Name: use of dual optical tweezers and microfluidics for single-molecule studies
Uploaded: 2022-11-18T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Use of Dual Optical Tweezers and Microfluidics for Single-Molecule Studies at JoVE.com

Forskning i Bianco-laboratoriet stöds av NIH-bidrag GM100156 och GM144414 till P.R.B.

1. Laserfällans inriktning och testning med polystyrenpärlor
OBS: För inställningen, se figur 1A,B.
VARNING: Experimentalisten bör bära lämpliga skyddsglasögon eller laserskyddsglasögon under laserstrålens inriktning. Eftersom det optiska pincettsystemet som beskrivs häri använder både HeNe- och IR-strålar krävs två separata uppsättningar lasersäkerhetsglas.
<ol><li>HeNe Beam-inriktn...

<ol>
	<li>Bianco, P. R., Lu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+insight+into+stalled+replication+fork+rescue+in+Escherichia+coli.">Single-molecule insight into stalled replication fork rescue in Escherichia coli.</a> Nucleic Acids Research. 49 (8), 4220-4238 (2021).</li><li>Kaur, G., Lewis, J. S., van Oijen, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shining+a+spotlight+on+DNA:+Single-molecule+methods+to+visualise+DNA.">Shining a spotlight on DNA: Single-molecule methods to visualise DNA.</a> Molecules. 24 (3), 491 (2019).</li><li>Dame, R. T., Noom, M. C., Wuite, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+chromatin+organization+by+H-NS+protein+unravelled+using+dual+DNA+manipulation.">Bacterial chromatin organization by H-NS protein unravelled using dual DNA manipulation.</a> Nature. 444 (7117), 387-390 (2006).</li><li>Bianco, P. R., Bradfield, J. J., Castanza, L. R., Donnelly, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rad54+oligomers+translocate+and+cross-bridge+double-stranded+DNA+to+stimulate+synapsis.">Rad54 oligomers translocate and cross-bridge double-stranded DNA to stimulate synapsis.</a> Journal of Molecular Biology. 374 (3), 618-640 (2007).</li><li>Amitani, I., Liu, B., Dombrowski, C. C., Baskin, R. J., Kowalczykowski, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Watching+individual+proteins+acting+on+single+molecules+of+DNA.">Watching individual proteins acting on single molecules of DNA.</a> Methods in Enzymology. 472, 261-291 (2010).</li><li>Brewer, L. R., Bianco, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laminar+flow+cells+for+single-molecule+studies+of+DNA-protein+interactions.">Laminar flow cells for single-molecule studies of DNA-protein interactions.</a> Nature Methods. 5 (6), 517-525 (2008).</li><li>Visscher, K., Brakenhoff, G. J., Krol, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micromanipulation+by+multiple+optical+traps+created+by+a+single+fast+scanning+trap+integrated+with+the+bilateral+Confocal+scanning+laser+microscope.">Micromanipulation by multiple optical traps created by a single fast scanning trap integrated with the bilateral Confocal scanning laser microscope.</a> Cytometry. 14, 105-114 (1993).</li><li>Vermeulen, K. C., Mameren, J. v. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calibrating+bead+displacements+in+optical+tweezers+using+acousto-optic+deflectors.">Calibrating bead displacements in optical tweezers using acousto-optic deflectors.</a> Review of Scientific Instruments. 77 (1), 013704 (2006).</li><li>Dufresne, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computer-generated+holographic+optical+tweezers+arrays.">Computer-generated holographic optical tweezers arrays.</a> Review of Scientific Instruments. 72 (3), 1810 (2001).</li><li>Squires, T. M., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidics:+fluid+physics+at+the+nanoliter+scale.">Microfluidics: fluid physics at the nanoliter scale.</a> Reviews of Modern Physics. 77, 977-1026 (2005).</li><li>Weibel, D. B., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+microfluidics+in+chemical+biology.">Applications of microfluidics in chemical biology.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 10 (6), 584-591 (2006).</li><li>Tan, X., Mizuuchi, M., Mizuuchi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+transposition+target+immunity+and+the+determinants+of+the+MuB+distribution+patterns+on+DNA.">DNA transposition target immunity and the determinants of the MuB distribution patterns on DNA.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (35), 13925-13929 (2007).</li><li>Lima, R., Wada, S., Takeda, M., Tsubota, K., Yamaguchi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+confocal+micro-PIV+measurements+of+blood+flow+in+a+square+microchannel:+the+effect+of+the+haematocrit+on+instantaneous+velocity+profiles.">In vitro confocal micro-PIV measurements of blood flow in a square microchannel: the effect of the haematocrit on instantaneous velocity profiles.</a> Journal of Biomechanics. 40 (12), 2752-2757 (2007).</li><li>Bianco, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Processive+translocation+and+DNA+unwinding+by+individual+RecBCD+enzyme+molecules.">Processive translocation and DNA unwinding by individual RecBCD enzyme molecules.</a> Nature. 409 (6818), 374-378 (2001).