374-378 (2001).</li><li>Forget, A. L., Dombrowski, C. C., Amitani, I., Kowalczykowski, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+protein-DNA+interactions+in+3D+using+in+situ+construction,+manipulation+and+visualization+of+individual+DNA+dumbbells+with+optical+traps,+microfluidics+and+fluorescence+microscopy.">Exploring protein-DNA interactions in 3D using in situ construction, manipulation and visualization of individual DNA dumbbells with optical traps, microfluidics and fluorescence microscopy.</a> Nature Protocol. 8 (3), 525-538 (2013).</li><li>Streets, A. M., Huang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidics+for+biological+measurements+with+single-molecule+resolution.">Microfluidics for biological measurements with single-molecule resolution.</a> Current Opinion in Biotechnology. 25, 69-77 (2014).</li><li>Madariaga-Marcos, J., Corti, R., Hormeno, S., Moreno-Herrero, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+microfluidic+approaches+for+a+fast+and+efficient+reagent+exchange+in+single-molecule+studies.">Characterizing microfluidic approaches for a fast and efficient reagent exchange in single-molecule studies.</a> Scientific Reports. 10 (1), 18069 (2020).</li><li>Grayson, P., Han, L., Winther, T., Phillips, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+observations+of+single+bacteriophage+lambda+DNA+ejections+in+vitro.">Real-time observations of single bacteriophage lambda DNA ejections in vitro.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (37), 14652-14657 (2007).</li><li>Luo, G., Wang, M., Konigsberg, W. H., Xie, X. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+and+ensemble+fluorescence+assays+for+a+functionally+important+conformational+change+in+T7+DNA+polymerase.">Single-molecule and ensemble fluorescence assays for a functionally important conformational change in T7 DNA polymerase.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (31), 12610-12615 (2007).</li><li>Sia, S. K., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+devices+fabricated+in+poly(dimethylsiloxane)+for+biological+studies.">Microfluidic devices fabricated in poly(dimethylsiloxane) for biological studies.</a> Electrophoresis. 24 (21), 3563-3576 (2003).</li><li>Wuite, G. J. L., Davenport, R. J., Rappaport, A., Bustamante, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+integrated+laser+trap/flow+control+video+microscope+for+the+study+of+single+biomolecules.">An integrated laser trap/flow control video microscope for the study of single biomolecules.</a> Biophysical Journal. 79 (2), 1155-1167 (2000).</li><li>Kim, S., Blainey, P. C., Schroeder, C. M., Xie, X. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+single-molecule+assay+for+enzymatic+activity+on+flow-stretched+DNA.">Multiplexed single-molecule assay for enzymatic activity on flow-stretched DNA.</a> Nature Methods. 4 (5), 397-399 (2007).</li><li>Tanaka, H., Ishijima, A., Honda, M., Saito, K., Yanagida, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orientation+dependence+of+displacements+by+a+single+one-headed+myosin+relative+to+the+actin+filament.">Orientation dependence of displacements by a single one-headed myosin relative to the actin filament.</a> Biophysical Journal. 75 (4), 1886-1894 (1998).</li><li>Merenda, F., Andrews, D. L., Galves, E. J., Nienhuis, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Refractive+multiple+optical+tweezers+for+parallel+biochemical+analysis+in+micro-fluidics.">Refractive multiple optical tweezers for parallel biochemical analysis in micro-fluidics.</a> Proceeding of SPIE. , 6483 (2007).</li><li>Brewer, L. R., Corzett, M., Balhorn, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protamine-induced+condensation+and+decondensation+of+the+same+DNA+molecule.">Protamine-induced condensation and decondensation of the same DNA molecule.</a> Science. 286 (5437), 120-123 (1999).</li><li>Ladoux, B., Quivy, J. P., Doyle, P. S., Almouzni, G., Viovy, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+imaging+of+single-molecules:+from+dynamics+of+a+single+DNA+chain+to+the+study+of+complex+DNA-protein+interactions.">Direct imaging of single-molecules: from dynamics of a single DNA chain to the study of complex DNA-protein interactions.</a> Science Progress. 84, 267-290 (2001).</li><li>Bianco, P. R., Bradfield, J. J., Castanza, L. R., Donnelly, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rad54+oligomers+translocate+and+cross-bridge+double-stranded+DNA+to+stimulate+synapsis.">Rad54 oligomers translocate and cross-bridge double-stranded DNA to stimulate synapsis.</a> Journal of Molecular Biology. 374 (3), 618-640 (2007).</li><li>Pezza, R. J., Camerini-Otero, R. D., Bianco, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hop2-Mnd1+condenses+DNA+to+stimulate+the+synapsis+phase+of+DNA+strand+exchange.">Hop2-Mnd1 condenses DNA to stimulate the synapsis phase of DNA strand exchange.</a> Biophysical Journal. 99 (11), 3763-3772 (2010).</li><li>Rye, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+fluorescent+complexes+of+double-stranded+DNA+with+bis-intercalating+asymmetric+cyanine+dyes:+properties+and+applications.">Stable fluorescent complexes of double-stranded DNA with bis-intercalating asymmetric cyanine dyes: properties and applications.</a> Nucleic Acids Research. 20 (11), 2803-2812 (1992).</li></ol>

