Name: use of dual optical tweezers and microfluidics for single-molecule studies
Uploaded: 2022-11-18T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Use of Dual Optical Tweezers and Microfluidics for Single-Molecule Studies at JoVE.com

A pesquisa no laboratório Bianco é apoiada pelas bolsas do NIH GM100156 e GM144414 para a RPB.

1. Alinhamento e teste da armadilha a laser com esferas de poliestireno
NOTA: Para a configuração, consulte a Figura 1A,B.
CUIDADO: O experimentalista deve usar óculos de proteção apropriados ou óculos de segurança a laser durante o alinhamento do feixe de laser. Como o sistema de pinça óptica descrito aqui usa feixes HeNe e IR, são necessários dois conjuntos separados de vidro de segurança a ...

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	<li>Bianco, P. R., Lu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+insight+into+stalled+replication+fork+rescue+in+Escherichia+coli.">Single-molecule insight into stalled replication fork rescue in Escherichia coli.</a> Nucleic Acids Research. 49 (8), 4220-4238 (2021).</li><li>Kaur, G., Lewis, J. S., van Oijen, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shining+a+spotlight+on+DNA:+Single-molecule+methods+to+visualise+DNA.">Shining a spotlight on DNA: Single-molecule methods to visualise DNA.</a> Molecules. 24 (3), 491 (2019).</li><li>Dame, R. T., Noom, M. C., Wuite, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+chromatin+organization+by+H-NS+protein+unravelled+using+dual+DNA+manipulation.">Bacterial chromatin organization by H-NS protein unravelled using dual DNA manipulation.</a> Nature. 444 (7117), 387-390 (2006).</li><li>Bianco, P. R., Bradfield, J. J., Castanza, L. R., Donnelly, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rad54+oligomers+translocate+and+cross-bridge+double-stranded+DNA+to+stimulate+synapsis.">Rad54 oligomers translocate and cross-bridge double-stranded DNA to stimulate synapsis.</a> Journal of Molecular Biology. 374 (3), 618-640 (2007).</li><li>Amitani, I., Liu, B., Dombrowski, C. C., Baskin, R. J., Kowalczykowski, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Watching+individual+proteins+acting+on+single+molecules+of+DNA.">Watching individual proteins acting on single molecules of DNA.</a> Methods in Enzymology. 472, 261-291 (2010).</li><li>Brewer, L. R., Bianco, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laminar+flow+cells+for+single-molecule+studies+of+DNA-protein+interactions.">Laminar flow cells for single-molecule studies of DNA-protein interactions.</a> Nature Methods. 5 (6), 517-525 (2008).</li><li>Visscher, K., Brakenhoff, G. J., Krol, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micromanipulation+by+multiple+optical+traps+created+by+a+single+fast+scanning+trap+integrated+with+the+bilateral+Confocal+scanning+laser+microscope.">Micromanipulation by multiple optical traps created by a single fast scanning trap integrated with the bilateral Confocal scanning laser microscope.</a> Cytometry. 14, 105-114 (1993).</li><li>Vermeulen, K. C., Mameren, J. v. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calibrating+bead+displacements+in+optical+tweezers+using+acousto-optic+deflectors.">Calibrating bead displacements in optical tweezers using acousto-optic deflectors.</a> Review of Scientific Instruments. 77 (1), 013704 (2006).</li><li>Dufresne, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computer-generated+holographic+optical+tweezers+arrays.">Computer-generated holographic optical tweezers arrays.</a> Review of Scientific Instruments. 72 (3), 1810 (2001).</li><li>Squires, T. M., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidics:+fluid+physics+at+the+nanoliter+scale.">Microfluidics: fluid physics at the nanoliter scale.</a> Reviews of Modern Physics. 77, 977-1026 (2005).</li><li>Weibel, D. B., Whitesides, G. 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R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Processive+translocation+and+DNA+unwinding+by+individual+RecBCD+enzyme+molecules.">Processive translocation and DNA unwinding by individual RecBCD enzyme molecules.</a> Nature. 409 (6818), 374-378 (2001).</li><li>Forget, A. L., Dombrowski, C. C., Amitani, I., Kowalczykowski, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+protein-DNA+interactions+in+3D+using+in+situ+construction,+manipulation+and+visualization+of+individual+DNA+dumbbells+with+optical+traps,+microfluidics+and+fluorescence+microscopy.">Exploring protein-DNA interactions in 3D using in situ construction, manipulation and visualization of individual DNA dumbbells with optical traps, microfluidics and fluorescence microscopy.</a> Nature Protocol. 8 (3), 525-538 (2013).</li><li>Streets, A. M., Huang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidics+for+biological+measurements+with+single-molecule+resolution.">Microfluidics for biological measurements with single-molecule resolution.</a> Current Opinion in Biotechnology. 25, 69-77 (2014).