</li><li>Forget, A. L., Dombrowski, C. C., Amitani, I., Kowalczykowski, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+protein-DNA+interactions+in+3D+using+in+situ+construction,+manipulation+and+visualization+of+individual+DNA+dumbbells+with+optical+traps,+microfluidics+and+fluorescence+microscopy.">Exploring protein-DNA interactions in 3D using in situ construction, manipulation and visualization of individual DNA dumbbells with optical traps, microfluidics and fluorescence microscopy.</a> Nature Protocol. 8 (3), 525-538 (2013).</li><li>Streets, A. M., Huang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidics+for+biological+measurements+with+single-molecule+resolution.">Microfluidics for biological measurements with single-molecule resolution.</a> Current Opinion in Biotechnology. 25, 69-77 (2014).</li><li>Madariaga-Marcos, J., Corti, R., Hormeno, S., Moreno-Herrero, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+microfluidic+approaches+for+a+fast+and+efficient+reagent+exchange+in+single-molecule+studies.">Characterizing microfluidic approaches for a fast and efficient reagent exchange in single-molecule studies.</a> Scientific Reports. 10 (1), 18069 (2020).</li><li>Grayson, P., Han, L., Winther, T., Phillips, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+observations+of+single+bacteriophage+lambda+DNA+ejections+in+vitro.">Real-time observations of single bacteriophage lambda DNA ejections in vitro.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (37), 14652-14657 (2007).</li><li>Luo, G., Wang, M., Konigsberg, W. H., Xie, X. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+and+ensemble+fluorescence+assays+for+a+functionally+important+conformational+change+in+T7+DNA+polymerase.">Single-molecule and ensemble fluorescence assays for a functionally important conformational change in T7 DNA polymerase.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (31), 12610-12615 (2007).</li><li>Sia, S. K., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+devices+fabricated+in+poly(dimethylsiloxane)+for+biological+studies.">Microfluidic devices fabricated in poly(dimethylsiloxane) for biological studies.</a> Electrophoresis. 24 (21), 3563-3576 (2003).</li><li>Wuite, G. J. L., Davenport, R. J., Rappaport, A., Bustamante, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+integrated+laser+trap/flow+control+video+microscope+for+the+study+of+single+biomolecules.">An integrated laser trap/flow control video microscope for the study of single biomolecules.</a> Biophysical Journal. 79 (2), 1155-1167 (2000).</li><li>Kim, S., Blainey, P. C., Schroeder, C. M., Xie, X. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+single-molecule+assay+for+enzymatic+activity+on+flow-stretched+DNA.">Multiplexed single-molecule assay for enzymatic activity on flow-stretched DNA.</a> Nature Methods. 4 (5), 397-399 (2007).</li><li>Tanaka, H., Ishijima, A., Honda, M., Saito, K., Yanagida, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orientation+dependence+of+displacements+by+a+single+one-headed+myosin+relative+to+the+actin+filament.">Orientation dependence of displacements by a single one-headed myosin relative to the actin filament.</a> Biophysical Journal. 75 (4), 1886-1894 (1998).</li><li>Merenda, F., Andrews, D. L., Galves, E. J., Nienhuis, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Refractive+multiple+optical+tweezers+for+parallel+biochemical+analysis+in+micro-fluidics.">Refractive multiple optical tweezers for parallel biochemical analysis in micro-fluidics.</a> Proceeding of SPIE. , 6483 (2007).</li><li>Brewer, L. R., Corzett, M., Balhorn, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protamine-induced+condensation+and+decondensation+of+the+same+DNA+molecule.">Protamine-induced condensation and decondensation of the same DNA molecule.</a> Science. 286 (5437), 120-123 (1999).</li><li>Ladoux, B., Quivy, J. P., Doyle, P. S., Almouzni, G., Viovy, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+imaging+of+single-molecules:+from+dynamics+of+a+single+DNA+chain+to+the+study+of+complex+DNA-protein+interactions.">Direct imaging of single-molecules: from dynamics of a single DNA chain to the study of complex DNA-protein interactions.</a> Science Progress. 84, 267-290 (2001).</li><li>Bianco, P. R., Bradfield, J. J., Castanza, L. R., Donnelly, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rad54+oligomers+translocate+and+cross-bridge+double-stranded+DNA+to+stimulate+synapsis.">Rad54 oligomers translocate and cross-bridge double-stranded DNA to stimulate synapsis.</a> Journal of Molecular Biology. 374 (3), 618-640 (2007).</li><li>Pezza, R. J., Camerini-Otero, R. D., Bianco, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hop2-Mnd1+condenses+DNA+to+stimulate+the+synapsis+phase+of+DNA+strand+exchange.">Hop2-Mnd1 condenses DNA to stimulate the synapsis phase of DNA strand exchange.</a> Biophysical Journal. 99 (11), 3763-3772 (2010).</li><li>Rye, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+fluorescent+complexes+of+double-stranded+DNA+with+bis-intercalating+asymmetric+cyanine+dyes:+properties+and+applications.">Stable fluorescent complexes of double-stranded DNA with bis-intercalating asymmetric cyanine dyes: properties and applications.</a> Nucleic Acids Research. 20 (11), 2803-2812 (1992).</li></ol>