Den forsiktige monteringen av strømningssystemet er avgjørende for det vellykkede resultatet av eksperimenter 4,6. En av de mest utfordrende aspektene ved protokollen er festing av kontakter til glassoverflaten. For dette bruker vi følgende to tilnærminger: press-fit fit slangekontakter og nanoport-enheter. Press-fit-kontakter fester seg lett til glass etterfulgt av å skyve PTFE-rør inn i de forhåndsformede hullene ved hjelp av tang. Når et mer stabilt ve...

Evnen til å visualisere protein-DNA-interaksjoner på enkeltmolekylnivå og i sanntid har gitt betydelig innsikt i genomstabilitet 1,2. I tillegg til å jobbe med enkeltmolekyler av DNA en om gangen, gir evnen til å se transaksjoner mellom individuelle molekyler i nærheten ytterligere innsikt 3,4,5. Manipulering av ytterligere DNA-molekyler krever både ekstra optiske feller samt høykvalitets, flerkanals, mikrofluidiske strømningsceller6.
Det finnes flere metoder tilgjengelig for å generere mer enn én optisk felle. Disse inkluderer galvanometerskanningsspeil, akustiske optiske modulatorer og diffraktiv optikk, som genererer holografisk optisk pinsett 4,7,8,9. Ofte produserer skannespeil og akustiske optiske modulatorer feller som timeshare. I oppsettet som er beskrevet her, er strålen til en enkelt Nd: YAG-laser delt på polarisasjon, og deretter kontrollerer galvanometer laserskanningsspeil posisjonen til det som kalles mobilfellen (figur 1) 4. For å lette plasseringen av speil og filtre for å lede fangststrålen til bakåpningen på mikroskopmålet, brukes en HeNe-laser. Dette gjør den generelle justeringen enklere ettersom HeNe-strålen er synlig for det blotte øye, mens infrarøde stråler ikke er det. HeNe-strålen er også tryggere å jobbe med, noe som gjør plasseringen av speil og andre komponenter mindre stressende. I utgangspunktet er strålebanen for denne laseren skilt fra 1064 nm-strålen, men blir introdusert i samme strålebane, og deretter inn i mikroskopmålet. Når fysisk justering er oppnådd, er posisjonering av 1064 nm strålen på toppen av HeNe-strålen gjort, og dette forenkles ved bruk av en infrarød seer og ulike strålebildeverktøy for å visualisere stråleposisjon og kvalitet. Deretter introduseres stråleutvidelsen, og den resulterende utvidede infrarøde strålen er justert på baksiden av målet. Til slutt fjernes målet og kraften i hver polarisert stråle måles og justeres ved hjelp av λ/2 bølgeplater for å være lik (figur 1C). Effektmålinger gjøres også når målet er returnert, og vanligvis er det et strømtap på 53%. Det er imidlertid tilstrekkelig kraft til å danne stabile faste og bevegelige optiske feller i fokalplanet (figur 1D).
For å avbilde DNA-transaksjoner spiller mikrofluidiske strømningsceller en nøkkelrolle da de tillater kontrollerte målinger på enkeltmolekylnivå med høy romlig og tidsmessig oppløsning (figur 2). Begrepet mikrofluidisk refererer til evnen til å manipulere væsker i en eller flere kanaler med dimensjoner fra 5-500 μm10,11. Begrepet strøm refererer til den faktiske væsken i en kanal, og kanalen refererer til den fysiske kanalen der en væskestrøm eller strømmer beveger seg. Enkanals strømningscelledesign har en felles, fysisk kanal hvor reaksjoner observeres, og det er vanligvis bare en væskestrøm tilstede. Dermed er disse designene kjent som single-stream flow celler. I motsetning til dette er flerstrømsstrømningsceller definert som en mikrofluidisk enhet der to eller flere inngangskanaler konvergerer til en enkelt, vanlig, fysisk kanal (figur 2A). Innenfor den felles kanalen strømmer væskestrømmene som stammer fra de enkelte kanalene parallelt med hverandre, og forblir separert med bare minimal blanding mellom dem som oppstår på grunn av diffusjon (figur 2B). I de fleste eksperimentelle oppsett skyver en enkelt pumpe væsker inn i hver kanal med samme hastighet. I kontrast, når grensestyring brukes, skyver tre eller flere, uavhengig kontrollerte pumper væsker gjennom kanalene. Imidlertid opererer hver pumpe med forskjellig hastighet, men nettostrømningshastigheten i den vanlige kanalen er konstant12. Dette tillater rask utveksling av hovedkanalkomponenter ganske enkelt ved å endre pumpehastigheten.
I tillegg til laminær strømning er en annen kritisk faktor den parabolske hastighetsprofilen i den laminære væskestrømmen. Den høyeste strømningshastigheten skjer midt i strømmen, og den tregeste oppstår ved siden av overflatene (figur 2C)13. Denne profilen må vurderes for å strekke et DNA-molekyl som er festet til en perle som holdes i strømmen for presis visualisering av fluorescerende DNA og nøyaktige enkeltmolekylanalyser. Her strekkes DNA-et til B-form og holdes på plass under 0 pN kraft. For å oppnå dette, bør fokusering av den optiske felleposisjonen være til en posisjon 10-20 μm fra bunndekselets overflate (figur 2D). Det må utvises forsiktighet slik at DNA-molekylet ikke strekkes utover B-form, da dette kan hemme enzymreaksjoner. Under typiske bufferforhold er 1 μm = 3000 bp DNA14. Videre, ved å fange 10-20 μm fra dekselet, er DNA-komplekset plassert langt fra overflaten og minimerer dermed overflateinteraksjoner.
