Denne protokollen demonstrerer mekanisk forstyrrelse av sjøeleganer. I et 96-brønnformat som tillater middels gjennomstrømningskvantifisering av bakteriell belastning i individuelle ormer. Denne teknikken øker hastigheten og ensartetheten av mekanisk forstyrrelse sammenlignet med Pasel-baserte metoder, slik at forskere enkelt kan produsere større datasett av høykvalitets enkeltormmålinger.
Denne teknikken involverer mange bevegelige deler, og det er lett å miste plassen din. Forsikre deg om at du har alle materialer, merkede rør, buffere og plater satt opp før du begynner. Demonstrere prosedyren vil være Megan Taylor en forskningsspesialist leder fra laboratoriet mitt.
Begynn med å suspendere ormprøven i en milliliter M ni TX null en i et mikrosentrifugerør. Samle de voksne ormene ved sentrifugering og kast supernatanten. Bruk de samme sentrifugeringsparametrene.
Skyll ormene to ganger med en milliliter M9TX01 og en gang med en milliliter M9 ormbuffer, for å minimere de eksterne bakteriene. Deretter suspendere hver prøve i en milliliter S medium pluss to x varme drept OP50 i et kulturrør. Inkuber rørene ved 25 grader Celsius i 20 til 30 minutter for å passere de ikke-ad-vedlagte bakteriene fra tarmen.
Etter inkubasjon, skyll de rensede ormene to ganger med en milliliter kald M9TX01 og kast super natanten. Legg rørene på is i 10 minutter for å lamme ormene. Tilsett deretter en milliliter iskald M ni ormbuffer med uparfymert blekemiddel til hvert rør.
Inkuber rørene på is i minst 10 minutter for å drepe eksterne bakterier. Kast blekemiddelbufferen og returner rørene til isen for å forhindre at ormene pumper. Deretter legger du til en milliliter kald M9TX01 til hvert rør og sentrifuger i fem sekunder.
I en mini sentrifuge. Sett rørene tilbake til is og fjern supernatanten. Gjenta dette trinnet én gang.
For kjemisk permeabilisering av orm kutikula. Overfør rørene som inneholder ormene i 20 mikroliter buffer til et romtemperatur rørstativ. Tilsett deretter 100 mikroliter SDS / DTT-løsning til hver varm prøve.
Inkuber rørene i opptil åtte minutter på benken for delvis å bryte ned neglebåndet til de voksne ormene. På dette tidspunktet vil ormene dø og bosette seg på bunnen av røret. Etter inkubasjon, kast forsiktig SDS / DTT-supernatanten.
Deretter legger du til en milliliter M9TX01 til hvert rør og sentrifuger kort for å pelletere ormene. Kast supernatanten og heng ormene i en milliliter M ni ormbuffer med 0,1% Triton x-100. For å forberede seg på mekanisk forstyrrelse av ormer, oppnå en steril to milliliter dyp brønn 96 brønnplate og et silikonplatedeksel.
Bruk en steril scoop spatel for å legge til en liten mengde steril 36 grid silikonkarbid til hver brønn slik at rutenettet knapt dekker bunnen av brønnen. Tilsett 180 mikroliter M ni ormbuffer til hver brønn. Merk kolonnene og radene, og dekk deretter platen løst med silikonplatedekselet.
Deretter overfører du permeabiliserte ormer til en liten petriskål med M9TX01 fylt opp til en dybde på en centimeter. Ved hjelp av et dissekeringsmikroskop pipetter ut individuelle ormer i 20 mikroliter volumer og overfør dem til individuelle brønner på 96-brønnplaten for å kaste ut eventuelle ormer som sitter fast i pipetten, aspirer 20 mikroliter M9TX01 fra et klart område av petriskålen og slipp den tilbake i parabolen. Når alle ormer er overført, dekk til 96-brønnplaten med et ark fleksibel takfilm med papirbaksiden vendt ned på prøvebrønnene.
Plasser silikontakmatten lett på toppen av den fleksible takfilmen uten å trykke dekselet ned i brønnene. Plasser platen ved fire grader Celsius i 30 til 60 minutter for å forhindre overoppheting under forstyrrelse. Etter avkjøling presser du silikontakmatten godt ned i brønnene for å forsegle dem.
Fest deretter plater i vevsforstyrreren. Rist platene i ett minutt på 30 hertz. Roter deretter platene 180 grader og gjenta ristingen i ett minutt.
Trykk platene godt på benken to eller tre ganger for å løsne grus fra den fleksible takfilmen. Sentrifuge platen satt 2.400 ganger G i to minutter for å samle prøvene på bunnen av brønnene. Fjern deretter silikonlokket og trekk av takfilmen.
For å forberede ti ganger seriell fortynning av ormen fordøyer, fyll 180 mikroliter av en X PBS i rad B til D av en 96 brønnplate. Bruk en pipetter med flere brønner satt til 200 mikroliter, bland sakte ormfordøyelsen ved pipettering. Overfør maksimal mengde væske til rad A av 96-brønnplaten som inneholder PBS.
Bruk en flerkanalspipette, fjern 20 mikroliter fra den øverste raden og dispenser i rad B.Etterfulgt av blanding. Gjenta dette trinnet for rad B til C og deretter rad C til D for å få en 1000 ganger fortynning For bakteriell kvantifisering av monokoloniserte ormer. Plate 10 til 20 mikroliter av hver fortynning på faste agarplater.
For kolonisering av flere arter, plate 100 mikroliter av hver fortynning på 10 centimeter agarplater. Ved hjelp av denne protokollen ble effektiv ekstern sanitisering observert etter overflatebleking av kalde lammede ormer sett ved nedgangen av eksterne bakterier i buffer. Uten å påvirke tarmassosierte bakterier.
Manuell forstyrrelse av ormer resulterte i mer heterogenitet. Silikonkarbidkorn var ideell for forstyrrelser med eller uten Tri Andex. I 96-brønnmetoden var store glassperler ikke egnet for 96-brønnteknikken.
Små glassperler ga konsistente resultater, men tettet røret på spissen. Ormer kolonisert på samme basseng av bakterier viste høy variasjon i tarmbelastning når observert for individuelle bakterier og multi-arter bakteriesamfunn. Ormer kolonisert med bakterier som uttrykker GFP, viste heterogenitet i individuelle ormmålinger.
For denne GFP uttrykker bakteriestamme sammenligne kolonisering av vill type Bristol Len to ormer. For DAF viste to IGF-mutanter at DAF 16-mutanten støtter større populasjoner av bakterier, mens DAF to er resistente mot kolonisering. Denne heterogeniteten var karakteristisk og konsistent over forskjellige løp av samme eksperiment.
Resampling av data for å simulere batchfordøyelser ble funnet å endre fordelingen sammenlignet med individuelle ormdata. Den batch-ekstrapolerte CFU per orm var sentrert rundt det aritmetiske gjennomsnittet av de individuelle dataene som førte til tap av biologisk variasjon. I stedet for å fortsette å fordøye levende overflateblekemiddel og skylle ormer kan brukes til videre eksperimenter.
Bevegelsen vil fortsette raskt når ormer er fjernet fra kulde.