Noggrann montering av flödessystemet är avgörande för ett framgångsrikt resultat av experiment 4,6. En av de mest utmanande aspekterna av protokollet är fastsättning av kontakter på glasytan. För detta använder vi följande två tillvägagångssätt: presspassningskopplingar och nanoportaggregat. Presspassningskontakter fäster lätt på glas följt av att trycka in PTFE-slangar i de förformade hålen med pincett. När en mer stabil fastsättning kräv...

Förmågan att visualisera protein-DNA-interaktioner på enmolekylnivå och i realtid har gett betydande inblick i genomstabilitet 1,2. Förutom att arbeta med enstaka molekyler av DNA en i taget, ger möjligheten att se transaktioner mellan enskilda molekyler i närheten ytterligare insikt 3,4,5. Manipuleringen av ytterligare DNA-molekyler kräver både ytterligare optiska fällor såväl som högkvalitativa, flerkanaliga, mikrofluidiska flödesceller6.
Det finns flera metoder tillgängliga för att generera mer än en optisk fälla. Dessa inkluderar galvanometerskanningsspeglar, akustiska optiska modulatorer och diffraktiv optik, som genererar holografisk optisk pincett 4,7,8,9. Ofta producerar skanningsspeglar och akustiska optiska modulatorer fällor som timeshare. I den inställning som beskrivs här delas strålen från en enda Nd: YAG-laser på polarisation, och sedan styr galvanometerlaserskanningsspeglar positionen för det som kallas mobilfällan (figur 1)4. För att underlätta placeringen av speglar och filter för att rikta fångststrålen till mikroskopmålets bakre bländare används en HeNe-laser. Detta gör den övergripande inriktningen enklare eftersom HeNe-strålen är synlig för blotta ögat, medan infraröda strålar inte är det. HeNe-balken är också säkrare att arbeta med vilket gör placeringen av speglar och andra komponenter mindre stressande. Ursprungligen är strålvägen för denna laser skild från 1064 nm-strålen, men införs i samma strålväg och sedan i mikroskopmålet. När fysisk inriktning har uppnåtts görs positionering av 1064 nm-strålen ovanpå HeNe-strålen och detta underlättas genom användning av en infraröd tittare och olika strålavbildningsverktyg för att visualisera strålposition och kvalitet. Därefter införs strålutvidgaren och den resulterande expanderade infraröda strålen är inriktad på målets bakre öppning. Slutligen avlägsnas målet och effekten i varje polariserad stråle mäts och justeras med λ/2 vågplattor för att vara lika (figur 1C). Effektmätningar görs också när målet har returnerats och vanligtvis finns det en effektförlust på 53%. Det finns dock tillräcklig kraft för att bilda stabila fasta och rörliga optiska fällor i fokalplanet (figur 1D).
För att avbilda DNA-transaktioner spelar mikrofluidiska flödesceller en nyckelroll eftersom de tillåter kontrollerade mätningar på enmolekylnivå med hög rumslig och tidsmässig upplösning (figur 2). Termen mikrofluidik avser förmågan att manipulera vätskor i en eller flera kanaler med dimensioner från 5-500 μm10,11. Termen ström avser den faktiska vätskan i en kanal och kanalen hänvisar till den fysiska kanalen där en vätskeström eller strömmar rör sig. Enkanalsflödescelldesign har en gemensam, fysisk kanal där reaktioner observeras och det finns vanligtvis bara en vätskeström närvarande. Således är dessa mönster kända som enströmsflödesceller. Däremot definieras flerströmsflödesceller som en mikrofluidisk anordning där två eller flera ingångskanaler konvergerar till en enda, gemensam, fysisk kanal (figur 2A). Inom den gemensamma kanalen flyter vätskeströmmarna som härstammar från de enskilda kanalerna parallellt med varandra och förblir separerade med endast minimal blandning mellan dem som uppstår på grund av diffusion (figur 2B). I de flesta experimentella inställningar skjuter en enda pump vätskor in i varje kanal med samma hastighet. Däremot, när gränsstyrning används, trycker tre eller flera, oberoende styrda pumpar vätskor genom kanalerna. Varje pump arbetar dock med olika hastighet men nettoflödet i den gemensamma kanalen är konstant12. Detta möjliggör snabbt utbyte av huvudkanalkomponenter helt enkelt genom att ändra pumphastigheten.
Förutom laminärt flöde är en annan kritisk faktor den paraboliska hastighetsprofilen i den laminära vätskeströmmen. Den högsta flödeshastigheten inträffar i mitten av strömmen och den långsammaste inträffar bredvid ytorna (figur 2C)13. Denna profil måste anses helt sträcka en DNA-molekyl som är fäst vid en pärla som hålls i strömmen för exakt visualisering av fluorescerande DNA och exakta enmolekylanalyser. Här sträcks DNA till B-form och hålls på plats under 0 pN kraft. För att uppnå detta bör fokuseringen av den optiska fällans läge vara till en position 10-20 μm från bottenytan (figur 2D). Försiktighet måste vidtas så att DNA-molekylen inte sträcker sig bortom B-form eftersom detta kan hämma enzymreaktioner. Under typiska buffertförhållanden är 1 μm = 3 000 bp DNA14. Dessutom, genom att fånga 10-20 μm från täckglaset, placeras DNA-komplexet långt från ytan vilket minimerar ytinteraktioner.
Många metoder har använts för att skapa mikrofluidiska enhetskanaler och dessa kan göras i laboratoriet eller flödesceller kan köpas från kommersiella källor 6,15,16,17. De optimala materialen som används för att konstruera flödescellerna måste vara mekaniskt styva, optiskt transparenta med låg fluorescens och ogenomträngliga för organiska lösningsmedel6. Ofta används borosilikatflottglas eller smält kiseldioxid för att ge en stabil flödesmiljö under en längre tid som är lämplig för optisk fångst, visualisering och kraftdetektering. Dessa material tillåter också användning av icke-vattenhaltiga lösningsmedel (t.ex. metanol av spektrofotometrisk kvalitet) för att förenkla ytvätning och avlägsnande av luftbubblor och denatureringsmedel (t.ex. 6M guanidiniumhydroklorid) eller tvättmedel för att rengöra flödescellen. Slutligen varierar metoderna som används för att införa vätskor i flödesceller från komplexa vakuumpumpsystem till enstaka sprutpumpar 14,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27. I det tillvägagångssätt som beskrivs här används en sprutpump som rymmer upp till 10 sprutor (figur 3A). Detta ger flexibilitet att använda enkanaliga flödesceller eller flödesceller med flera inloppskanaler. Här används en trekanals flödescell och paras med sprutor som hålls på plats på sprutpumpen med hjälp av polyeter-eter-keton (PEEK) -slang (figur 3A-C). Flödet av vätskor styrs av fyrvägs omkopplingsventiler och tjänar därmed till att minimera införandet av bubblor i flödescellen (figur 3A,D). Dessutom rekommenderas Hamilton gastäta sprutor som har styva glasväggar och polytetrafluoretylen (PTFE)-belagda kolvar eftersom de ger exceptionellt jämn kolvrörelse som är nödvändig för att få ett jämnt flöde14,27.
