Name: using single-worm data to quantify heterogeneity in caenorhabditis elegans-bacterial interactions
Uploaded: 2022-07-22T14:20:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using Single-Worm Data to Quantify Heterogeneity in Caenorhabditis elegans-Bacterial Interactions at JoVE.com

Les auteurs tiennent à remercier H. Schulenberg et C. LaRock pour leur généreux partage des souches bactériennes utilisées dans ces expériences. Ce travail a été soutenu par un financement de l’Université Emory et de la NSF (PHY2014173).

Les vers utilisés dans ces expériences ont été obtenus auprès du Caenorhabditis Genetic Center, financé par le NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440). Bristol N2 est le type sauvage. Les mutants DAF-2/IGF daf-16(mu86) I (CGC CF1038) et daf-2(e1370) III (CGC CB1370) sont utilisés pour illustrer les différences de charge bactérienne intestinale.
HT115(DE3) E. coli portant le vecteur ARNi pos-1 provient de la bibliothèq...

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	<li>Armitage, D. W., Jones, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+sample+heterogeneity+can+obscure+the+signal+of+microbial+interactions.">How sample heterogeneity can obscure the signal of microbial interactions.</a> The ISME Journal. 13 (11), 2639-2646 (2019).</li><li>Stephenson, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+heterogeneity+affects+both+parasite+transmission+to+and+fitness+on+subsequent+hosts.">Host heterogeneity affects both parasite transmission to and fitness on subsequent hosts.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 372 (1719), 20160093 (2017).</li><li>VanderWaal, K. L., Ezenwa, V. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+in+pathogen+transmission:+mechanisms+and+methodology.">Heterogeneity in pathogen transmission: mechanisms and methodology.</a> Functional Ecology. 30 (10), 1606-1622 (2016).</li><li>Dwyer, G., Elkinton, J. S., Buonaccorsi, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+heterogeneity+in+susceptibility+and+disease+dynamics:+tests+of+a+mathematical+model.">Host heterogeneity in susceptibility and disease dynamics: tests of a mathematical model.</a> The American Naturalist. 150 (6), 685-707 (1997).</li><li>Wu, D., Rea, S. L., Yashin, A. I., Johnson, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+hidden+heterogeneity+in+isogenic+populations+of+C.+elegans.">Visualizing hidden heterogeneity in isogenic populations of C. elegans.</a> Experimental Gerontology. 41 (3), 261-270 (2006).</li><li>Yashin, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heat+shock+changes+the+heterogeneity+distribution+in+populations+of+Caenorhabditis+elegans+does+it+tell+us+anything+about+the+biological+mechanism+of+stress+response.">Heat shock changes the heterogeneity distribution in populations of Caenorhabditis elegans does it tell us anything about the biological mechanism of stress response.</a> The Journals of Gerontology Series A: Biological Sciences and Medical Sciences. 57 (3), 83-92 (2002).</li><li>Zhao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+forms+of+death+in+ageing+Caenorhabditis+elegans.">Two forms of death in ageing Caenorhabditis elegans.</a> Nature Communications. 8 (1), 1-8 (2017).</li><li>Eckley, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+characterization+of+the+transition+to+mid-life+in+Caenorhabditis+elegans.">Molecular characterization of the transition to mid-life in Caenorhabditis elegans.</a> AGE. 35 (3), 689-703 (2012).</li><li>Rea, S. L., Wu, D., Cypser, J. R., Vaupel, J. W., Johnson, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+stress-sensitive+reporter+predicts+longevity+in+isogenic+populations+of+Caenorhabditis+elegans.">A stress-sensitive reporter predicts longevity in isogenic populations of Caenorhabditis elegans.</a> Nature Genetics. 37 (8), 894-898 (2005).</li><li>Kinser, H. E., Mosley, M. C., Plutzer, I. B., Pincus, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global,+cell+non-autonomous+gene+regulation+drives+individual+lifespan+among+isogenic+C.