Mange metoder har blitt brukt til å lage mikrofluidiske enhetskanaler, og disse kan gjøres i laboratoriet eller strømningsceller kan kjøpes fra kommersielle kilder 6,15,16,17. De optimale materialene som brukes til å konstruere strømningscellene, må være mekanisk stive, optisk gjennomsiktige med lav fluorescens og ugjennomtrengelige for organiske løsningsmidler6. Ofte brukes borosilikatfløteglass eller smeltet silika for å gi et stabilt strømningsmiljø i lengre tid som er egnet for optisk fangst, visualisering og kraftdeteksjon. Disse materialene tillater også bruk av ikke-vandige løsningsmidler (f.eks. metanol av spektrofotometrisk kvalitet) for å forenkle overflatefukting og fjerning av luftbobler, og denaturanter (f.eks. 6M guanidiniumhydroklorid) eller vaskemidler for å rengjøre strømningscellen. Til slutt varierer metodene som brukes til å introdusere væsker i strømningsceller fra komplekse vakuumpumpesystemer til enkeltsprøytepumper 14,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27. I tilnærmingen som er beskrevet her, brukes en sprøytepumpe med plass til opptil 10 sprøyter (figur 3A). Dette gir fleksibilitet til å bruke enkeltkanals flytceller eller flytceller med flere innløpskanaler. Her brukes en trekanals strømningscelle og pares med sprøyter som holdes på plass på sprøytepumpen ved hjelp av poly-eter-eter-keton (PEEK) -rør (figur 3A-C). Strømmen av væsker styres av fireveis koblingsventiler og tjener dermed til å minimere innføringen av bobler i strømningscellen (figur 3A, D). I tillegg anbefales Hamilton gasstette sprøyter som har stive glassvegger og polytetrafluoretylen (PTFE)-belagte stempler, da de gir eksepsjonelt jevn stempelbevegelse som er avgjørende for å oppnå en jevn flyt14,27.
I det eksperimentelle systemet som er beskrevet, har strømningsceller med to til fem innløpskanaler blitt brukt. Antall innløpskanaler dikteres av eksperimentet som gjøres. For studiet av RecBCD og Hop2-Mnd1 var to strømkanaler tilstrekkelig14,28. For helikasen ble enzymet bundet til den frie enden av DNA og oversatt til en strøm som inneholdt magnesium og ATP for å initiere translokasjon og avvikling. For Hop2-Mnd1 ble optisk fanget DNA oversatt til den tilstøtende væskestrømmen som inneholder proteiner og buffer ± divalente metallioner. Bruken av trekanals strømningsceller gjør det mulig å fange DNA i strøm 1, oversette DNA til strøm 2 for å tillate proteinbinding å forekomme, og deretter å streame 3 der ATP er tilstede, for eksempel for å initiere reaksjoner. En variant av ovenstående er å bruke fluorescerende merket protein i kanal 2, noe som resulterer i at væskestrømmen er helt hvit og utelukker visualisering av DNA. Når dette molekylet oversettes til strøm 3, er både proteiner og DNA nå synlige når reaksjoner initieres.
Bruken av fireveis koblingsventiler for å kontrollere væskestrømmen er en kritisk komponent i systemet for å eliminere bobler i strømningscellene. Bobler er skadelige for stabil væskestrøm når de trekker seg sammen og ekspanderer på uforutsigbare måter, noe som resulterer i raske endringer i strømningshastighet og innføring av turbulens. Når ventilene er plassert mellom sprøyter og innløpsrør, kobles strømningsbanen fra ved å bytte ventilposisjon når sprøyter skiftes ut. Når den nye sprøyten er satt på plass, kan stempelet trykkes ned manuelt slik at >6 μL kastes ut (ventilens dødvolum), og dette eliminerer bobler nesten helt.
Festing av kontakter til flytceller er ofte det hastighetsbegrensende trinnet i bruk av flytceller. Vi beskriver bruken av to typer kontakter: flyttbar kjent som press-fit og permanente (nanoport-enheter). De avtakbare kontaktene er enkle å feste til en flytcelle, og forskjellige typer fleksible rør i tillegg til den anbefalte PTFE kan testes med disse kontaktene. Dette er en rask og kostnadseffektiv måte å teste slanger og kontakter uten å ofre dyrere glassflytceller. I motsetning til dette er nanoportenheter festet permanent, tåler trykk opp til 1,000 psi, og i våre hender er bruken av dem begrenset til PEEK-rør med forskjellige diametre. Dette er ikke en ulempe da PEEK-slanger fortrinnsvis brukes. En enkelt glassflytcelle med permanente enheter festet kan gjenbrukes i mer enn 1 år med forsiktig bruk.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100x objective</td>
			<td>Leica</td>
			<td>506318 or 506038</td>
			<td>Oil immersion lenses; Imaging and optical trapping only; Plan APO objectives optimized for fluorescence imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X Objective</td>
			<td>Leica</td>
			<td>506263</td>
			<td>Used to locate laser beams spots during alignment; to find focus and X-Y position in flow cell</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mm fluorescent beads</td>