</li><li>Madariaga-Marcos, J., Corti, R., Hormeno, S., Moreno-Herrero, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+microfluidic+approaches+for+a+fast+and+efficient+reagent+exchange+in+single-molecule+studies.">Characterizing microfluidic approaches for a fast and efficient reagent exchange in single-molecule studies.</a> Scientific Reports. 10 (1), 18069 (2020).</li><li>Grayson, P., Han, L., Winther, T., Phillips, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+observations+of+single+bacteriophage+lambda+DNA+ejections+in+vitro.">Real-time observations of single bacteriophage lambda DNA ejections in vitro.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (37), 14652-14657 (2007).</li><li>Luo, G., Wang, M., Konigsberg, W. H., Xie, X. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+and+ensemble+fluorescence+assays+for+a+functionally+important+conformational+change+in+T7+DNA+polymerase.">Single-molecule and ensemble fluorescence assays for a functionally important conformational change in T7 DNA polymerase.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (31), 12610-12615 (2007).</li><li>Sia, S. K., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+devices+fabricated+in+poly(dimethylsiloxane)+for+biological+studies.">Microfluidic devices fabricated in poly(dimethylsiloxane) for biological studies.</a> Electrophoresis. 24 (21), 3563-3576 (2003).</li><li>Wuite, G. J. L., Davenport, R. J., Rappaport, A., Bustamante, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+integrated+laser+trap/flow+control+video+microscope+for+the+study+of+single+biomolecules.">An integrated laser trap/flow control video microscope for the study of single biomolecules.</a> Biophysical Journal. 79 (2), 1155-1167 (2000).</li><li>Kim, S., Blainey, P. C., Schroeder, C. M., Xie, X. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+single-molecule+assay+for+enzymatic+activity+on+flow-stretched+DNA.">Multiplexed single-molecule assay for enzymatic activity on flow-stretched DNA.</a> Nature Methods. 4 (5), 397-399 (2007).</li><li>Tanaka, H., Ishijima, A., Honda, M., Saito, K., Yanagida, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orientation+dependence+of+displacements+by+a+single+one-headed+myosin+relative+to+the+actin+filament.">Orientation dependence of displacements by a single one-headed myosin relative to the actin filament.</a> Biophysical Journal. 75 (4), 1886-1894 (1998).</li><li>Merenda, F., Andrews, D. L., Galves, E. J., Nienhuis, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Refractive+multiple+optical+tweezers+for+parallel+biochemical+analysis+in+micro-fluidics.">Refractive multiple optical tweezers for parallel biochemical analysis in micro-fluidics.</a> Proceeding of SPIE. , 6483 (2007).</li><li>Brewer, L. R., Corzett, M., Balhorn, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protamine-induced+condensation+and+decondensation+of+the+same+DNA+molecule.">Protamine-induced condensation and decondensation of the same DNA molecule.</a> Science. 286 (5437), 120-123 (1999).</li><li>Ladoux, B., Quivy, J. P., Doyle, P. S., Almouzni, G., Viovy, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+imaging+of+single-molecules:+from+dynamics+of+a+single+DNA+chain+to+the+study+of+complex+DNA-protein+interactions.">Direct imaging of single-molecules: from dynamics of a single DNA chain to the study of complex DNA-protein interactions.</a> Science Progress. 84, 267-290 (2001).</li><li>Bianco, P. R., Bradfield, J. J., Castanza, L. R., Donnelly, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rad54+oligomers+translocate+and+cross-bridge+double-stranded+DNA+to+stimulate+synapsis.">Rad54 oligomers translocate and cross-bridge double-stranded DNA to stimulate synapsis.</a> Journal of Molecular Biology. 374 (3), 618-640 (2007).</li><li>Pezza, R. J., Camerini-Otero, R. D., Bianco, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hop2-Mnd1+condenses+DNA+to+stimulate+the+synapsis+phase+of+DNA+strand+exchange.">Hop2-Mnd1 condenses DNA to stimulate the synapsis phase of DNA strand exchange.</a> Biophysical Journal. 99 (11), 3763-3772 (2010).</li><li>Rye, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+fluorescent+complexes+of+double-stranded+DNA+with+bis-intercalating+asymmetric+cyanine+dyes:+properties+and+applications.">Stable fluorescent complexes of double-stranded DNA with bis-intercalating asymmetric cyanine dyes: properties and applications.</a> Nucleic Acids Research. 20 (11), 2803-2812 (1992).</li></ol>

A montagem cuidadosa do sistema de fluxo é fundamental para o sucesso dos experimentos 4,6. Um dos aspectos mais desafiadores do protocolo é a fixação de conectores à superfície de vidro. Para isso, usamos as duas abordagens a seguir: conectores de tubulação de ajuste press-fit e conjuntos de nanoportas. Os conectores press-fit aderem facilmente ao vidro, seguidos pelo empurrão da tubulação de PTFE para os orifícios pré-formados usando pinças. Quand...