+elegans.">Global, cell non-autonomous gene regulation drives individual lifespan among isogenic C. elegans.</a> eLife. , (2021).</li><li>Churgin, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Longitudinal+imaging+of+Caenorhabditis+elegans+in+a+microfabricated+device+reveals+variation+in+behavioral+decline+during+aging.">Longitudinal imaging of Caenorhabditis elegans in a microfabricated device reveals variation in behavioral decline during aging.</a> eLife. 6, 26652 (2017).</li><li>Perez, M. F., Francesconi, M., Hidalgo-Carcedo, C., Lehner, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maternal+age+generates+phenotypic+variation+in+Caenorhabditis+elegans.">Maternal age generates phenotypic variation in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 552 (7683), 106-109 (2017).</li><li>Baeriswyl, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+aging+profiles+in+isogenic+populations+of+Caenorhabditis+elegans+by+bacteria+causing+different+extrinsic+mortality+rates.">Modulation of aging profiles in isogenic populations of Caenorhabditis elegans by bacteria causing different extrinsic mortality rates.</a> Biogerontology. 11 (1), 53 (2009).</li><li>Taylor, M., Vega, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+immunity+alters+community+ecology+and+stability+of+the+microbiome+in+a+Caenorhabditis+elegans+model.">Host immunity alters community ecology and stability of the microbiome in a Caenorhabditis elegans model.</a> mSystems. 6 (2), 00608-00620 (2021).</li><li>Diaz, S. A., Restif, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spread+and+transmission+of+bacterial+pathogens+in+experimental+populations+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">Spread and transmission of bacterial pathogens in experimental populations of the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Applied and Environmental Microbiology. 80 (17), 5411-5418 (2014).</li><li>Twumasi-Boateng, K., Berg, M., Shapira, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+separation+of+C.+elegans+variably+colonized+by+a+bacterial+pathogen.">Automated separation of C. elegans variably colonized by a bacterial pathogen.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (85), e51090 (2014).</li><li>Ortiz, A., Vega, N. M., Ratzke, C., Gore, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interspecies+bacterial+competition+regulates+community+assembly+in+the+C.+elegans+intestine.">Interspecies bacterial competition regulates community assembly in the C. elegans intestine.</a> The ISME Journal. 15 (7), 2131-2145 (2021).</li><li>Berg, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGF&#946;/BMP+immune+signaling+affects+abundance+and+function+of+C.+elegans+gut+commensals.">TGF&#946;/BMP immune signaling affects abundance and function of C. elegans gut commensals.</a> Nature Communications. 10 (1), 604 (2019).</li><li>Portal-Celhay, C., Blaser, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Competition+and+resilience+between+founder+and+introduced+bacteria+in+the+Caenorhabditis+elegans+gut.">Competition and resilience between founder and introduced bacteria in the Caenorhabditis elegans gut.</a> Infection and Immunity. 80 (3), 1288-1299 (2012).</li><li>Scott, E., Holden-Dye, L., O'Connor, V., Wand, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intra+strain+variation+of+the+effects+of+gram-negative+ESKAPE+pathogens+on+intestinal+colonization,+host+viability,+and+host+response+in+the+model+organism+Caenorhabditis+elegans.">Intra strain variation of the effects of gram-negative ESKAPE pathogens on intestinal colonization, host viability, and host response in the model organism Caenorhabditis elegans.</a> Frontiers in Microbiology. 10, 3113 (2020).</li><li>Kamath, R. S., Martinez-Campos, M., Zipperlen, P., Fraser, A. G., Ahringer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effectiveness+of+specific+RNA-mediated+interference+through+ingested+double-stranded+RNA+in+Caenorhabditis+elegans.">Effectiveness of specific RNA-mediated interference through ingested double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.