Name: use of dual optical tweezers and microfluidics for single-molecule studies
Uploaded: 2022-11-18T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Use of Dual Optical Tweezers and Microfluidics for Single-Molecule Studies at JoVE.com

Bianco laboratuvarındaki araştırmalar, NIH hibeleri GM100156 ve GM144414 tarafından P.R.B.'ye desteklenmektedir.

1. Lazer tuzak hizalama ve polistiren boncuklarla test
NOT: Kurulum için Şekil 1A,B'ye bakın.
DİKKAT: Deneyci, lazer ışını hizalaması sırasında uygun koruyucu gözlük veya lazer güvenlik gözlüğü takmalıdır. Burada açıklanan optik cımbız sistemi hem HeNe hem de IR ışınlarını kullandığından, iki ayrı lazer güvenlik cam eşyası seti gereklidir.
<ol><li>HeNe Kiriş hizala...

<ol>
	<li>Bianco, P. R., Lu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+insight+into+stalled+replication+fork+rescue+in+Escherichia+coli.">Single-molecule insight into stalled replication fork rescue in Escherichia coli.</a> Nucleic Acids Research. 49 (8), 4220-4238 (2021).</li><li>Kaur, G., Lewis, J. S., van Oijen, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shining+a+spotlight+on+DNA:+Single-molecule+methods+to+visualise+DNA.">Shining a spotlight on DNA: Single-molecule methods to visualise DNA.</a> Molecules. 24 (3), 491 (2019).</li><li>Dame, R. T., Noom, M. C., Wuite, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+chromatin+organization+by+H-NS+protein+unravelled+using+dual+DNA+manipulation.">Bacterial chromatin organization by H-NS protein unravelled using dual DNA manipulation.</a> Nature. 444 (7117), 387-390 (2006).</li><li>Bianco, P. R., Bradfield, J. J., Castanza, L. R., Donnelly, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rad54+oligomers+translocate+and+cross-bridge+double-stranded+DNA+to+stimulate+synapsis.">Rad54 oligomers translocate and cross-bridge double-stranded DNA to stimulate synapsis.</a> Journal of Molecular Biology. 374 (3), 618-640 (2007).</li><li>Amitani, I., Liu, B., Dombrowski, C. C., Baskin, R. J., Kowalczykowski, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Watching+individual+proteins+acting+on+single+molecules+of+DNA.">Watching individual proteins acting on single molecules of DNA.</a> Methods in Enzymology. 472, 261-291 (2010).</li><li>Brewer, L. R., Bianco, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laminar+flow+cells+for+single-molecule+studies+of+DNA-protein+interactions.">Laminar flow cells for single-molecule studies of DNA-protein interactions.</a> Nature Methods. 5 (6), 517-525 (2008).</li><li>Visscher, K., Brakenhoff, G. J., Krol, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micromanipulation+by+multiple+optical+traps+created+by+a+single+fast+scanning+trap+integrated+with+the+bilateral+Confocal+scanning+laser+microscope.">Micromanipulation by multiple optical traps created by a single fast scanning trap integrated with the bilateral Confocal scanning laser microscope.</a> Cytometry. 14, 105-114 (1993).</li><li>Vermeulen, K. C., Mameren, J. v. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calibrating+bead+displacements+in+optical+tweezers+using+acousto-optic+deflectors.">Calibrating bead displacements in optical tweezers using acousto-optic deflectors.</a> Review of Scientific Instruments. 77 (1), 013704 (2006).</li><li>Dufresne, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computer-generated+holographic+optical+tweezers+arrays.">Computer-generated holographic optical tweezers arrays.</a> Review of Scientific Instruments. 72 (3), 1810 (2001).</li><li>Squires, T. M., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidics:+fluid+physics+at+the+nanoliter+scale.">Microfluidics: fluid physics at the nanoliter scale.</a> Reviews of Modern Physics. 77, 977-1026 (2005).</li><li>Weibel, D. B., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+microfluidics+in+chemical+biology.">Applications of microfluidics in chemical biology.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 10 (6), 584-591 (2006).</li><li>Tan, X., Mizuuchi, M., Mizuuchi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+transposition+target+immunity+and+the+determinants+of+the+MuB+distribution+patterns+on+DNA.">DNA transposition target immunity and the determinants of the MuB distribution patterns on DNA.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (35), 13925-13929 (2007).</li><li>Lima, R., Wada, S., Takeda, M., Tsubota, K., Yamaguchi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+confocal+micro-PIV+measurements+of+blood+flow+in+a+square+microchannel:+the+effect+of+the+haematocrit+on+instantaneous+velocity+profiles.">In vitro confocal micro-PIV measurements of blood flow in a square microchannel: the effect of the haematocrit on instantaneous velocity profiles.</a> Journal of Biomechanics. 40 (12), 2752-2757 (2007).</li><li>Bianco, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Processive+translocation+and+DNA+unwinding+by+individual+RecBCD+enzyme+molecules.">Processive translocation and DNA unwinding by individual RecBCD enzyme molecules.</a> Nature. 409 (6818), 374-378 (2001).</li><li>Forget, A. L., Dombrowski, C. C., Amitani, I., Kowalczykowski, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+protein-DNA+interactions+in+3D+using+in+situ+construction,+manipulation+and+visualization+of+individual+DNA+dumbbells+with+optical+traps,+microfluidics+and+fluorescence+microscopy.">Exploring protein-DNA interactions in 3D using in situ construction, manipulation and visualization of individual DNA dumbbells with optical traps, microfluidics and fluorescence microscopy.