A capacidade de visualizar interações proteína-DNA no nível de molécula única e em tempo real forneceu uma visão significativa da estabilidade do genoma 1,2. Além de trabalhar com moléculas individuais de DNA, uma de cada vez, a capacidade de visualizar transações entre moléculas individuais próximas fornece informações adicionais 3,4,5. A manipulação de moléculas adicionais de DNA requer armadilhas ópticas adicionais, bem como células de fluxo microfluídico multicanal de alta qualidade6.
Existem vários métodos disponíveis para gerar mais de um trap óptico. Estes incluem espelhos de varredura de galvanômetros, moduladores ópticos acústicos e óptica difrativa, que geram pinças ópticas holográficas 4,7,8,9. Muitas vezes, espelhos de varredura e moduladores ópticos acústicos produzem armadilhas que compartilham o tempo. Na configuração descrita aqui, o feixe de um único laser Nd:YAG é dividido na polarização e, em seguida, os espelhos de varredura a laser galvanômetro controlam a posição do que é chamado de armadilha móvel (Figura 1)4. Para facilitar o posicionamento de espelhos e filtros para direcionar o feixe de retenção para a abertura traseira da objetiva do microscópio, um laser HeNe é usado. Isso facilita o alinhamento geral, pois o feixe HeNe é visível a olho nu, enquanto os feixes infravermelhos não são. O feixe HeNe também é mais seguro de trabalhar, tornando o posicionamento de espelhos e outros componentes menos estressante. Inicialmente, o caminho do feixe para este laser é separado do feixe de 1064 nm, mas é introduzido no mesmo caminho do feixe e, em seguida, na objetiva do microscópio. Uma vez que o alinhamento físico é alcançado, o posicionamento do feixe de 1064 nm no topo do feixe HeNe é feito e isso é facilitado pelo uso de um visualizador infravermelho e várias ferramentas de imagem do feixe para visualizar a posição e a qualidade do feixe. Em seguida, o expansor de feixe é introduzido e o feixe infravermelho expandido resultante é alinhado na abertura traseira do objetivo. Finalmente, a objetiva é removida e a potência em cada feixe polarizado é medida e ajustada usando placas de onda λ/2 para ser igual (Figura 1C). As medições de energia também são feitas uma vez que o objetivo é retornado e, normalmente, há uma perda de energia de 53%. Há, no entanto, energia suficiente para formar armadilhas ópticas fixas e móveis estáveis no plano focal (Figura 1D).
Para as transações de DNA de imagem, as células de fluxo microfluídico desempenham um papel fundamental, pois permitem medições controladas no nível de molécula única com alta resolução espacial e temporal (Figura 2). O termo microfluídico refere-se à capacidade de manipular fluidos em um ou mais canais com dimensões que variam de 5 a 500 μm10,11. O termo fluxo refere-se ao fluido real dentro de um canal e o canal refere-se ao canal físico no qual um fluxo ou fluxos de fluido se movem. O design de células de fluxo de canal único tem um canal físico comum onde as reações são observadas e normalmente há apenas um fluxo de fluido presente. Assim, esses projetos são conhecidos como células de fluxo único. Em contraste, as células de fluxo multifluxo são definidas como um dispositivo microfluídico no qual dois ou mais canais de entrada convergem em um único canal físico comum (Figura 2A). Dentro do canal comum, os fluxos de fluido que se originam dos canais individuais fluem paralelamente uns aos outros e permanecem separados com apenas uma mistura mínima entre eles ocorrendo devido à difusão (Figura 2B). Na maioria das configurações experimentais, uma única bomba empurra fluidos para cada canal na mesma velocidade. Em contraste, quando a direção de limite é usada, três ou mais bombas controladas independentemente empurram fluidos através dos canais. No entanto, cada bomba opera a uma velocidade diferente, mas a taxa de fluxo líquido no canal comum é constante12. Isso permite a troca rápida de componentes do canal principal simplesmente alterando a velocidade da bomba.
Além do fluxo laminar, outro fator crítico é o perfil de velocidade parabólica dentro do fluxo de fluido laminar. A maior velocidade de escoamento ocorre no meio do fluxo e a mais lenta ocorre junto às superfícies (Figura 2C)13. Este perfil deve ser considerado para esticar completamente uma molécula de DNA que está ligada a uma conta mantida no fluxo para visualização precisa do DNA fluorescente e análises precisas de molécula única. Aqui, o DNA é esticado para a forma B e é mantido no lugar sob 0 pN de força. Para conseguir isso, o foco da posição do purgador óptico deve estar a uma posição de 10-20 μm da superfície inferior da tampa (Figura 2D). Deve-se tomar cuidado para que a molécula de DNA não seja esticada além da forma B, pois isso pode inibir as reações enzimáticas. Sob condições típicas de tampão, 1 μm = 3.000 pb de DNA14. Além disso, ao prender 10-20 μm da lâmina de cobertura, o complexo de DNA é posicionado longe da superfície, minimizando assim as interações superficiais.
Muitos métodos têm sido utilizados para criar canais de dispositivos microfluídicos e estes podem ser feitos em laboratório ou células de fluxo podem ser adquiridas de fontes comerciais 6,15,16,17. Os materiais ideais utilizados para a construção das células de fluxo devem ser mecanicamente rígidos, opticamente transparentes com baixa fluorescência e impermeáveis a solventes orgânicos6. Frequentemente, o vidro float de borossilicato ou a sílica fundida são usados para fornecer um ambiente de fluxo estável por um tempo prolongado que é adequado para aprisionamento óptico, visualização e detecção de força. Esses materiais também permitem o uso de solventes não aquosos (por exemplo, metanol de grau espectrofotométrico) para simplificar a umectação da superfície e a remoção de bolhas de ar e desnaturantes (por exemplo, cloridrato de guanidínio 6M) ou detergentes para limpar a célula de fluxo. Finalmente, os métodos utilizados para introduzir fluidos em células de fluxo variam de sistemas complexos de bomba de vácuo a bombas de seringa única 14,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27. Na abordagem descrita aqui, é utilizada uma bomba de seringa que pode acomodar até 10 seringas (Figura 3A). Isso fornece flexibilidade para usar células de fluxo de canal único ou células de fluxo com vários canais de entrada. Aqui, uma célula de fluxo de três canais é usada e é acoplada a seringas mantidas no lugar na bomba da seringa usando tubos de poli-éter-éter-cetona (PEEK) (Figura 3A-C). O fluxo de fluidos é controlado por válvulas de comutação de quatro vias e, assim, servem para minimizar a introdução de bolhas na célula de fluxo (Figura 3A,D). Além disso, seringas à prova de gás Hamilton, que possuem paredes de vidro rígidas e êmbolos revestidos com politetrafluoroetileno (PTFE), são recomendadas, pois proporcionam um movimento de êmbolo excepcionalmente suave, essencial para a obtenção de um fluxo suave14,27.