			<td>Bangs Labs</td>
			<td>FSDG004</td>
			<td>Used for tap performance, focal position determination</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mm polystyrene beads</td>
			<td>Bangs Labs</td>
			<td>CPO1004</td>
			<td>Used for trap performance evaluation and binding to biotinylated molecules</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>63x objective</td>
			<td>Leica</td>
			<td>506081</td>
			<td>Used to locate laser beams spots during alignment and to find focus and X-y position in flow cell; can be used for optical trapping as it has an identical back aperture diameter to the 100X; oil immersion lens</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alignment laser</td>
			<td>Lumentum</td>
			<td>1100 series</td>
			<td>10mW HeNe laser that is visible to the naked eye that is used to position optics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beam alignment camera</td>
			<td>Amscope</td>
			<td>MU303</td>
			<td>A simple, inexpensive and software controlled camera for imaging of the beam position</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera control and Image capture software</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>HCImage</td>
			<td>Coordinates activities of the Lambda DG4 with the camera to facilitate rapid wavelength switching</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera; Orca flash 4</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>c13440-20cu</td>
			<td>CCD camera for imaging of single-molecule experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C-mount for the beam alignment camera</td>
			<td>Spot imaging solutions</td>
			<td>DE50CMT</td>
			<td>Provides optimal positioning of the camera for imaging of laser beams during alignment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C-mount for the Orca Flash 4 camera</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Has a retainer ring to hold an IR blocking filter in place. This eliminates reflected IR beam from the optical traps and facilitates clearer imaging of trapped objects.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy5&#160; fluorescence filter cube</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>cy5-404a-lsc-zero</td>
			<td>Used in conjunction with Lambda DG4 to image Cy5 only</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fitc-Txred&#160; fluorescence filter cube</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>fitc/txred-2x-b-000</td>
			<td>Used in conjunction with Lambda DG4 to image FITC and TXRed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluidics tubing</td>
			<td>Grace Bio</td>
			<td>46004</td>
			<td>PTFE tubing as an alternate to PEEK; works well on some flow cells. Can be used with PDMS flow cells or glass flow cells when Grace Bio fit tubing connectors are used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP fluorescence filter cube</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>gfp-3035b-lsc-zero</td>
			<td>Used in conjunction with Lambda DG4 to image GFP only</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass flow cells</td>
			<td>Translume</td>
			<td>Custom</td>
			<td>Clear flow channels for imaging (Fig. 2E)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass glue</td>
			<td>Loctite</td>
			<td>233841</td>
			<td>Securely and easily bonds Nanoport assemblies to glass flow cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass/PDMS sandwich flow cells</td>
			<td>CIDRA Precision services</td>
			<td>Custom design</td>
			<td>Flow cells built according to your specifications; imaging channels are clear (Fig. 2C)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton Cleaning solution</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>18311</td>
			<td>Gentle but efficient cleaning solution for glass flow cells; does not bubble when used carefully</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Illumination system</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>Lamda DG4</td>
			<td>Discontinued so recommend Lambda 721</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Illumination system</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>Lamda DG4</td>
			<td>Discontinued so recommend Lambda 721</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image analysis software</td>
			<td>Media cybernetics</td>
			<td>Image Pro Premiere</td>
			<td>Analysis of images and single molecule tracking</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image analysis software</td>
			<td>Fiji/NIH Image/Image J</td>
			<td>Shareware</td>
			<td>Analysis of images and single molecule tracking</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image display card</td>
			<td>Melles Griot</td>
			<td>06 DLA 001</td>