</a> Nature Protocol. 8 (3), 525-538 (2013).</li><li>Streets, A. M., Huang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidics+for+biological+measurements+with+single-molecule+resolution.">Microfluidics for biological measurements with single-molecule resolution.</a> Current Opinion in Biotechnology. 25, 69-77 (2014).</li><li>Madariaga-Marcos, J., Corti, R., Hormeno, S., Moreno-Herrero, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+microfluidic+approaches+for+a+fast+and+efficient+reagent+exchange+in+single-molecule+studies.">Characterizing microfluidic approaches for a fast and efficient reagent exchange in single-molecule studies.</a> Scientific Reports. 10 (1), 18069 (2020).</li><li>Grayson, P., Han, L., Winther, T., Phillips, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+observations+of+single+bacteriophage+lambda+DNA+ejections+in+vitro.">Real-time observations of single bacteriophage lambda DNA ejections in vitro.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (37), 14652-14657 (2007).</li><li>Luo, G., Wang, M., Konigsberg, W. H., Xie, X. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+and+ensemble+fluorescence+assays+for+a+functionally+important+conformational+change+in+T7+DNA+polymerase.">Single-molecule and ensemble fluorescence assays for a functionally important conformational change in T7 DNA polymerase.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (31), 12610-12615 (2007).</li><li>Sia, S. K., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+devices+fabricated+in+poly(dimethylsiloxane)+for+biological+studies.">Microfluidic devices fabricated in poly(dimethylsiloxane) for biological studies.</a> Electrophoresis. 24 (21), 3563-3576 (2003).</li><li>Wuite, G. J. L., Davenport, R. J., Rappaport, A., Bustamante, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+integrated+laser+trap/flow+control+video+microscope+for+the+study+of+single+biomolecules.">An integrated laser trap/flow control video microscope for the study of single biomolecules.</a> Biophysical Journal. 79 (2), 1155-1167 (2000).</li><li>Kim, S., Blainey, P. C., Schroeder, C. M., Xie, X. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+single-molecule+assay+for+enzymatic+activity+on+flow-stretched+DNA.">Multiplexed single-molecule assay for enzymatic activity on flow-stretched DNA.</a> Nature Methods. 4 (5), 397-399 (2007).</li><li>Tanaka, H., Ishijima, A., Honda, M., Saito, K., Yanagida, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orientation+dependence+of+displacements+by+a+single+one-headed+myosin+relative+to+the+actin+filament.">Orientation dependence of displacements by a single one-headed myosin relative to the actin filament.</a> Biophysical Journal. 75 (4), 1886-1894 (1998).</li><li>Merenda, F., Andrews, D. L., Galves, E. J., Nienhuis, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Refractive+multiple+optical+tweezers+for+parallel+biochemical+analysis+in+micro-fluidics.">Refractive multiple optical tweezers for parallel biochemical analysis in micro-fluidics.</a> Proceeding of SPIE. , 6483 (2007).</li><li>Brewer, L. R., Corzett, M., Balhorn, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protamine-induced+condensation+and+decondensation+of+the+same+DNA+molecule.">Protamine-induced condensation and decondensation of the same DNA molecule.</a> Science. 286 (5437), 120-123 (1999).</li><li>Ladoux, B., Quivy, J. P., Doyle, P. S., Almouzni, G., Viovy, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+imaging+of+single-molecules:+from+dynamics+of+a+single+DNA+chain+to+the+study+of+complex+DNA-protein+interactions.">Direct imaging of single-molecules: from dynamics of a single DNA chain to the study of complex DNA-protein interactions.</a> Science Progress. 84, 267-290 (2001).</li><li>Bianco, P. R., Bradfield, J. J., Castanza, L. R., Donnelly, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rad54+oligomers+translocate+and+cross-bridge+double-stranded+DNA+to+stimulate+synapsis.">Rad54 oligomers translocate and cross-bridge double-stranded DNA to stimulate synapsis.</a> Journal of Molecular Biology. 374 (3), 618-640 (2007).</li><li>Pezza, R. J., Camerini-Otero, R. D., Bianco, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hop2-Mnd1+condenses+DNA+to+stimulate+the+synapsis+phase+of+DNA+strand+exchange.">Hop2-Mnd1 condenses DNA to stimulate the synapsis phase of DNA strand exchange.</a> Biophysical Journal. 99 (11), 3763-3772 (2010).</li><li>Rye, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+fluorescent+complexes+of+double-stranded+DNA+with+bis-intercalating+asymmetric+cyanine+dyes:+properties+and+applications.">Stable fluorescent complexes of double-stranded DNA with bis-intercalating asymmetric cyanine dyes: properties and applications.</a> Nucleic Acids Research. 20 (11), 2803-2812 (1992).</li></ol>

Akış sisteminin dikkatli bir şekilde monte edilmesi, deneylerin başarılı bir şekilde sonuçlanması için kritik öneme sahiptir 4,6. Protokolün en zorlu yönlerinden biri, konektörlerin cam yüzeye tutturulmasıdır. Bunun için aşağıdaki iki yaklaşımı kullanıyoruz: prese uygun boru konektörleri ve nanoport montajları. Prese takılan konektörler cama kolayca yapışır ve ardından PTFE borularının forseps kullanılarak önceden oluşturulmu...