No sistema experimental descrito, foram utilizadas células de fluxo com dois a cinco canais de entrada. O número de canais de entrada é ditado pelo experimento que está sendo feito. Para o estudo de RecBCD e Hop2-Mnd1, dois canais de fluxo foram suficientes14,28. Para a helicase, a enzima foi ligada à extremidade livre do DNA e traduzida em um fluxo contendo magnésio e ATP para iniciar a translocação e o desenrolar. Para Hop2-Mnd1, o DNA opticamente aprisionado foi traduzido para a corrente fluida adjacente contendo proteínas e tampão ± íons metálicos divalentes. O uso de células de fluxo de três canais permite prender o DNA no fluxo 1, traduzir o DNA no fluxo 2 para permitir que a ligação às proteínas ocorra e, em seguida, transmitir o fluxo 3 onde o ATP está presente, por exemplo, para iniciar reações. Uma variação do acima é usar proteína marcada com fluorescente no canal 2, o que resulta no fluxo de fluido sendo completamente branco e impede a visualização do DNA. Quando esta molécula é traduzida em fluxo 3, tanto as proteínas quanto o DNA são agora visíveis quando as reações são iniciadas.
O uso de válvulas de comutação de quatro vias para controlar o fluxo de fluido é um componente crítico do sistema para eliminar bolhas nas células de fluxo. As bolhas são prejudiciais ao fluxo estável de fluidos à medida que se contraem e se expandem de maneiras imprevisíveis, resultando em mudanças rápidas na velocidade do fluxo e na introdução de turbulência. Quando as válvulas são posicionadas entre as seringas e a tubulação de entrada, o caminho do fluxo é desconectado alternando a posição da válvula quando as seringas são trocadas. Quando a nova seringa é colocada no lugar, o êmbolo pode ser pressionado manualmente para que >6 μL seja ejetado (o volume morto da válvula) e isso elimina as bolhas quase inteiramente.
A fixação de conectores a células de fluxo é frequentemente a etapa de limitação de taxa no uso de células de fluxo. Descrevemos o uso de dois tipos de conectores: removíveis conhecidos como press-fit e permanentes (conjuntos de nanoportas). Os conectores removíveis são simples de aderir a uma célula de fluxo e diferentes tipos de tubos flexíveis, além do PTFE recomendado, podem ser testados com esses conectores. Esta é uma maneira rápida e econômica de testar tubos e conectores sem sacrificar células de fluxo de vidro mais caras. Em contraste, os conjuntos de nanoportas são fixados permanentemente, suportam pressões de até 1.000 psi e, em nossas mãos, seu uso é restrito a tubos PEEK de diferentes diâmetros. Isso não é uma desvantagem, pois a tubulação PEEK é preferencialmente usada. Uma única célula de fluxo de vidro com conjuntos permanentes anexados pode ser reutilizada por mais de 1 ano com uso cuidadoso.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>100x objective</td>
			<td>Leica</td>
			<td>506318 or 506038</td>
			<td>Oil immersion lenses; Imaging and optical trapping only; Plan APO objectives optimized for fluorescence imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X Objective</td>
			<td>Leica</td>
			<td>506263</td>
			<td>Used to locate laser beams spots during alignment; to find focus and X-Y position in flow cell</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mm fluorescent beads</td>
			<td>Bangs Labs</td>
			<td>FSDG004</td>
			<td>Used for tap performance, focal position determination</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mm polystyrene beads</td>
			<td>Bangs Labs</td>
			<td>CPO1004</td>
			<td>Used for trap performance evaluation and binding to biotinylated molecules</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>63x objective</td>
			<td>Leica</td>
			<td>506081</td>
			<td>Used to locate laser beams spots during alignment and to find focus and X-y position in flow cell; can be used for optical trapping as it has an identical back aperture diameter to the 100X; oil immersion lens</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alignment laser</td>
			<td>Lumentum</td>
			<td>1100 series</td>
			<td>10mW HeNe laser that is visible to the naked eye that is used to position optics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beam alignment camera</td>
			<td>Amscope</td>
			<td>MU303</td>
			<td>A simple, inexpensive and software controlled camera for imaging of the beam position</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera control and Image capture software</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>HCImage</td>
			<td>Coordinates activities of the Lambda DG4 with the camera to facilitate rapid wavelength switching</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera; Orca flash 4</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>c13440-20cu</td>
			<td>CCD camera for imaging of single-molecule experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C-mount for the beam alignment camera</td>
			<td>Spot imaging solutions</td>
			<td>DE50CMT</td>
			<td>Provides optimal positioning of the camera for imaging of laser beams during alignment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C-mount for the Orca Flash 4 camera</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Has a retainer ring to hold an IR blocking filter in place. This eliminates reflected IR beam from the optical traps and facilitates clearer imaging of trapped objects.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy5&#160; fluorescence filter cube</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>cy5-404a-lsc-zero</td>
			<td>Used in conjunction with Lambda DG4 to image Cy5 only</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fitc-Txred&#160; fluorescence filter cube</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>fitc/txred-2x-b-000</td>
			<td>Used in conjunction with Lambda DG4 to image FITC and TXRed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluidics tubing</td>
			<td>Grace Bio</td>
			<td>46004</td>
			<td>PTFE tubing as an alternate to PEEK; works well on some flow cells. Can be used with PDMS flow cells or glass flow cells when Grace Bio fit tubing connectors are used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP fluorescence filter cube</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>gfp-3035b-lsc-zero</td>