I det beskrivna experimentella systemet har flödesceller med två till fem inloppskanaler använts. Antalet inloppskanaler dikteras av experimentet som görs. För studien av RecBCD och Hop2-Mnd1 var två strömkanaler tillräckliga14,28. För helikasen var enzymet bundet till den fria änden av DNA och översattes till en ström innehållande magnesium och ATP för att initiera translokation och avveckling. För Hop2-Mnd1 översattes optiskt fångat DNA till den intilliggande vätskeströmmen innehållande proteiner och buffert ± tvåvärda metalljoner. Användningen av trekanaliga flödesceller gör det möjligt för en att fånga DNA i ström 1, översätta DNA till ström 2 för att tillåta proteinbindning att ske och sedan strömma 3 där ATP är närvarande, till exempel för att initiera reaktioner. En variant på ovanstående är att använda fluorescerande märkt protein i kanal 2, vilket resulterar i att vätskeströmmen är helt vit och utesluter visualisering av DNA. När denna molekyl översätts till ström 3 är både proteiner och DNA nu synliga när reaktioner initieras.
Användningen av fyrvägs omkopplingsventiler för att styra vätskeflödet är en kritisk komponent i systemet för att eliminera bubblor i flödescellerna. Bubblor är skadliga för stabilt vätskeflöde när de drar ihop sig och expanderar på oförutsägbara sätt, vilket resulterar i snabba förändringar i flödeshastighet och införande av turbulens. När ventilerna är placerade mellan sprutor och inloppsslangar kopplas flödesbanan bort genom att byta ventilläge när sprutorna byts ut. När den nya sprutan sätts på plats kan kolven tryckas ned manuellt så att >6 μL matas ut (ventilens dödvolym) och detta eliminerar bubblor nästan helt.
Kopplingen av kopplingar till flödesceller är ofta det hastighetsbegränsande steget i flödescellanvändningen. Vi beskriver användningen av två typer av kontakter: avtagbara som kallas press-fit och permanenta (nanoportaggregat). De avtagbara kontakterna är enkla att fästa vid en flödescell och olika typer av flexibla slangar utöver den rekommenderade PTFE kan testas med dessa kontakter. Detta är ett snabbt och kostnadseffektivt sätt att testa slangar och kontakter utan att offra dyrare glasflödesceller. Däremot är nanoportaggregat fästa permanent, tål tryck upp till 1 000 psi, och i våra händer är deras användning begränsad till PEEK-rör med olika diametrar. Detta är inte en nackdel eftersom PEEK-slangar företrädesvis används. En enda glasflödescell med permanenta enheter fästa kan återanvändas i mer än 1 år med noggrann användning.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100x objective</td>
			<td>Leica</td>
			<td>506318 or 506038</td>
			<td>Oil immersion lenses; Imaging and optical trapping only; Plan APO objectives optimized for fluorescence imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X Objective</td>
			<td>Leica</td>
			<td>506263</td>
			<td>Used to locate laser beams spots during alignment; to find focus and X-Y position in flow cell</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mm fluorescent beads</td>
			<td>Bangs Labs</td>
			<td>FSDG004</td>
			<td>Used for tap performance, focal position determination</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mm polystyrene beads</td>
			<td>Bangs Labs</td>
			<td>CPO1004</td>
			<td>Used for trap performance evaluation and binding to biotinylated molecules</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>63x objective</td>
			<td>Leica</td>
			<td>506081</td>
			<td>Used to locate laser beams spots during alignment and to find focus and X-y position in flow cell; can be used for optical trapping as it has an identical back aperture diameter to the 100X; oil immersion lens</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alignment laser</td>
			<td>Lumentum</td>
			<td>1100 series</td>
			<td>10mW HeNe laser that is visible to the naked eye that is used to position optics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beam alignment camera</td>
			<td>Amscope</td>
			<td>MU303</td>
			<td>A simple, inexpensive and software controlled camera for imaging of the beam position</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera control and Image capture software</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>HCImage</td>
			<td>Coordinates activities of the Lambda DG4 with the camera to facilitate rapid wavelength switching</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera; Orca flash 4</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>c13440-20cu</td>
			<td>CCD camera for imaging of single-molecule experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C-mount for the beam alignment camera</td>
			<td>Spot imaging solutions</td>
			<td>DE50CMT</td>
			<td>Provides optimal positioning of the camera for imaging of laser beams during alignment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C-mount for the Orca Flash 4 camera</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Has a retainer ring to hold an IR blocking filter in place. This eliminates reflected IR beam from the optical traps and facilitates clearer imaging of trapped objects.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy5&#160; fluorescence filter cube</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>cy5-404a-lsc-zero</td>
			<td>Used in conjunction with Lambda DG4 to image Cy5 only</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fitc-Txred&#160; fluorescence filter cube</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>fitc/txred-2x-b-000</td>
			<td>Used in conjunction with Lambda DG4 to image FITC and TXRed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluidics tubing</td>
			<td>Grace Bio</td>
			<td>46004</td>
			<td>PTFE tubing as an alternate to PEEK; works well on some flow cells. Can be used with PDMS flow cells or glass flow cells when Grace Bio fit tubing connectors are used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP fluorescence filter cube</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>gfp-3035b-lsc-zero</td>
			<td>Used in conjunction with Lambda DG4 to image GFP only</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass flow cells</td>
			<td>Translume</td>
			<td>Custom</td>