Protein-DNA etkileşimlerini tek molekül düzeyinde ve gerçek zamanlı olarak görselleştirme yeteneği, genom stabilitesi hakkında önemli bilgiler sağlamıştır 1,2. DNA'nın tek molekülleriyle birer birer çalışmaya ek olarak, yakındaki tek tek moleküller arasındaki işlemleri görüntüleme yeteneği ek içgörü sağlar 3,4,5. Ek DNA moleküllerinin manipülasyonu hem ek optik tuzaklar hem de yüksek kaliteli, çok kanallı, mikroakışkan akış hücreleri gerektirir6.
Birden fazla optik tuzak oluşturmak için kullanılabilecek birkaç yöntem vardır. Bunlar arasında galvanometre tarama aynaları, akustik optik modülatörler ve holografik optik cımbız 4,7,8,9 üreten kırınımsal optikler bulunur. Çoğu zaman, tarama aynaları ve akustik optik modülatörler devre mülk tuzakları üretir. Burada açıklanan kurulumda, tek bir Nd: YAG lazerin ışını polarizasyon üzerine bölünür ve daha sonra galvanometre lazer tarama aynaları mobil tuzak olarak adlandırılan şeyin konumunu kontrol eder (Şekil 1)4. Tuzak ışını mikroskop hedefinin arka açıklığına yönlendirmek için aynaların ve filtrelerin konumlandırılmasını kolaylaştırmak için bir HeNe lazer kullanılır. Bu, HeNe ışını çıplak gözle görülebildiği için genel hizalamayı kolaylaştırırken, kızılötesi ışınlar görünmez. HeNe ışını, aynaların ve diğer bileşenlerin konumlandırılmasını daha az stresli hale getirmek için çalışmak için daha güvenlidir. Başlangıçta, bu lazerin ışın yolu 1064 nm ışından ayrıdır, ancak aynı ışın yoluna ve daha sonra mikroskop hedefine sokulur. Fiziksel hizalama sağlandıktan sonra, 1064 nm ışının HeNe ışınının üzerine konumlandırılması yapılır ve bu, ışın konumunu ve kalitesini görselleştirmek için bir kızılötesi görüntüleyici ve çeşitli ışın görüntüleme araçlarının kullanılmasıyla kolaylaştırılır. Daha sonra, ışın genişletici tanıtılır ve elde edilen genişletilmiş kızılötesi ışın, hedefin arka açıklığına hizalanır. Son olarak, hedef kaldırılır ve her polarize ışındaki güç ölçülür ve λ/2 dalga plakaları kullanılarak eşit olacak şekilde ayarlanır (Şekil 1C). Güç ölçümleri, hedefe geri dönüldüğünde de yapılır ve tipik olarak% 53'lük bir güç kaybı olur. Bununla birlikte, odak düzleminde kararlı sabit ve hareketli optik tuzaklar oluşturmak için yeterli güç vardır (Şekil 1D).
DNA işlemlerini görüntülemek için, mikroakışkan akış hücreleri, yüksek uzamsal ve zamansal çözünürlüğe sahip tek molekül düzeyinde kontrollü ölçümlere izin verdikleri için önemli bir rol oynamaktadır (Şekil 2). Mikroakışkan terimi, 5-500 μm10,11 arasında değişen boyutlarda bir veya daha fazla kanaldaki sıvıları manipüle etme yeteneğini ifade eder. Akış terimi, bir kanal içindeki gerçek sıvıyı ifade eder ve kanal, bir akışkan akışının veya akışlarının hareket ettiği fiziksel kanalı ifade eder. Tek kanallı akış hücresi tasarımı, reaksiyonların gözlemlendiği ve tipik olarak sadece bir sıvı akışının mevcut olduğu ortak, fiziksel bir kanala sahiptir. Bu nedenle, bu tasarımlar tek akışlı akış hücreleri olarak bilinir. Buna karşılık, çok akışlı akış hücreleri, iki veya daha fazla giriş kanalının tek, ortak, fiziksel bir kanalda birleştiği mikroakışkan bir cihaz olarak tanımlanır (Şekil 2A). Ortak kanal içinde, bireysel kanallardan kaynaklanan sıvı akışları birbirine paralel olarak akar ve difüzyon nedeniyle aralarında sadece minimum karışım meydana gelerek ayrı kalır (Şekil 2B). Deney kurulumlarının çoğunda, tek bir pompa sıvıları her kanala aynı hızda iter. Buna karşılık, sınır yönlendirmesi kullanıldığında, üç veya daha fazla, bağımsız olarak kontrol edilen pompa, sıvıları kanallardan iter. Bununla birlikte, her pompa farklı bir hızda çalışır, ancak ortak kanaldaki net akış hızı sabit12'dir. Bu, sadece pompa hızını değiştirerek ana kanal bileşenlerinin hızlı bir şekilde değiştirilmesini sağlar.
Laminer akışa ek olarak, bir diğer kritik faktör, laminer sıvı akışı içindeki parabolik hız profilidir. En yüksek akış hızı derenin ortasında, en yavaş ise yüzeylerin yanında meydana gelir (Şekil 2C)13. Bu profilin, floresan DNA'nın hassas bir şekilde görselleştirilmesi ve doğru tek moleküllü analizler için akışta tutulan bir boncuğa bağlı bir DNA molekülünü tamamen gerdiği düşünülmelidir. Burada, DNA B formuna gerilir ve 0 pN kuvvet altında yerinde tutulur. Bunu başarmak için, optik tuzak konumunun odaklanması alt kapak kayma yüzeyinden 10-20 μm yükseklikte olmalıdır (Şekil 2D). DNA molekülünün B formunun ötesine gerilmemesine dikkat edilmelidir, çünkü bu enzim reaksiyonlarını inhibe edebilir. Tipik tampon koşullar altında, 1 μm = 3.000 bp DNA14. Ayrıca, kapak kaymasından 10-20 μm uzakta tutularak, DNA kompleksi yüzeyden uzağa yerleştirilir ve böylece yüzey etkileşimleri en aza indirilir.
Mikroakışkan cihaz kanalları oluşturmak için birçok yöntem kullanılmıştır ve bunlar laboratuvarda yapılabilir veya akış hücreleri ticari kaynaklardan satın alınabilir 6,15,16,17. Akış hücrelerini oluşturmak için kullanılan en uygun malzemeler mekanik olarak sert, düşük floresanlı optik olarak şeffaf ve organik çözücülere karşı geçirimsiz olmalıdır6. Sıklıkla, borosilikat float cam veya kaynaşmış silika, optik yakalama, görselleştirme ve kuvvet algılama için uygun olan uzun bir süre boyunca istikrarlı bir akış ortamı sağlamak için kullanılır. Bu malzemeler ayrıca yüzey ıslatmasını ve hava kabarcıklarının giderilmesini basitleştirmek için susuz çözücülerin (örneğin, spektrofotometrik sınıf metanol) ve akış hücresini temizlemek için denatürantların (örneğin, 6M guanidinyum hidroklorür) veya deterjanların kullanılmasına izin verir. Son olarak, akışkanları akış hücrelerine sokmak için kullanılan yöntemler, karmaşık vakum pompası sistemlerinden tek şırıngalı pompalara kadar değişir 14,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27. Burada açıklanan yaklaşımda, 10 şırıngaya kadar barındırabilen bir şırınga pompası kullanılmıştır (Şekil 3A). Bu, tek kanallı akış hücrelerini veya birden çok giriş kanalına sahip akış hücrelerini kullanma esnekliği sağlar. Burada, üç kanallı bir akış hücresi kullanılır ve poli-eter-eter-keton (PEEK) borusu kullanılarak şırınga pompasında yerinde tutulan şırıngalarla eşleştirilir (Şekil 3A-C). Akışkanların akışı dört yönlü anahtarlama valfleri tarafından kontrol edilir ve böylece kabarcıkların akış hücresine girmesini en aza indirmeye yarar (Şekil 3A, D). Ek olarak, sert cam duvarlara ve politetrafloroetilen (PTFE) kaplı pistonlara sahip Hamilton gaz geçirmez şırıngalar,pürüzsüz bir akış elde etmek için gerekli olan olağanüstü pürüzsüz piston hareketi sağladıkları için tavsiye edilirler 14,27.