			<td>Alternate product from Thorlabs: VRC5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immersion oil</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>444960</td>
			<td>Immersol 518 F fluorescence free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser beam alignment tools</td>
			<td>Thor labs</td>
			<td>FMP05/M; dgo5-1500-h1; BHM1&#160;</td>
			<td>Used to ensure beams are horizontal and at the correct height</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser beam viewer</td>
			<td>Canadian Photonics labs</td>
			<td>IR 3150</td>
			<td>Used to image IR beam spots on mirrors and&#160; targets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser power meter</td>
			<td>Thor labs</td>
			<td></td>
			<td>Measurement of laser output as well as trap strength</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser safety glasses (HeNe)</td>
			<td>Thor labs</td>
			<td>LG7 or 8</td>
			<td>Blocks &#62;3 OD units of light of wavelengths &#62;600 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser safety glasses (IR)</td>
			<td>Thor labs</td>
			<td>LG11</td>
			<td>Blocks &#62;7 OD units of light of wavelengths &#179;1000 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mcherry&#160; fluorescence filter cube</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>mcherry-a-lsc-zero</td>
			<td>Used in conjunction with Lambda DG4 to image mcherry only</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DMIRE2</td>
			<td>DIC port removed to accommodate Dichroic trapping/alignment mirror</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope control software&#160;</td>
			<td>UCSF/shareware</td>
			<td>uManager</td>
			<td>Controls the microscope, permits focal alignment of objectives as well as stage control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanoport assembly</td>
			<td>IDEX</td>
			<td>N333</td>
			<td>Connectors that are bonded to flow cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical table support</td>
			<td>Thor Labs</td>
			<td>PA52502</td>
			<td>Active isolation table support</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optics and lenses</td>
			<td>Solar TII</td>
			<td>Various</td>
			<td>Interference mirrors, telescopes and lenses custom designed for the system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDMS flow cells</td>
			<td>ufluidix</td>
			<td>Custom</td>
			<td>Flow cells built according to your specifications; imaging channels are clear (Figs. 2B and D)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEEK tubing</td>
			<td>IDEX</td>
			<td>1532</td>
			<td>Provides excellent connection to flow cells and switching valves</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pinkel fluorescence filter cube</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>lf488/543/635-3x-a-000</td>
			<td>Used in conjunction with Lambda DG4 to image multiple fluorophores rapidly</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Press fit tubing connectors</td>
			<td>GraceBio</td>
			<td>46003</td>
			<td>Clear silicone connector with adhesive that binds well to glass</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scanning mirrors</td>
			<td>GSI Lumonics</td>
			<td>VM500</td>
			<td>Used to provide control of the second optical trap. GSI Lumonics no longer exists. Similar mirrors can be purchased from Cambridge Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stage</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stage micrometer</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>68042-08</td>
			<td>Provides on screen ruler for positioning of the beam and system calibration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Switching valves</td>
			<td>IDEX</td>
			<td>V-101T</td>
			<td>Control direction of fluid flow and eliminate introduction of bubbles into flow cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe and valve manifold</td>
			<td>Machine shop</td>
			<td>None</td>
			<td>Custom built</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pump</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>PHD 2000</td>
			<td>Controls fluid flow through flow cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pump software</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>70-6000</td>
			<td>Flow control provides seamless, programmable control of fluid flow</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>81320</td>
			<td>Gas-tight, PTFE Luer Lock, glass barrels with Teflon-coated plungers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Table top</td>
			<td>Thor Labs</td>
			<td>T36H</td>
			<td>Optical table top or breadboard</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trapping laser</td>
			<td>Newport/Spectra Physics</td>
			<td>J-series; BL106C</td>
			<td>Nd:YAG laser; 1064 nm; 5W laser</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