			<td>Clear flow channels for imaging (Fig. 2E)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass glue</td>
			<td>Loctite</td>
			<td>233841</td>
			<td>Securely and easily bonds Nanoport assemblies to glass flow cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass/PDMS sandwich flow cells</td>
			<td>CIDRA Precision services</td>
			<td>Custom design</td>
			<td>Flow cells built according to your specifications; imaging channels are clear (Fig. 2C)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton Cleaning solution</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>18311</td>
			<td>Gentle but efficient cleaning solution for glass flow cells; does not bubble when used carefully</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Illumination system</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>Lamda DG4</td>
			<td>Discontinued so recommend Lambda 721</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Illumination system</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>Lamda DG4</td>
			<td>Discontinued so recommend Lambda 721</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image analysis software</td>
			<td>Media cybernetics</td>
			<td>Image Pro Premiere</td>
			<td>Analysis of images and single molecule tracking</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image analysis software</td>
			<td>Fiji/NIH Image/Image J</td>
			<td>Shareware</td>
			<td>Analysis of images and single molecule tracking</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image display card</td>
			<td>Melles Griot</td>
			<td>06 DLA 001</td>
			<td>Alternate product from Thorlabs: VRC5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immersion oil</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>444960</td>
			<td>Immersol 518 F fluorescence free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser beam alignment tools</td>
			<td>Thor labs</td>
			<td>FMP05/M; dgo5-1500-h1; BHM1&#160;</td>
			<td>Used to ensure beams are horizontal and at the correct height</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser beam viewer</td>
			<td>Canadian Photonics labs</td>
			<td>IR 3150</td>
			<td>Used to image IR beam spots on mirrors and&#160; targets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser power meter</td>
			<td>Thor labs</td>
			<td></td>
			<td>Measurement of laser output as well as trap strength</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser safety glasses (HeNe)</td>
			<td>Thor labs</td>
			<td>LG7 or 8</td>
			<td>Blocks &#62;3 OD units of light of wavelengths &#62;600 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser safety glasses (IR)</td>
			<td>Thor labs</td>
			<td>LG11</td>
			<td>Blocks &#62;7 OD units of light of wavelengths &#179;1000 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mcherry&#160; fluorescence filter cube</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>mcherry-a-lsc-zero</td>
			<td>Used in conjunction with Lambda DG4 to image mcherry only</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DMIRE2</td>
			<td>DIC port removed to accommodate Dichroic trapping/alignment mirror</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope control software&#160;</td>
			<td>UCSF/shareware</td>
			<td>uManager</td>
			<td>Controls the microscope, permits focal alignment of objectives as well as stage control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanoport assembly</td>
			<td>IDEX</td>
			<td>N333</td>
			<td>Connectors that are bonded to flow cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical table support</td>
			<td>Thor Labs</td>
			<td>PA52502</td>
			<td>Active isolation table support</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optics and lenses</td>
			<td>Solar TII</td>
			<td>Various</td>
			<td>Interference mirrors, telescopes and lenses custom designed for the system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDMS flow cells</td>
			<td>ufluidix</td>
			<td>Custom</td>
			<td>Flow cells built according to your specifications; imaging channels are clear (Figs. 2B and D)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEEK tubing</td>
			<td>IDEX</td>
			<td>1532</td>
			<td>Provides excellent connection to flow cells and switching valves</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pinkel fluorescence filter cube</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>lf488/543/635-3x-a-000</td>
			<td>Used in conjunction with Lambda DG4 to image multiple fluorophores rapidly</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Press fit tubing connectors</td>
			<td>GraceBio</td>
			<td>46003</td>
			<td>Clear silicone connector with adhesive that binds well to glass</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scanning mirrors</td>
			<td>GSI Lumonics</td>
			<td>VM500</td>
			<td>Used to provide control of the second optical trap. GSI Lumonics no longer exists. Similar mirrors can be purchased from Cambridge Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stage</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stage micrometer</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>68042-08</td>
			<td>Provides on screen ruler for positioning of the beam and system calibration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Switching valves</td>
			<td>IDEX</td>
			<td>V-101T</td>
			<td>Control direction of fluid flow and eliminate introduction of bubbles into flow cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe and valve manifold</td>
			<td>Machine shop</td>
			<td>None</td>
			<td>Custom built</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pump</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>PHD 2000</td>
			<td>Controls fluid flow through flow cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pump software</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>70-6000</td>
			<td>Flow control provides seamless, programmable control of fluid flow</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>81320</td>
			<td>Gas-tight, PTFE Luer Lock, glass barrels with Teflon-coated plungers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Table top</td>
			<td>Thor Labs</td>
			<td>T36H</td>
			<td>Optical table top or breadboard</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trapping laser</td>
			<td>Newport/Spectra Physics</td>
			<td>J-series; BL106C</td>
			<td>Nd:YAG laser; 1064 nm; 5W laser</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