Açıklanan deneysel sistemde, iki ila beş giriş kanalına sahip akış hücreleri kullanılmıştır. Giriş kanallarının sayısı, yapılan deney tarafından belirlenir. RecBCD ve Hop2-Mnd1 çalışmaları için iki akış kanalı yeterli14,28 idi. Helikaz için, enzim DNA'nın serbest ucuna bağlandı ve translokasyon ve çözülmeyi başlatmak için magnezyum ve ATP içeren bir akışa çevrildi. Hop2-Mnd1 için, optik olarak hapsedilmiş DNA, proteinler ve tampon ± iki değerli metal iyonları içeren bitişik sıvı akışına çevrildi. Üç kanallı akış hücrelerinin kullanımı, DNA'nın akış 1'de yakalanmasını, protein bağlanmasının gerçekleşmesine izin vermek için DNA'yı akış 2'ye çevirmesini ve daha sonra ATP'nin mevcut olduğu 3. akışa, örneğin reaksiyonları başlatmasını sağlar. Yukarıdakilerin bir varyasyonu, kanal 2'de floresan etiketli protein kullanmaktır, bu da sıvı akışının tamamen beyaz olmasına neden olur ve DNA'nın görselleştirilmesini engeller. Bu molekül akış 3'e çevrildiğinde, reaksiyonlar başlatıldığında hem proteinler hem de DNA artık görülebilir.
Sıvı akışını kontrol etmek için dört yönlü anahtarlama valflerinin kullanılması, akış hücrelerindeki kabarcıkları ortadan kaldırmak için sistemin kritik bir bileşenidir. Kabarcıklar, öngörülemeyen şekillerde büzüldükleri ve genişledikleri için kararlı sıvı akışına zararlıdır, bu da akış hızında hızlı değişikliklere ve türbülansın ortaya çıkmasına neden olur. Vanalar şırıngalar ve giriş boruları arasına yerleştirildiğinde, şırıngalar değiştirildiğinde valf konumu değiştirilerek akış yolunun bağlantısı kesilir. Yeni şırınga yerleştirildiğinde, piston manuel olarak bastırılabilir, böylece >6 μL dışarı atılır (valfin ölü hacmi) ve bu da kabarcıkları neredeyse tamamen ortadan kaldırır.
Bağlayıcıların akış hücrelerine bağlanması, akış hücresi kullanımında genellikle hız sınırlayıcı adımdır. İki tip konektörün kullanımını tanımlıyoruz: prese sığdırma ve kalıcı olanlar (nanoport montajları) olarak bilinen çıkarılabilir. Çıkarılabilir konektörlerin bir akış hücresine yapıştırılması kolaydır ve önerilen PTFE'ye ek olarak farklı esnek boru tipleri bu konektörlerle test edilebilir. Bu, daha pahalı cam akış hücrelerinden ödün vermeden boru ve konektörleri test etmenin hızlı ve uygun maliyetli bir yoludur. Buna karşılık, nanoport tertibatları kalıcı olarak bağlanır, 1.000 psi'ye kadar basınçlara dayanır ve elimizde kullanımları farklı çaplardaki PEEK boruları ile sınırlıdır. PEEK boruları tercihen kullanıldığından bu bir dezavantaj değildir. Kalıcı montajlara sahip tek bir cam akış hücresi, dikkatli kullanımla 1 yıldan fazla bir süre boyunca tekrar kullanılabilir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100x objective</td>
			<td>Leica</td>
			<td>506318 or 506038</td>
			<td>Oil immersion lenses; Imaging and optical trapping only; Plan APO objectives optimized for fluorescence imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X Objective</td>
			<td>Leica</td>
			<td>506263</td>
			<td>Used to locate laser beams spots during alignment; to find focus and X-Y position in flow cell</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mm fluorescent beads</td>
			<td>Bangs Labs</td>
			<td>FSDG004</td>
			<td>Used for tap performance, focal position determination</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mm polystyrene beads</td>
			<td>Bangs Labs</td>
			<td>CPO1004</td>
			<td>Used for trap performance evaluation and binding to biotinylated molecules</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>63x objective</td>
			<td>Leica</td>
			<td>506081</td>
			<td>Used to locate laser beams spots during alignment and to find focus and X-y position in flow cell; can be used for optical trapping as it has an identical back aperture diameter to the 100X; oil immersion lens</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alignment laser</td>
			<td>Lumentum</td>
			<td>1100 series</td>
			<td>10mW HeNe laser that is visible to the naked eye that is used to position optics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beam alignment camera</td>
			<td>Amscope</td>
			<td>MU303</td>
			<td>A simple, inexpensive and software controlled camera for imaging of the beam position</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera control and Image capture software</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>HCImage</td>
			<td>Coordinates activities of the Lambda DG4 with the camera to facilitate rapid wavelength switching</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera; Orca flash 4</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>c13440-20cu</td>
			<td>CCD camera for imaging of single-molecule experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C-mount for the beam alignment camera</td>
			<td>Spot imaging solutions</td>
			<td>DE50CMT</td>
			<td>Provides optimal positioning of the camera for imaging of laser beams during alignment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C-mount for the Orca Flash 4 camera</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Has a retainer ring to hold an IR blocking filter in place. This eliminates reflected IR beam from the optical traps and facilitates clearer imaging of trapped objects.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy5&#160; fluorescence filter cube</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>cy5-404a-lsc-zero</td>
			<td>Used in conjunction with Lambda DG4 to image Cy5 only</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fitc-Txred&#160; fluorescence filter cube</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>fitc/txred-2x-b-000</td>
			<td>Used in conjunction with Lambda DG4 to image FITC and TXRed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluidics tubing</td>
			<td>Grace Bio</td>
			<td>46004</td>
			<td>PTFE tubing as an alternate to PEEK; works well on some flow cells. Can be used with PDMS flow cells or glass flow cells when Grace Bio fit tubing connectors are used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP fluorescence filter cube</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>gfp-3035b-lsc-zero</td>
			<td>Used in conjunction with Lambda DG4 to image GFP only</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass flow cells</td>
			<td>Translume</td>
			<td>Custom</td>
			<td>Clear flow channels for imaging (Fig. 2E)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass glue</td>