			<td>Used in conjunction with Lambda DG4 to image GFP only</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass flow cells</td>
			<td>Translume</td>
			<td>Custom</td>
			<td>Clear flow channels for imaging (Fig. 2E)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass glue</td>
			<td>Loctite</td>
			<td>233841</td>
			<td>Securely and easily bonds Nanoport assemblies to glass flow cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass/PDMS sandwich flow cells</td>
			<td>CIDRA Precision services</td>
			<td>Custom design</td>
			<td>Flow cells built according to your specifications; imaging channels are clear (Fig. 2C)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton Cleaning solution</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>18311</td>
			<td>Gentle but efficient cleaning solution for glass flow cells; does not bubble when used carefully</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Illumination system</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>Lamda DG4</td>
			<td>Discontinued so recommend Lambda 721</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Illumination system</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>Lamda DG4</td>
			<td>Discontinued so recommend Lambda 721</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image analysis software</td>
			<td>Media cybernetics</td>
			<td>Image Pro Premiere</td>
			<td>Analysis of images and single molecule tracking</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image analysis software</td>
			<td>Fiji/NIH Image/Image J</td>
			<td>Shareware</td>
			<td>Analysis of images and single molecule tracking</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image display card</td>
			<td>Melles Griot</td>
			<td>06 DLA 001</td>
			<td>Alternate product from Thorlabs: VRC5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immersion oil</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>444960</td>
			<td>Immersol 518 F fluorescence free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser beam alignment tools</td>
			<td>Thor labs</td>
			<td>FMP05/M; dgo5-1500-h1; BHM1&#160;</td>
			<td>Used to ensure beams are horizontal and at the correct height</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser beam viewer</td>
			<td>Canadian Photonics labs</td>
			<td>IR 3150</td>
			<td>Used to image IR beam spots on mirrors and&#160; targets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser power meter</td>
			<td>Thor labs</td>
			<td></td>
			<td>Measurement of laser output as well as trap strength</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser safety glasses (HeNe)</td>
			<td>Thor labs</td>
			<td>LG7 or 8</td>
			<td>Blocks &#62;3 OD units of light of wavelengths &#62;600 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser safety glasses (IR)</td>
			<td>Thor labs</td>
			<td>LG11</td>
			<td>Blocks &#62;7 OD units of light of wavelengths &#179;1000 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mcherry&#160; fluorescence filter cube</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>mcherry-a-lsc-zero</td>
			<td>Used in conjunction with Lambda DG4 to image mcherry only</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DMIRE2</td>
			<td>DIC port removed to accommodate Dichroic trapping/alignment mirror</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope control software&#160;</td>
			<td>UCSF/shareware</td>
			<td>uManager</td>
			<td>Controls the microscope, permits focal alignment of objectives as well as stage control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanoport assembly</td>
			<td>IDEX</td>
			<td>N333</td>
			<td>Connectors that are bonded to flow cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical table support</td>
			<td>Thor Labs</td>
			<td>PA52502</td>
			<td>Active isolation table support</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optics and lenses</td>
			<td>Solar TII</td>
			<td>Various</td>
			<td>Interference mirrors, telescopes and lenses custom designed for the system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDMS flow cells</td>
			<td>ufluidix</td>
			<td>Custom</td>
			<td>Flow cells built according to your specifications; imaging channels are clear (Figs. 2B and D)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEEK tubing</td>
			<td>IDEX</td>
			<td>1532</td>
			<td>Provides excellent connection to flow cells and switching valves</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pinkel fluorescence filter cube</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>lf488/543/635-3x-a-000</td>
			<td>Used in conjunction with Lambda DG4 to image multiple fluorophores rapidly</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Press fit tubing connectors</td>
			<td>GraceBio</td>
			<td>46003</td>
			<td>Clear silicone connector with adhesive that binds well to glass</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scanning mirrors</td>
			<td>GSI Lumonics</td>
			<td>VM500</td>
			<td>Used to provide control of the second optical trap. GSI Lumonics no longer exists. Similar mirrors can be purchased from Cambridge Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stage</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stage micrometer</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>68042-08</td>
			<td>Provides on screen ruler for positioning of the beam and system calibration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Switching valves</td>
			<td>IDEX</td>
			<td>V-101T</td>
			<td>Control direction of fluid flow and eliminate introduction of bubbles into flow cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe and valve manifold</td>
			<td>Machine shop</td>
			<td>None</td>
			<td>Custom built</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pump</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>PHD 2000</td>
			<td>Controls fluid flow through flow cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pump software</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>70-6000</td>
			<td>Flow control provides seamless, programmable control of fluid flow</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>81320</td>
			<td>Gas-tight, PTFE Luer Lock, glass barrels with Teflon-coated plungers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Table top</td>
			<td>Thor Labs</td>
			<td>T36H</td>
			<td>Optical table top or breadboard</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trapping laser</td>
			<td>Newport/Spectra Physics</td>
			<td>J-series; BL106C</td>
			<td>Nd:YAG laser; 1064 nm; 5W laser</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