use of dual optical tweezers and microfluidics for single-molecule studies

Visuell biokemi är en kraftfull teknik för att observera de stokastiska egenskaperna hos enskilda enzymer eller enzymkomplex som döljs i medelvärdet som äger rum i bulkfasstudier. För att uppnå visualisering fokuseras dubbla optiska pincett, där en fälla är fixerad och den andra är mobil, i en kanal i en mikrofluidisk kammare med flera strömmar placerad på scenen i ett inverterat fluorescensmikroskop. Den optiska pincetten fångar enstaka molekyler av fluorescerande märkt DNA och vätska strömmar genom kammaren och förbi de fångade pärlorna, sträcker DNA till B-form (under minimal kraft, dvs 0 pN) med nukleinsyran observerad som en vit sträng mot en svart bakgrund. DNA-molekyler flyttas från en ström till en annan genom att översätta scenen vinkelrätt mot flödet för att möjliggöra initiering av reaktioner på ett kontrollerat sätt. För att uppnå framgång paras mikrofluidiska anordningar med optiskt klara kanaler till glassprutor som hålls på plats i en sprutpump. Optimala resultat använder kontakter som är permanent bundna till flödescellen, slangar som är mekaniskt styva och kemiskt resistenta och som är anslutna till omkopplingsventiler som eliminerar bubblor som förbjuder laminärt flöde.

Den första testningen av fällans inriktning och styrka görs med 1 μm, icke-fluorescerande polystyrenpärlor. Eftersom det mesta av forskningen som gjorts i laboratoriet använder fluorescens, testar vi ytterligare fällstyrka med 1 μm, Dragon gröna polystyrenpärlor (Figur 1D, E). Därefter övergår arbetet till optisk fångst av DNA-pärlkomplex där DNA:t färgas med det bis-interkalerande färgämnet YOYO-114,29<...