			<td>Loctite</td>
			<td>233841</td>
			<td>Securely and easily bonds Nanoport assemblies to glass flow cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass/PDMS sandwich flow cells</td>
			<td>CIDRA Precision services</td>
			<td>Custom design</td>
			<td>Flow cells built according to your specifications; imaging channels are clear (Fig. 2C)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton Cleaning solution</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>18311</td>
			<td>Gentle but efficient cleaning solution for glass flow cells; does not bubble when used carefully</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Illumination system</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>Lamda DG4</td>
			<td>Discontinued so recommend Lambda 721</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Illumination system</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>Lamda DG4</td>
			<td>Discontinued so recommend Lambda 721</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image analysis software</td>
			<td>Media cybernetics</td>
			<td>Image Pro Premiere</td>
			<td>Analysis of images and single molecule tracking</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image analysis software</td>
			<td>Fiji/NIH Image/Image J</td>
			<td>Shareware</td>
			<td>Analysis of images and single molecule tracking</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image display card</td>
			<td>Melles Griot</td>
			<td>06 DLA 001</td>
			<td>Alternate product from Thorlabs: VRC5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immersion oil</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>444960</td>
			<td>Immersol 518 F fluorescence free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser beam alignment tools</td>
			<td>Thor labs</td>
			<td>FMP05/M; dgo5-1500-h1; BHM1&#160;</td>
			<td>Used to ensure beams are horizontal and at the correct height</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser beam viewer</td>
			<td>Canadian Photonics labs</td>
			<td>IR 3150</td>
			<td>Used to image IR beam spots on mirrors and&#160; targets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser power meter</td>
			<td>Thor labs</td>
			<td></td>
			<td>Measurement of laser output as well as trap strength</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser safety glasses (HeNe)</td>
			<td>Thor labs</td>
			<td>LG7 or 8</td>
			<td>Blocks &#62;3 OD units of light of wavelengths &#62;600 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser safety glasses (IR)</td>
			<td>Thor labs</td>
			<td>LG11</td>
			<td>Blocks &#62;7 OD units of light of wavelengths &#179;1000 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mcherry&#160; fluorescence filter cube</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>mcherry-a-lsc-zero</td>
			<td>Used in conjunction with Lambda DG4 to image mcherry only</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DMIRE2</td>
			<td>DIC port removed to accommodate Dichroic trapping/alignment mirror</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope control software&#160;</td>
			<td>UCSF/shareware</td>
			<td>uManager</td>
			<td>Controls the microscope, permits focal alignment of objectives as well as stage control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanoport assembly</td>
			<td>IDEX</td>
			<td>N333</td>
			<td>Connectors that are bonded to flow cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical table support</td>
			<td>Thor Labs</td>
			<td>PA52502</td>
			<td>Active isolation table support</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optics and lenses</td>
			<td>Solar TII</td>
			<td>Various</td>
			<td>Interference mirrors, telescopes and lenses custom designed for the system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDMS flow cells</td>
			<td>ufluidix</td>
			<td>Custom</td>
			<td>Flow cells built according to your specifications; imaging channels are clear (Figs. 2B and D)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEEK tubing</td>
			<td>IDEX</td>
			<td>1532</td>
			<td>Provides excellent connection to flow cells and switching valves</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pinkel fluorescence filter cube</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>lf488/543/635-3x-a-000</td>
			<td>Used in conjunction with Lambda DG4 to image multiple fluorophores rapidly</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Press fit tubing connectors</td>
			<td>GraceBio</td>
			<td>46003</td>
			<td>Clear silicone connector with adhesive that binds well to glass</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scanning mirrors</td>
			<td>GSI Lumonics</td>
			<td>VM500</td>
			<td>Used to provide control of the second optical trap. GSI Lumonics no longer exists. Similar mirrors can be purchased from Cambridge Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stage</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stage micrometer</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>68042-08</td>
			<td>Provides on screen ruler for positioning of the beam and system calibration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Switching valves</td>
			<td>IDEX</td>
			<td>V-101T</td>
			<td>Control direction of fluid flow and eliminate introduction of bubbles into flow cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe and valve manifold</td>
			<td>Machine shop</td>
			<td>None</td>
			<td>Custom built</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pump</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>PHD 2000</td>
			<td>Controls fluid flow through flow cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pump software</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>70-6000</td>
			<td>Flow control provides seamless, programmable control of fluid flow</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>81320</td>
			<td>Gas-tight, PTFE Luer Lock, glass barrels with Teflon-coated plungers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Table top</td>
			<td>Thor Labs</td>
			<td>T36H</td>
			<td>Optical table top or breadboard</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trapping laser</td>
			<td>Newport/Spectra Physics</td>
			<td>J-series; BL106C</td>
			<td>Nd:YAG laser; 1064 nm; 5W laser</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