</a> Genome Biology. 2 (1), (2001).</li><li>Dirksen, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+native+microbiome+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans:+gateway+to+a+new+host-microbiome+model.">The native microbiome of the nematode Caenorhabditis elegans: gateway to a new host-microbiome model.</a> BMC Biology. 14, 38 (2016).</li><li>Vega, N. M., Allison, K. R., Samuels, A. N., Klempner, M. S., Collins, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salmonella+typhimurium+intercepts+Escherichia+coli+signaling+to+enhance+antibiotic+tolerance.">Salmonella typhimurium intercepts Escherichia coli signaling to enhance antibiotic tolerance.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (35), 14420-14425 (2013).</li><li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+C.+elegans.">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook. , (2006).</li><li>Tabara, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+rde-1+gene,+RNA+interference,+and+transposon+silencing+in+C.+elegans.">The rde-1 gene, RNA interference, and transposon silencing in C. elegans.</a> Cell. 99 (2), 123-132 (1999).</li><li>Ahringer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reverse+genetics.">Reverse genetics.</a> WormBook. , (2006).</li><li>Rual, J. -. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+improving+Caenorhabditis+elegans+phenome+mapping+with+an+ORFeome-based+RNAi+library.">Toward improving Caenorhabditis elegans phenome mapping with an ORFeome-based RNAi library.</a> Genome Research. 14 (10), 2162-2168 (2004).</li><li>Revtovich, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+characterization+of+high-throughput+Caenorhabditis+elegans+-+Enterococcus+faecium+infection+model.">Development and characterization of high-throughput Caenorhabditis elegans - Enterococcus faecium infection model.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 11, 667327 (2021).</li><li>Anderson, Q. L., Revtovich, A. V., Kirienko, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput,+high-content,+liquid-based+C.+elegans+pathosystem.">A high-throughput, high-content, liquid-based C. elegans pathosystem.</a> JoVE (Journal of Visualized Experiments. (137), e58068 (2018).</li><li>Scholz, M., Dinner, A. R., Levine, E., Biron, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stochastic+feeding+dynamics+arise+from+the+need+for+information+and+energy.">Stochastic feeding dynamics arise from the need for information and energy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (35), 9261-9266 (2017).</li><li>Wu, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pheromones+modulate+learning+by+regulating+the+balanced+signals+of+two+insulin-like+peptides.">Pheromones modulate learning by regulating the balanced signals of two insulin-like peptides.</a> Neuron. 104 (6), 1095-1109 (2019).</li><li>Ching, T. -. T., Hsu, A. -. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solid+plate-based+dietary+restriction+in+Caenorhabditis+elegans.">Solid plate-based dietary restriction in Caenorhabditis elegans.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (51), e2701 (2011).</li><li>Walker, A. C., Bhargava, R., Vaziriyan-Sani, A. S., Brust, A. S., Czyz, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+bacterial+loads+in+Caenorhabditis+elegans.">Quantification of bacterial loads in Caenorhabditis elegans.</a> Bio-protocol. 12 (2), 4291-4291 (2022).</li><li>Manjarrez, J. R., Mailler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress+and+timing+associated+with+Caenorhabditis+elegans+immobilization+methods.">Stress and timing associated with Caenorhabditis elegans immobilization methods.</a> Heliyon. 6 (7), 04263 (2020).</li><li>Zhang, S., Banerjee, D., Kuhn, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+larval+cells+from+C.+elegans.">Isolation and culture of larval cells from C. elegans.</a> PLoS ONE. 6 (4), 0019505 (2011).</li><li>Garsin, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-lived+C.