Watch this Scientific Journal Video about Use of Dual Optical Tweezers and Microfluidics for Single-Molecule Studies at JoVE.com

Use of Dual Optical Tweezers and Microfluidics for Single-Molecule Studies

Visuell, enmolekylär biokemi som studeras genom mikrofluidiska kamrar underlättas kraftigt med hjälp av glasfat, gastäta sprutor, stabila anslutningar av slangar till flödesceller och eliminering av bubblor genom att placera omkopplingsventiler mellan sprutorna och slangen. Protokollet beskriver dubbla optiska fällor som möjliggör visualisering av DNA-transaktioner och intermolekylära interaktioner.

Användning av dubbla optiska pincetter och mikrofluidik för enmolekylstudier

Visual biochemistry is a powerful technique for observing the stochastic properties of single enzymes or enzyme complexes that are obscured in the ...

Fastsättning av portar för att para sig med sprutor med slangar är avgörande eftersom det, när det görs rätt, inte finns några läckor, det finns inga bubblor i flödescellen och experiment kan göras upprepade gånger med samma flödescell under en period av ett år med noggrann användning. Här presenteras två enkla metoder för att fästa kontakterna i flödesceller. Dessa är enkla, de är reproducerbara och gör det möjligt för utredaren att enkelt anpassa flödescellen till deras behov utan alltför mycket besvär.Användningen av dessa flödesceller gjordes med enstaka molekylexperiment i åtanke. I synnerhet det vi kallar visuell biokemi, men de kan användas i alla studier där mikrofluidik krävs och i situationer där laminavätskeflöde ska användas. Så för att undvika misstag, istället för att använda värdefulla flödesceller för att etablera teknikerna, föreslår jag att du övar på en glasskiva eller en täckglidning först.Detta gör det möjligt för en att få en känsla för glaset eller PDMS-materialen för att veta hur man hanterar dem och hur mycket kraft man ska applicera när man sätter in slangar eller binder kontakterna. Detta kräver att du offrar vissa kontakter men de är mycket billigare än flödescellerna. Börja med att placera flödescellen på en ren plan yta.Håll PTFE-slangen tre millimeter från den fria änden med pincett och tryck in slangen i porten. Upprepa den här proceduren för var och en av de återstående portarna. Anslut inloppsportarna till sprutpumpen och utloppet till en avfallsflaska.Fyll varje glasspruta med en milliliter spektrofotometrisk, graderad metanol och fäst dem på en omkopplingsventil. Se till att ventilen har utloppet riktat till avfall och rensa varje linje med 50 mikroliter metanol. Byt utloppsläge till flödescellen och pumpa 800 mikroliter metanol genom flödescellen med en flödeshastighet på 100 mikroliter per timme för att blöta ytorna och eliminera bubblor.Nästa dag, upprepa denna process med 800 mikroliter ultrarent vatten. Flödescellen är nu klar att användas. Om slanganslutningar med presspassning ska användas, ta försiktigt bort tejpen från ena sidan av kontakten och placera den över hålet i mikroskopglaset.Tryck ner i några sekunder. Upprepa processen för de återstående anslutningarna. Placera sedan flödescellen på en ren plan yta.Håll PTFE-slangen tre millimeter från den fria änden och tryck in slangen i hålet i porten. Upprepa den här proceduren för var och en av de återstående portarna. Fäst slangar från inloppen till omkopplingsventilerna.Placera fästet antingen på en ren, plan yta eller på ett specialbyggt grenrör för att hålla flödescellen och kontakterna på plats medan bindningen sker. Placera flödescellen på den infällda delen av grenröret och placera sedan en liten mängd glaslim på botten av enheten och sätt in tätningen. Placera nanoporten över ett av ingångshålen på mikroskopglaset.Tryck försiktigt ner och håll på plats utan sidorörelse. Upprepa processen för de återstående portarna. Låt torka eller kläm fast på plats i grenröret.Ta försiktigt bort flödescellen från grenröret och se till att enheterna stämmer väl överens med ingångsportarna i flödescellen. Placera en flödescell på mikroskopsteget och fäst slangen med fingertäta kontakter. Fyll varje glasspruta med en milliliter spektrofotometrisk metanol.Fäst varje spruta på en omkopplingsventil. Se till att ventilen har utloppet riktat till avfall och rensa varje linje med 50 mikroliter metanol. Byt utloppsläge till flödescellen och pumpa 800 mikroliter metanol genom flödescellen med en flödeshastighet på 100 mikroliter per timme.Nästa dag, upprepa denna process med 800 mikroliter ultrarent vatten. Mätning av uteffekten visas här. Effekten från lasern mäts innan laserhuvudet installeras i den optiska layouten.När fällans inriktning är klar mäts stråleffekten efter 100 x-målet för varje fälla. Bilderna visar den stabila optiska fångsten av en mikrometer fluorescerande pärlor. Här är F en fast fälla och M är en mobil fälla.Med mobilfällan i skanningsläget som rör sig genom en liten eller stor cirkel vid 30 hertz. Vätskeflödet i flödescellen är laminärt. Schemat visar flödescellen från toppen för att visa att diffusionen mellan kanaler är huvudkällan för blandning mellan de intilliggande vätskeströmmarna.Blå pilar anger flödesriktningen och de enskilda strömmarna är färgade, vita, ljusgrå och vita. De vidgade regionerna med tvärgående diffusion mellan kanaler indikeras i rött. Insatsen visar en fluorescensbild av de intilliggande vätskeströmmarna vid 10 gångers förstoring med fluorescerande märkta DNA-pärlkomplex i den nedre strömmen och buffertar endast i den övre strömmen.De vita fläckarna i den övre strömmen är skottbrus från CCD-kameran. Flödesprofilen och laminära flödesceller är paraboliska. Flödescellen ses från sidan och flödesriktningen anges ovanför varje cell.Linjär pärlhastighet påverkas av pumphastighet och sackaroskoncentration. Den motsatta kraften på en pärla påverkas av lösningsviskositeten. Pärldiametern påverkar kraften på pärlor under flöde.När du försöker denna procedur, se till att området du arbetar i är rent och att du har rengjort glasytorna med spektrometrisk metanol eller aceton. I detta skede bör du ha en flödescell som är gjord till din sprutpump och du är nu redo att introducera dina lösningar och börja optiska pincettexperiment. Användningen av flödesceller, som kan användas under längre perioder, har gjort det möjligt för forskare att undersöka en mängd olika enmolekylsreaktioner där antingen krafter mäts, reaktioner visualiseras genom fluorescens eller en kombination av båda.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