use of dual optical tweezers and microfluidics for single-molecule studies

Görsel biyokimya, toplu faz çalışmalarında gerçekleşen ortalamada gizlenen tek enzimlerin veya enzim komplekslerinin stokastik özelliklerini gözlemlemek için güçlü bir tekniktir. Görselleştirmeyi başarmak için, bir tuzağın sabit, diğerinin hareketli olduğu çift optik cımbız, ters çevrilmiş bir floresan mikroskobu sahnesine yerleştirilmiş çok akışlı bir mikroakışkan odanın bir kanalına odaklanır. Optik cımbızlar, floresan olarak etiketlenmiş DNA'nın tek moleküllerini yakalar ve odadan ve sıkışmış boncuklardan geçen sıvı akışı, DNA'yı B formuna (minimum kuvvet altında, yani 0 pN) uzatır ve nükleik asit siyah bir arka plana karşı beyaz bir ip olarak gözlenir. DNA molekülleri, reaksiyonların kontrollü bir şekilde başlatılmasını sağlamak için aşamayı akışa dik olarak çevirerek bir akıştan diğerine taşınır. Başarıya ulaşmak için, optik olarak berrak kanallara sahip mikroakışkan cihazlar, bir şırınga pompasında yerinde tutulan cam şırıngalarla eşleştirilir. Optimum sonuçlar, akış hücresine kalıcı olarak bağlanmış konektörler, mekanik olarak sert ve kimyasal olarak dayanıklı olan ve laminer akışı yasaklayan kabarcıkları ortadan kaldıran anahtarlama valflerine bağlı borular kullanır.

Tuzak hizalamasının ve mukavemetinin ilk testi 1 μm, floresan olmayan polistiren boncuklarla yapılır. Laboratuvarda yapılan araştırmaların çoğu floresan kullandığından, 1 μm, Dragon yeşil polistiren boncuklar kullanarak tuzak mukavemetini daha da test ediyoruz (Şekil 1D, E). Bundan sonra çalışma, DNA'nın bis-intercalating boya YOYO-114,29 ile boyandığı DNA-boncuk komplekslerinin optik yakalama...

Watch this Scientific Journal Video about Use of Dual Optical Tweezers and Microfluidics for Single-Molecule Studies at JoVE.com

Use of Dual Optical Tweezers and Microfluidics for Single-Molecule Studies

Mikroakışkan odalar aracılığıyla incelenen görsel, tek moleküllü biyokimya, cam varil, gaz geçirmez şırıngalar, boruların akış hücrelerine kararlı bağlantıları ve şırıngalar ve borular arasına anahtarlama valfleri yerleştirilerek kabarcıkların ortadan kaldırılması kullanılarak büyük ölçüde kolaylaştırılmıştır. Protokol, DNA işlemlerinin ve moleküller arası etkileşimlerin görselleştirilmesini sağlayan çift optik tuzakları tanımlar.