use of dual optical tweezers and microfluidics for single-molecule studies

Visuell biokjemi er en kraftig teknikk for å observere de stokastiske egenskapene til enkeltenzymer eller enzymkomplekser som er skjult i gjennomsnittet som foregår i bulkfasestudier. For å oppnå visualisering er dobbel optisk pinsett, hvor en felle er festet og den andre er mobil, fokusert i en kanal av et multi-stream mikrofluidisk kammer plassert på scenen av et omvendt fluorescensmikroskop. Den optiske pinsetten fanger enkeltmolekyler av fluorescerende merket DNA og væskestrøm gjennom kammeret og forbi de fangede perlene, strekker DNA til B-form (under minimal kraft, dvs. 0 pN) med nukleinsyren observert som en hvit streng mot en svart bakgrunn. DNA-molekyler flyttes fra en strøm til den neste, ved å oversette scenen vinkelrett på strømmen for å muliggjøre initiering av reaksjoner på en kontrollert måte. For å oppnå suksess parres mikrofluidiske enheter med optisk klare kanaler til glasssprøyter som holdes på plass i en sprøytepumpe. Optimale resultater bruker kontakter permanent bundet til strømningscellen, rør som er mekanisk stive og kjemisk motstandsdyktige, og som er koblet til koblingsventiler som eliminerer bobler som forbyr laminær strømning.

Den første testingen av fellejusteringen og styrken gjøres med 1 μm, ikke-fluorescerende polystyrenperler. Siden det meste av forskningen som gjøres i laboratoriet bruker fluorescens, tester vi videre fellestyrke ved hjelp av 1 μm, Dragon green polystyrenperler (figur 1D, E). Deretter endres arbeidet til optisk fangst av DNA-perlekomplekser der DNA er farget med bis-interkalerende fargestoff YOYO-114,29. Når di...

Watch this Scientific Journal Video about Use of Dual Optical Tweezers and Microfluidics for Single-Molecule Studies at JoVE.com

Use of Dual Optical Tweezers and Microfluidics for Single-Molecule Studies

Visuell, enkeltmolekylær biokjemi studert gjennom mikrofluidiske kamre blir i stor grad tilrettelagt ved bruk av glassfat, gasstette sprøyter, stabile tilkoblinger av rør til strømningsceller og eliminering av bobler ved å plassere koblingsventiler mellom sprøyter og rør. Protokollen beskriver doble optiske feller som muliggjør visualisering av DNA-transaksjoner og intermolekylære interaksjoner.

Bruk av dobbel optisk pinsett og mikrofluidikk for enkeltmolekylstudier

Visual biochemistry is a powerful technique for observing the stochastic properties of single enzymes or enzyme complexes that are obscured in the ...