use of dual optical tweezers and microfluidics for single-molecule studies

A bioquímica visual é uma técnica poderosa para observar as propriedades estocásticas de enzimas individuais ou complexos enzimáticos que são obscurecidos na média que ocorre em estudos de fase a granel. Para alcançar a visualização, pinças ópticas duplas, onde uma armadilha é fixada e a outra é móvel, são focadas em um canal de uma câmara microfluídica multifluxo posicionada no estágio de um microscópio de fluorescência invertida. As pinças ópticas aprisionam moléculas únicas de DNA marcado fluorescentemente e fluem através da câmara e passam pelas contas aprisionadas, esticam o DNA para a forma B (sob força mínima, ou seja, 0 pN) com o ácido nucleico sendo observado como uma corda branca contra um fundo preto. As moléculas de DNA são movidas de um fluxo para o outro, traduzindo o estágio perpendicular ao fluxo para permitir o início das reações de maneira controlada. Para alcançar o sucesso, os dispositivos microfluídicos com canais opticamente claros são acoplados a seringas de vidro mantidas no lugar em uma bomba de seringa. Os melhores resultados usam conectores permanentemente ligados à célula de fluxo, tubulação que é mecanicamente rígida e quimicamente resistente, e que é conectada a válvulas de comutação que eliminam bolhas que proíbem o fluxo laminar.

O teste inicial do alinhamento e resistência do purgador é feito com 1 μm, esferas de poliestireno não fluorescentes. Como a maioria das pesquisas feitas em laboratório usa fluorescência, testamos ainda mais a resistência da armadilha usando 1 μm, esferas de poliestireno verde Dragon (Figura 1D,E). Posteriormente, o trabalho muda para o aprisionamento óptico de complexos DNA-grânulos onde o DNA é corado com o corante bis-intercalante YOYO-114,29<...

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Use of Dual Optical Tweezers and Microfluidics for Single-Molecule Studies

A bioquímica visual de molécula única estudada através de câmaras microfluídicas é muito facilitada usando barril de vidro, seringas à prova de gás, conexões estáveis de tubos para células de fluxo e eliminação de bolhas colocando válvulas de comutação entre as seringas e a tubulação. O protocolo descreve armadilhas ópticas duplas que permitem a visualização de transações de DNA e interações intermoleculares.