+elegans+daf-2+mutants+are+resistant+to+bacterial+pathogens.">Long-lived C. elegans daf-2 mutants are resistant to bacterial pathogens.</a> Science. 300 (5627), 1921 (2003).</li><li>Thutupalli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Farming+and+public+goods+production+in+Caenorhabditis+elegans+populations.">Farming and public goods production in Caenorhabditis elegans populations.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (9), 2289-2294 (2017).</li><li>Ly, K., Reid, S. J., Snell, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+RNA+analysis+of+individual+Caenorhabditis+elegans.">Rapid RNA analysis of individual Caenorhabditis elegans.</a> MethodsX. 2, 59-63 (2015).</li><li>Johnke, J., Dirksen, P., Schulenburg, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Community+assembly+of+the+native+C.+elegans+microbiome+is+influenced+by+time,+substrate,+and+individual+bacterial+taxa.">Community assembly of the native C. elegans microbiome is influenced by time, substrate, and individual bacterial taxa.</a> Environmental Microbiology. 22 (4), 1265-1279 (2020).</li><li>Vega, N. M., Gore, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stochastic+assembly+produces+heterogeneous+communities+in+the+Caenorhabditis+elegans+intestine.">Stochastic assembly produces heterogeneous communities in the Caenorhabditis elegans intestine.</a> PLOS Biology. 15 (3), 2000633 (2017).</li><li>Gulyas, L., Powell, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cold+shock+induces+a+terminal+investment+reproductive+response+in+C.+elegans.">Cold shock induces a terminal investment reproductive response in C. elegans.</a> Scientific Reports. 12 (1), 1338 (2022).</li><li>Jiang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetic+program+mediates+cold-warming+response+and+promotes+stress-induced+phenoptosis+in+C.+elegans.">A genetic program mediates cold-warming response and promotes stress-induced phenoptosis in C. elegans.</a> eLife. 7, 35037 (2018).</li><li>Robinson, J. D., Powell, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+recovery+from+acute+cold+shock+in+Caenorhabditis+elegans.">Long-term recovery from acute cold shock in Caenorhabditis elegans.</a> BMC Cell Biology. 17 (1), 2 (2016).</li></ol>

Ici, des données sont présentées sur les avantages de la quantification par un seul ver de la charge bactérienne chez C. elegans, ainsi que sur un protocole de perturbation de 96 puits pour permettre l’acquisition rapide et cohérente de grands ensembles de données de ce type. Par rapport aux méthodes existantes33, ces protocoles permettent une mesure à plus haut débit des communautés microbiennes intestinales dans le ver.
Cette approche a le placage...

L’hétérogénéité des associations hôte-microbe est observée partout, et la variation entre les individus est de plus en plus reconnue comme un facteur contribuant aux processus au niveau de la population, de la compétition et de la coexistence1 à la transmission de la maladie 2,3,4. Chez C. elegans, une « hétérogénéité cachée » au sein des populations isogéniques a été observée à plusieurs reprises, avec des sous-populations d’individus présentant des phénotypes distincts dans la réponse au choc thermique 5,6, le vieillissement et la durée de vie 7,8,9,10,11, et de nombreux autres aspects de la physiologie et du développement12 . La plupart des analyses qui tentent d’identifier la structure des sous-populations fournissent des preuves de deux sous-populations dans des populations expérimentales de vers isogéniques synchronisés 5,7,8, bien que d’autres données suggèrent la possibilité de distributions de caractères au sein de la population plutôt que de groupes distincts 7,12,13 . Il est pertinent ici, une hétérogénéité substantielle dans les populations intestinales est observée même au sein de populations isogéniques de vers colonisés à partir d’une source partagée de microbes 13,14,15,16, et cette hétérogénéité peut être dissimulée par les mesures de digestion par lots qui sont largement utilisées 17,18,19,20 pour la quantification bactérienne chez le ver.