Festing av porter for å parre seg med sprøyter med rør er kritisk fordi når det gjøres riktig, er det ingen lekkasjer, det er ingen bobler i strømningscellen, og eksperimenter kan gjøres gjentatte ganger ved hjelp av samme strømningscelle over en periode på ett år med forsiktig bruk. Her vil to enkle metoder bli presentert for å feste kontaktene til flytceller. Disse er enkle, de er reproduserbare, og lar etterforskeren enkelt tilpasse flytcellen til deres behov uten for mye trøbbel.Bruken av disse strømningscellene ble gjort med enkeltmolekyleksperimenter i tankene. Spesielt det vi kaller visuell biokjemi, men de kan brukes i enhver studie der mikrofluidikk er nødvendig og i situasjoner der laminavæskestrøm skal brukes. Så, for å unngå feil, i stedet for å bruke verdifulle flytceller for å etablere teknikkene, vil jeg foreslå å øve på et glassglass eller en dekselslipp først.Dette vil gjøre det mulig for en å få en følelse av glasset eller PDMS-materialene for å vite hvordan man skal håndtere dem og hvor mye kraft som skal påføres når man setter inn slanger eller limer kontaktene. Dette vil kreve å ofre noen kontakter, men de er mye billigere enn flytcellene. Begynn med å plassere flytcellen på en ren, flat overflate.Hold PTFE-slangen tre millimeter fra den frie enden med tang og skyv slangen inn i porten. Gjenta denne fremgangsmåten for hver av de gjenværende portene. Koble innløpsportene til sprøytepumpen og utløpet til en avfallsflaske.Fyll hver glasssprøyte med en milliliter spektro fotometrisk, klasse metanol og fest dem til en koblingsventil. Sørg for at ventilen har utløpet rettet mot avfall og rens hver linje med 50 mikroliter metanol. Bytt utløpsposisjon til strømningscellen og pump 800 mikroliter metanol gjennom strømningscellen med en strømningshastighet på 100 mikroliter per time for å våte overflatene og eliminere bobler.Neste dag, gjenta denne prosessen ved å bruke 800 mikroliter ultrarent vann. Flytcellen er nå klar til bruk. Hvis press-fit slangekontakter skal brukes, fjern forsiktig tape fra den ene siden av kontakten og plasser den over hullet i mikroskopet lysbildet.Trykk ned i noen sekunder. Gjenta prosessen for de gjenværende kontaktene. Plasser deretter flytcellen på en ren, flat overflate.Hold PTFE-slangen tre millimeter fra den frie enden og skyv slangen inn i hullet i porten. Gjenta denne fremgangsmåten for hver av de gjenværende portene. Fest slangen fra innløpene til koblingsventilene.Plasser festet enten på en ren, flat overflate eller på en spesialbygd manifold for å holde flytcellen og kontaktene på plass mens limingen skjer. Plasser strømningscellen på den innfelte delen av manifolden, legg deretter en liten mengde glasslim på bunnen av forsamlingen og sett inn tetningen. Plasser nanoporten over et av inngangshullene på mikroskopglasset.Skyv forsiktig ned og hold på plass uten sideveis bevegelse. Gjenta prosessen for de gjenværende portene. La tørke eller klemme på plass i manifolden.Fjern flytcellen forsiktig fra manifolden og sørg for at enhetene stemmer godt overens med inngangsportene i flytcellen. Plasser en flytcelle på mikroskopstadiet og fest slangen ved hjelp av fingertette kontakter. Fyll hver glasssprøyte med en milliliter metanol av spektrofotometrisk kvalitet.Fest hver sprøyte til en koblingsventil. Sørg for at ventilen har utløpet rettet mot avfall og rens hver linje med 50 mikroliter metanol. Bytt utløpsposisjonen til strømningscellen og pump 800 mikroliter metanol gjennom strømningscellen med en strømningshastighet på 100 mikroliter per time.Neste dag, gjenta denne prosessen ved å bruke 800 mikroliter ultrarent vann. Måling av utgangseffekten vises her. Utgangseffekten fra laseren måles før laserhodet installeres i det optiske oppsettet.Når fellejusteringen er fullført, måles strålekraften etter 100 x målet for hver felle. Bildene viser stabil optisk fangst av en mikrometer fluorescerende perler. Her er F en fast felle, og M er en mobil felle.Med mobilfellen i skannemodus som beveger seg gjennom en liten eller stor sirkel ved 30 hertz. Væskestrømmen i strømningscellen er laminær. Skjemaet viser strømningscellen fra toppen for å demonstrere at interkanaldiffusjonen er hovedkilden til blanding mellom de tilstøtende væskestrømmene.Blå piler indikerer strømningsretningen og de enkelte strømmene er farget, hvite, lysegrå og hvite. De utvidede områdene av tverrgående diffusjon mellom kanaler er indikert i rødt. Innfellingen viser et fluorescensbilde av de tilstøtende væskestrømmene ved 10 ganger forstørrelse med fluorescerende merkede DNA-perlekomplekser i den nedre strømmen og buffere bare i den øvre strømmen.De hvite flekkene i den øvre strømmen er skuddstøy fra CCD-kameraet. Strømningsprofilen og laminære strømningsceller er parabolske. Strømningscellen ses fra siden og strømningsretningen er angitt over hver celle.Lineær dråpehastighet påvirkes av pumpehastighet og sukrosekonsentrasjon. Den motsatte kraften på en perle påvirkes av løsningsviskositeten. Perlediameter påvirker kraften på perler under strømning.Når du prøver denne prosedyren, må du sørge for at området du jobber i er rent og at du har rengjort glassflatene med spektrometrisk metanol eller aceton. På dette stadiet bør du ha en flytcelle som er laget til sprøytepumpen din, og du er nå klar til å introdusere løsningene dine og begynne optiske pinsetteksperimenter. Bruken av strømningsceller, som kan brukes i lengre perioder, har gjort det mulig for forskere å undersøke en rekke enkeltmolekylreaksjoner der enten krefter måles, reaksjoner visualiseres av fluorescens eller en kombinasjon av begge.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