Tek Moleküllü Çalışmalarda Çift Optik Cımbız ve Mikroakışkan Kullanımı

Visual biochemistry is a powerful technique for observing the stochastic properties of single enzymes or enzyme complexes that are obscured in the ...

Portların borulu şırıngalarla çiftleşmek için bağlanması kritik öneme sahiptir, çünkü doğru yapıldığında, sızıntı yoktur, akış hücresinde kabarcık yoktur ve deneyler aynı akış hücresi kullanılarak bir yıllık bir süre boyunca tekrar tekrar yapılabilir. dikkatli kullanım. Burada, konektörleri akış hücrelerine bağlamak için iki basit yöntem sunulacaktır. Bunlar kolaydır, tekrarlanabilirler ve araştırmacının akış hücresini çok fazla sorun yaşamadan ihtiyaçlarına kolayca uyarlamasına izin verir.Bu akış hücrelerinin kullanımı, tek molekül deneyleri göz önünde bulundurularak yapıldı. Özellikle, görsel biyokimya dediğimiz şey, ancak mikroakışkanların gerekli olduğu herhangi bir çalışmada ve lamina sıvı akışının kullanılacağı durumlarda kullanılabilirler. Bu nedenle, hataları önlemek için, teknikleri oluşturmak için değerli akış hücreleri kullanmak yerine, önce bir cam slayt veya kapak kayması üzerinde pratik yapmanızı öneririm.Bu, cam veya PDMS malzemelerinin bunların nasıl ele alınacağını ve boru takarken veya konektörleri yapıştırırken ne kadar kuvvet uygulanacağını bilmesini sağlayacaktır. Bu, bazı konektörleri feda etmeyi gerektirecektir, ancak akış hücrelerinden çok daha ucuzdurlar. Akış hücresini temiz ve düz bir yüzeye yerleştirerek başlayın.PTFE borusunu forseps ile serbest uçtan üç milimetre tutun ve boruyu porta itin. Kalan bağlantı noktalarının her biri için bu yordamı yineleyin. Giriş portlarını şırınga pompasına ve çıkışı bir atık şişesine bağlayın.Her cam şırıngayı bir mililitre spektro fotometrik ile doldurun, metanolü derecelendirin ve bir anahtarlama valfine takın. Valfin çıkışının atığa yönlendirildiğinden emin olun ve her hattı 50 mikrolitre metanol ile temizleyin. Çıkış konumunu akış hücresine geçirin ve yüzeyleri ıslatmak ve kabarcıkları ortadan kaldırmak için akış hücresinden saatte 100 mikrolitre akış hızında 800 mikrolitre metanol pompalayın.Ertesi gün, 800 mikrolitre ultra saf su kullanarak bu işlemi tekrarlayın. Akış hücresi artık kullanıma hazırdır. Prese takılan boru konektörleri kullanılacaksa, yapışkan bandı konektörün bir tarafından dikkatlice çıkarın ve mikroskop slaytındaki deliğin üzerine yerleştirin.Birkaç saniye boyunca aşağı basın. Kalan konektörler için işlemi tekrarlayın. Ardından akış hücresini temiz ve düz bir yüzeye yerleştirin.PTFE borusunu serbest uçtan üç milimetre uzakta tutun ve boruyu porttaki deliğe itin. Kalan bağlantı noktalarının her biri için bu yordamı yineleyin. Boruları girişlerden anahtarlama valflerine takın.Yapıştırma işlemi sırasında akış hücresini ve konektörleri yerinde tutmak için ataşmanı temiz, düz bir yüzeye veya özel yapım bir manifolda yerleştirin. Akış hücresini manifoldun girintili bölümüne yerleştirin, ardından montajın altına az miktarda cam yapıştırıcı yerleştirin ve contayı yerleştirin. Nano portu mikroskop slaytındaki giriş deliklerinden birinin üzerine yerleştirin.Yanal hareket olmadan yavaşça aşağı doğru itin ve yerinde tutun. Kalan bağlantı noktaları için işlemi yineleyin. Manifoldda kurumaya veya kelepçelenmeye bırakın.Akış hücresini manifolddan yavaşça çıkarın ve montajların akış hücresindeki giriş portlarıyla iyi hizalandığından emin olun. Mikroskop aşamasına bir akış hücresi yerleştirin ve parmağınızı sıkıca geçiren konektörleri kullanarak boruyu takın. Her cam şırıngayı bir mililitre spektro fotometrik sınıf metanol ile doldurun.Her şırıngayı bir anahtarlama vanasına takın. Valfin çıkışının atığa yönlendirildiğinden emin olun ve her hattı 50 mikrolitre metanol ile temizleyin. Çıkış konumunu akış hücresine geçirin ve akış hücresinden saatte 100 mikrolitre akış hızında 800 mikrolitre metanol pompalayın.Ertesi gün, 800 mikrolitre ultra saf su kullanarak bu işlemi tekrarlayın. Güç çıkışının ölçümü burada gösterilmiştir. Lazerden gelen güç çıkışı, lazer kafasını optik düzene takmadan önce ölçülür.Tuzak hizalaması yapıldıktan sonra, ışın gücü her tuzak için 100 x hedefinden sonra ölçülür. Görüntüler, bir mikrometre floresan boncukların kararlı optik yakalamasını göstermektedir. Burada F sabit bir tuzaktır ve M mobil bir tuzaktır.Tarama modundaki mobil tuzak, 30 hertz'de küçük veya büyük bir daire boyunca hareket ederken. Akış hücresi içindeki sıvı akışı laminerdir. Şema, kanallar arası difüzyonun bitişik sıvı akışları arasındaki karıştırmanın ana kaynağı olduğunu göstermek için akış hücresini üstten gösterir.Mavi oklar akış yönünü gösterir ve tek tek akışlar renkli, beyaz, açık gri ve beyazdır. Kanallar arasındaki enine difüzyonun genişleyen bölgeleri kırmızı renkle gösterilir. İç kısım, alt akıştaki floresan etiketli DNA boncuk kompleksleri ve sadece üst akıştaki tamponlarla bitişik sıvı akışlarının 10 kat büyütmede floresan görüntüsünü gösterir.Üst akıştaki beyaz noktalar CCD kameradan gelen çekim gürültüsüdür. Akış profili ve laminer akış hücreleri paraboliktir. Akış hücresi yandan görüntülenir ve akışın yönü her hücrenin üzerinde gösterilir.Lineer boncuk hızı, pompa hızından ve sakkaroz konsantrasyonundan etkilenir. Bir boncuk üzerindeki karşıt kuvvet, çözelti viskozitesinden etkilenir. Boncuk çapı, akış altındaki boncuklar üzerindeki kuvveti etkiler.Bu prosedürü denerken, çalıştığınız alanın temiz olduğundan ve cam yüzeyleri spektrometrik sınıf metanol veya aseton ile temizlediğinizden emin olun. Bu aşamada, şırınga pompanıza yapılmış bir akış hücresine sahip olmalısınız ve artık çözümlerinizi tanıtmaya ve optik cımbız deneylerine başlamaya hazırsınız. Uzun süre kullanılabilen akış hücrelerinin kullanımı, araştırmacıların kuvvetlerin ölçüldüğü, reaksiyonların floresan veya her ikisinin bir kombinasyonu ile görselleştirildiği çeşitli tek moleküllü reaksiyonları araştırmalarını sağlamıştır.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