An Efficient Method for the Isolation of Highly Purified RNA from Seeds for Use in Quantitative Transcriptome Analysis

En effektiv metod för isolering av högrenat RNA från frön för användning i kvantitativ transkriptom analys

Plant seeds accumulate large amounts of storage reserves comprising biodegradable organic matter. Humans rely on seed storage reserves for food and as ...

High Precision FRET at Single-molecule Level for Biomolecule Structure Determination

Hög precision FRET vid en-molekylnivå för biomolekylstrukturbestämning

A protocol on how to perform high-precision interdye distance measurements using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) at the single-molecule ...

Single-molecule Manipulation of G-quadruplexes by Magnetic Tweezers

Singel-molekyl Manipulation av G-quadruplexes av magnetisk pincett

Non-canonical nucleic acid secondary structure G-quadruplexes (G4) are involved in diverse cellular processes, such as DNA replication, transcription, RNA ...

Covalent Immobilization of Proteins for the Single Molecule Force Spectroscopy

Kovalent immobilisering av proteiner för den enda molekyl kraft spektroskopin

In recent years, atomic force microscopy (AFM) based single molecule force spectroscopy (SMFS) extended our understanding of molecular properties and ...

Proteome-wide Quantification of Labeling Homogeneity at the Single Molecule Level

Proteom-wide kvantifiering av märkning homogenitet på nivån enda molekyl

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a ...

Production of Dynein and Kinesin Motor Ensembles on DNA Origami Nanostructures for Single Molecule Observation

Produktion av dynein och Kinesin motor ensembler på DNA origami nanostrukturer för enkel molekyl observation

Cytoskeletal motors are responsible for a wide variety of functions in eukaryotic cells, including mitosis, cargo transport, cellular motility, and ...

OaAEP1-Mediated Enzymatic Synthesis and Immobilization of Polymerized Protein for Single-Molecule Force Spectroscopy

OaAEP1-medierad enzymatisk syntes och immobilisering av polymeriserat protein för enmolekylkraftsspektroskopi

Chemical and bio-conjugation techniques have been developed rapidly in recent years and allow the building of protein polymers. However, a controlled ...

Conventional BODIPY Conjugates for Live-Cell Super-Resolution Microscopy and Single-Molecule Tracking

Konventionella BODIPY konjugat för Live-Cell Super-Resolution Mikroskopi och single-molecule tracking

Single molecule localization microscopy (SMLM) techniques overcome the optical diffraction limit of conventional fluorescence microscopy and can resolve ...

Single Cell Analysis Of Transcriptionally Active Alleles By Single Molecule FISH

Encellsanalys av transkriptionellt aktiva alleler med enmolekylig FISK

Gene transcription is an essential process in cell biology, and allows cells to interpret and respond to internal and external cues. Traditional bulk ...

Making Precise and Accurate Single-Molecule FRET Measurements using the Open-Source smfBox

Göra exakta och exakta enmolekyliga FRET-mätningar med hjälp av SmfBox med öppen källkod

The smfBox is a recently developed cost-effective, open-source instrument for single-molecule F&#246;rster Resonance Energy Transfer (smFRET), which makes ...