An Efficient Method for the Isolation of Highly Purified RNA from Seeds for Use in Quantitative Transcriptome Analysis

En effektiv metode for Isolering av høyt renset RNA fra frø for bruk i Quantitative Analysis transcriptome

Plant seeds accumulate large amounts of storage reserves comprising biodegradable organic matter. Humans rely on seed storage reserves for food and as ...

High Precision FRET at Single-molecule Level for Biomolecule Structure Determination

Høy presisjon FRET ved enkeltmolekylivå for biomolekylstrukturbestemmelse

A protocol on how to perform high-precision interdye distance measurements using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) at the single-molecule ...

Single-molecule Manipulation of G-quadruplexes by Magnetic Tweezers

Single-molekylet manipulering av G-quadruplexes av magnetiske pinsett

Non-canonical nucleic acid secondary structure G-quadruplexes (G4) are involved in diverse cellular processes, such as DNA replication, transcription, RNA ...

Covalent Immobilization of Proteins for the Single Molecule Force Spectroscopy

Kovalente immobilisering av proteiner for ett molekyl Force spektroskopi

In recent years, atomic force microscopy (AFM) based single molecule force spectroscopy (SMFS) extended our understanding of molecular properties and ...

Proteome-wide Quantification of Labeling Homogeneity at the Single Molecule Level

Proteom hele kvantifisering av merking homogenitet på ett molekyl nivå

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a ...

Production of Dynein and Kinesin Motor Ensembles on DNA Origami Nanostructures for Single Molecule Observation

Produksjon av Dynein og Kinesin motor ensembler på DNA Origami nanostrukturer for single molekyl observasjon

Cytoskeletal motors are responsible for a wide variety of functions in eukaryotic cells, including mitosis, cargo transport, cellular motility, and ...

OaAEP1-Mediated Enzymatic Synthesis and Immobilization of Polymerized Protein for Single-Molecule Force Spectroscopy

OaAEP1-mediert enzymatisk syntese og immobilisering av polymerisert protein for enkeltmolekylet kraftspektroskopi

Chemical and bio-conjugation techniques have been developed rapidly in recent years and allow the building of protein polymers. However, a controlled ...

Conventional BODIPY Conjugates for Live-Cell Super-Resolution Microscopy and Single-Molecule Tracking

Konvensjonelle BODIPY-konjugater for live-cell superoppløsningsmikroskopi og enkeltmolekylsporing

Single molecule localization microscopy (SMLM) techniques overcome the optical diffraction limit of conventional fluorescence microscopy and can resolve ...

Single Cell Analysis Of Transcriptionally Active Alleles By Single Molecule FISH

Enkeltcelleanalyse av transkripsjonsaktive alleler av enkeltmolekyl fisk

Gene transcription is an essential process in cell biology, and allows cells to interpret and respond to internal and external cues. Traditional bulk ...

Making Precise and Accurate Single-Molecule FRET Measurements using the Open-Source smfBox

Foreta presise og nøyaktige FRET-målinger med ett molekyl ved hjelp av åpen kildekode-smfBox

The smfBox is a recently developed cost-effective, open-source instrument for single-molecule F&#246;rster Resonance Energy Transfer (smFRET), which makes ...