An Efficient Method for the Isolation of Highly Purified RNA from Seeds for Use in Quantitative Transcriptome Analysis

Kantitatif Transkriptom analizinde kullanım için tohumlar yüksek oranda saf RNA&#39;nın izolasyonu için etkili bir yöntem

Plant seeds accumulate large amounts of storage reserves comprising biodegradable organic matter. Humans rely on seed storage reserves for food and as ...

Biyokimya

High Precision FRET at Single-molecule Level for Biomolecule Structure Determination

Biyomolekül Yapısının Belirlenmesi İçin Tek Molekül Seviyesinde Yüksek Hassasiyetteki FRET

A protocol on how to perform high-precision interdye distance measurements using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) at the single-molecule ...

Single-molecule Manipulation of G-quadruplexes by Magnetic Tweezers

G-quadruplexes manyetik cımbız tarafından manipülasyon tek molekül

Non-canonical nucleic acid secondary structure G-quadruplexes (G4) are involved in diverse cellular processes, such as DNA replication, transcription, RNA ...

Covalent Immobilization of Proteins for the Single Molecule Force Spectroscopy

Proteinler kovalent immobilizasyon için tek molekül kuvvet spektroskopisi

In recent years, atomic force microscopy (AFM) based single molecule force spectroscopy (SMFS) extended our understanding of molecular properties and ...

Proteome-wide Quantification of Labeling Homogeneity at the Single Molecule Level

Proteom çapında Quantification maddelerinin homojenliği tek molekül düzeyinde etiketlenmesi

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a ...

Production of Dynein and Kinesin Motor Ensembles on DNA Origami Nanostructures for Single Molecule Observation

Tek Molekülgözlem için DNA Origami Nanoyapılar üzerinde Dynein ve Kinesin Motor Toplulukları üretimi

Cytoskeletal motors are responsible for a wide variety of functions in eukaryotic cells, including mitosis, cargo transport, cellular motility, and ...

OaAEP1-Mediated Enzymatic Synthesis and Immobilization of Polymerized Protein for Single-Molecule Force Spectroscopy

OaAEP1-Tek Moleküllü Kuvvet Spektroskopisi İçin Polimerize Proteinin Aracılı Enzimatik Sentezi ve Immobilizasyonu

Chemical and bio-conjugation techniques have been developed rapidly in recent years and allow the building of protein polymers. However, a controlled ...

Conventional BODIPY Conjugates for Live-Cell Super-Resolution Microscopy and Single-Molecule Tracking

Canlı Hücresüper çözünürlüklü mikroskopi ve Tek Moleküllü İzleme için Konvansiyonel BODIPY Konjugeleri

Single molecule localization microscopy (SMLM) techniques overcome the optical diffraction limit of conventional fluorescence microscopy and can resolve ...

Single Cell Analysis Of Transcriptionally Active Alleles By Single Molecule FISH

Transkripsiyonel Aktif Alellerin Tek Molekül FISH ile Tek Hücre Analizi

Gene transcription is an essential process in cell biology, and allows cells to interpret and respond to internal and external cues. Traditional bulk ...

Making Precise and Accurate Single-Molecule FRET Measurements using the Open-Source smfBox

Açık Kaynaklı smfBox kullanarak Hassas ve Doğru Tek Moleküllü FRET Ölçümleri Yapma

The smfBox is a recently developed cost-effective, open-source instrument for single-molecule F&#246;rster Resonance Energy Transfer (smFRET), which makes ...