Uso de pinças ópticas duplas e microfluídicas para estudos de molécula única

Visual biochemistry is a powerful technique for observing the stochastic properties of single enzymes or enzyme complexes that are obscured in the ...

A fixação de portas para acasalar em seringas com tubulação é crítica porque, quando é feita corretamente, não há vazamentos, não há bolhas na célula de fluxo e os experimentos podem ser feitos repetidamente usando a mesma célula de fluxo durante um período de um ano com uso cuidadoso. Aqui, dois métodos simples serão apresentados para anexar os conectores às células de fluxo. Estes são fáceis, são reprodutíveis e permitem que o investigador adapte facilmente a célula de fluxo às suas necessidades sem muitos problemas.O uso dessas células de fluxo foi feito com experimentos de molécula única em mente. Em particular, o que chamamos de bioquímica visual, mas eles podem ser usados em qualquer estudo onde a microfluídica é necessária e em situações em que o fluxo de fluido laminal deve ser usado. Então, para evitar erros, em vez de usar células de fluxo valiosas para estabelecer as técnicas, sugiro praticar em uma lâmina de vidro ou uma folha de cobertura primeiro.Isso permitirá que se tenha uma ideia do vidro ou dos materiais PDMS para saber como manuseá-los e quanta força aplicar ao inserir tubos ou unir os conectores. Isso exigirá o sacrifício de alguns conectores, mas eles são muito mais baratos do que as células de fluxo. Comece colocando a célula de fluxo em uma superfície plana e limpa.Segure a tubulação de PTFE a três milímetros da extremidade livre com pinça e empurre a tubulação para a porta. Repita este procedimento para cada uma das portas restantes. Ligue as portas de entrada à bomba da seringa e a saída a um frasco de resíduos.Encha cada seringa de vidro com um mililitro de espectrofotométrico, metanol de grau e fixe-os a uma válvula de comutação. Certifique-se de que a válvula tenha a saída direcionada para o desperdício e limpe cada linha com 50 microlitros de metanol. Mude a posição de saída para a célula de fluxo e bombeie 800 microlitros de metanol através da célula de fluxo a uma taxa de fluxo de 100 microlitros por hora para molhar as superfícies e eliminar bolhas.No dia seguinte, repita este processo usando 800 microlitros de água ultrapura. A célula de fluxo agora está pronta para uso. Se os conectores de tubulação press-fit forem usados, remova cuidadosamente a fita adesiva de um lado do conector e coloque-a sobre o orifício na lâmina do microscópio.Pressione para baixo por alguns segundos. Repita o processo para os conectores restantes. Em seguida, coloque a célula de fluxo em uma superfície plana limpa.Segure a tubulação de PTFE a três milímetros da extremidade livre e empurre a tubulação para o orifício na porta. Repita este procedimento para cada uma das portas restantes. Fixe a tubulação das entradas às válvulas de comutação.Coloque o acessório em uma superfície limpa e plana ou em um coletor personalizado para manter a célula de fluxo e os conectores no lugar enquanto a ligação ocorre. Coloque a célula de fluxo na seção embutida do coletor e, em seguida, coloque uma pequena quantidade de cola de vidro na parte inferior do conjunto e insira o selo. Posicione a porta nano sobre um dos orifícios de entrada na lâmina do microscópio.Empurre suavemente para baixo e segure no lugar sem movimento lateral. Repita o processo para as portas restantes. Deixe secar ou prender no lugar no coletor.Remova cuidadosamente a célula de fluxo do coletor e certifique-se de que os conjuntos se alinhem bem com as portas de entrada na célula de fluxo. Coloque uma célula de fluxo no estágio do microscópio e prenda a tubulação usando os conectores apertados pelos dedos. Encha cada seringa de vidro com um mililitro de metanol espectrofotométrico.Ligue cada seringa a uma válvula de comutação. Certifique-se de que a válvula tenha a saída direcionada para o desperdício e limpe cada linha com 50 microlitros de metanol. Mude a posição de saída para a célula de fluxo e bombeie 800 microlitros de metanol através da célula de fluxo a uma taxa de fluxo de 100 microlitros por hora.No dia seguinte, repita este processo usando 800 microlitros de água ultrapura. A medição da potência de saída é mostrada aqui. A potência de saída do laser é medida antes de instalar a cabeça do laser no layout óptico.Uma vez que o alinhamento do purgador é feito, a potência do feixe é medida após a objetiva de 100 x para cada purgador. As imagens demonstram o aprisionamento óptico estável de contas fluorescentes de um micrômetro. Aqui F é uma armadilha fixa, e M é uma armadilha móvel.Com a armadilha móvel no modo de digitalização movendo-se através de um círculo pequeno ou grande a 30 hertz. O fluxo de fluido dentro da célula de fluxo é laminar. O esquema mostra a célula de fluxo do topo para demonstrar que a difusão entre canais é a principal fonte de mistura entre os fluxos de fluido adjacentes.As setas azuis indicam a direção do fluxo e os fluxos individuais são coloridos, brancos, cinza claro e branco. As regiões de alargamento da difusão transversal entre os canais são indicadas em vermelho. A inserção mostra uma imagem de fluorescência dos fluxos de fluido adjacentes a 10 vezes a ampliação com complexos de esferas de DNA marcados fluorescentes no fluxo inferior e buffers apenas no fluxo superior.As manchas brancas no fluxo superior são disparadas a partir do ruído da câmera CCD. O perfil de fluxo e as células de fluxo laminar são parabólicos. A célula de fluxo é vista de lado e a direção do fluxo é indicada acima de cada célula.A velocidade linear do grânulo é afetada pela velocidade da bomba e pela concentração de sacarose. A força oposta em um grânulo é afetada pela viscosidade da solução. O diâmetro do grânulo influencia a força sobre os grânulos sob fluxo.Ao tentar este procedimento, certifique-se de que a área em que você está trabalhando está limpa e que você limpou as superfícies de vidro com metanol de grau espectrométrico ou acetona. Nesta fase, você deve ter uma célula de fluxo que é feita para a sua bomba de seringa e agora você está pronto para apresentar suas soluções e iniciar experimentos de pinça óptica. O uso de células de fluxo, que podem ser usadas por longos períodos de tempo, permitiu que os pesquisadores investigassem uma variedade de reações de molécula única, onde as forças são medidas, as reações são visualizadas por fluorescência ou uma combinação de ambas.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

An Efficient Method for the Isolation of Highly Purified RNA from Seeds for Use in Quantitative Transcriptome Analysis

Um método eficiente para o isolamento de ARN altamente purificada a partir de sementes para Utilização em Análise Quantitativa do transcriptoma

Plant seeds accumulate large amounts of storage reserves comprising biodegradable organic matter. Humans rely on seed storage reserves for food and as ...

Bioquímica

High Precision FRET at Single-molecule Level for Biomolecule Structure Determination

FRET de alta precisão em nível de molécula única para determinação de estrutura de biomoléculas

A protocol on how to perform high-precision interdye distance measurements using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) at the single-molecule ...

Single-molecule Manipulation of G-quadruplexes by Magnetic Tweezers

Manipulação de único-molécula de G-quadruplexes por pinça magnética

Non-canonical nucleic acid secondary structure G-quadruplexes (G4) are involved in diverse cellular processes, such as DNA replication, transcription, RNA ...

Covalent Immobilization of Proteins for the Single Molecule Force Spectroscopy

Imobilização covalente de proteínas para a espectroscopia de força única molécula

In recent years, atomic force microscopy (AFM) based single molecule force spectroscopy (SMFS) extended our understanding of molecular properties and ...

Proteome-wide Quantification of Labeling Homogeneity at the Single Molecule Level

Quantificação de Proteome-largo de rotulagem homogeneidade a nível da molécula

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a ...

Production of Dynein and Kinesin Motor Ensembles on DNA Origami Nanostructures for Single Molecule Observation

Produção de conjuntos de motor de dynein e de Kinesin em nanostructures do ADN origami para a única observação da molécula

Cytoskeletal motors are responsible for a wide variety of functions in eukaryotic cells, including mitosis, cargo transport, cellular motility, and ...

OaAEP1-Mediated Enzymatic Synthesis and Immobilization of Polymerized Protein for Single-Molecule Force Spectroscopy

Síntese Enzimática Mediada oOAEP1 e Imobilização de Proteína Polimerizada para Espectroscopia de Força De Molécula Única

Chemical and bio-conjugation techniques have been developed rapidly in recent years and allow the building of protein polymers. However, a controlled ...

Conventional BODIPY Conjugates for Live-Cell Super-Resolution Microscopy and Single-Molecule Tracking

Conjugados BODIPY convencionais para microscopia de super-resolução de células vivas e rastreamento de moléculas únicas

Single molecule localization microscopy (SMLM) techniques overcome the optical diffraction limit of conventional fluorescence microscopy and can resolve ...

Single Cell Analysis Of Transcriptionally Active Alleles By Single Molecule FISH

Análise celular única de alelos ativos transcricionralmente por peixe de molécula única

Gene transcription is an essential process in cell biology, and allows cells to interpret and respond to internal and external cues. Traditional bulk ...

Making Precise and Accurate Single-Molecule FRET Measurements using the Open-Source smfBox

Fazendo medições de FRET de molécula única precisas e precisas usando o smfBox de código aberto

The smfBox is a recently developed cost-effective, open-source instrument for single-molecule F&#246;rster Resonance Energy Transfer (smFRET), which makes ...