Ce travail présente des données suggérant la nécessité de s’appuyer davantage sur les mesures à un seul ver dans l’association hôte-microbe, ainsi que des protocoles pour augmenter la précision et le débit dans la perturbation d’un seul ver. Ces protocoles sont conçus pour faciliter la perturbation mécanique d’un grand nombre de C. elegans individuels pour la quantification de la charge bactérienne viable, tout en offrant une meilleure répétabilité et un effort par échantillon inférieur à celui des vers individuels à base de pilon. Une étape de purge intestinale recommandée, où les vers sont autorisés à se nourrir d’E. coli tué par la chaleur avant la préparation à la perturbation, est incluse pour minimiser les contributions des bactéries récemment ingérées et d’autres bactéries transitoires (non adhérentes). Ces protocoles comprennent une méthode de paralysie à froid pour nettoyer la cuticule avec un traitement à faible concentration d’eau de Javel de surface; Le blanchiment de surface peut être utilisé comme étape préparatoire à la perturbation d’un seul ver ou comme méthode de préparation de vers vivants, externes exempts de germes. Cette méthode de blanchiment de surface est suffisante pour éliminer un large éventail de microbes externes, et le traitement par le froid offre une alternative à la paralysie conventionnelle à base de lévamisole; alors que le lévamisole sera préféré pour les expériences sensibles au froid, la paralysie par le froid minimise les contributions aux flux de déchets dangereux et permet une reprise rapide de l’activité normale. Alors que le protocole complet décrit une expérience de laboratoire où les vers sont colonisés par des bactéries connues, les procédures de nettoyage des vers et de perturbation d’un seul ver peuvent facilement être appliquées aux vers isolés à partir d’échantillons sauvages ou colonisés dans des expériences de microcosme. Les protocoles décrits ici produisent des bactéries vivantes extraites de l’intestin du ver, adaptées au placage et à la quantification des unités formant des colonies (UFC) chez les vers individuels; pour l’analyse de la communauté intestinale basée sur le séquençage, des étapes ultérieures de lyse cellulaire et d’extraction des acides nucléiques doivent être ajoutées à ces protocoles.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>96-well flat-bottom polypropylene plates, 300 uL</td>
			<td>Evergreen Labware</td>
			<td>290-8350-03F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate sealing mat, silicon, square wells (AxyMat)</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>AM-2ML-SQ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plates, 2 mL, square wells</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>P-2ML-SQ-C-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well polypropylene plate lids</td>
			<td>Evergreen Labware</td>
			<td>290-8020-03L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>443570050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bead mill adapter set for 96-well plates</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>119900</td>
			<td>Adapter plates for use with two 96-well plates on the TissueLyser II</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bead mill tissue homogenizer (TissueLyser II)</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>85300</td>
			<td>Mechanical homogenizer for medium to high-throughput sample disruption</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioSorter</td>
			<td>Union Biometrica</td>
			<td>By quotation</td>
			<td>Large object sorter equipped with a 250 micron focus for C. elegans</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bleach, commercial, 8.25% sodium hypochlorite</td>
			<td>Clorox</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Breathe-Easy 96-well gas permeable sealing membrane</td>
			<td>Diversified Biotech</td>
			<td>BEM-1</td>
			<td>Multiwell plate gas permeable polyurethane membranes. Thin sealing film is permeable to O2, CO2, and water vapors and is UV transparent down to 300 nm. Sterile, 100/box.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride dihydrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC423525000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>AAA11470-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citric acid monohydrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC124910010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper (II) sulfate pentahydrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC197722500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 6765 LSE Mini Microcentrifuge</td>
			<td>Corning</td>
			<td>&#160;COR-6765</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disodium EDTA</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>409971000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL 1,4 Dithiothreitol, 99+%, for mol biology, DNAse, RNAse and Protease free, ACROS Organics</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>327190010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf 1.5 mL microcentrifuge tubes, natural</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf 5424R microcentrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5406000640</td>
			<td>24-place refrigerated benchtop microcentrifuge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf 5810R centrifuge with rotor S-4-104</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22627040</td>
			<td>3L benchtop centrifuge with adaptors for 15-50 mL tubes and plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf plate bucket (x2), for Rotor S-4-104</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22638930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 100%</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP2818500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass beads, 2.7 mm</td>
			<td>Life Science Products</td>
			<td>LS-79127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass beads, acid-washed, 425-600 &#181;m</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G877-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass plating beads</td>
			<td>VWR</td>
			<td>76005-124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH7204-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iron (II) sulfate heptahydrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>423731000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimble Kontes pellet pestle motor</td>
			<td>DWK Life Sciences</td>
			<td>749540-0000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimble Kontes polypropylene pellet pestles and microtubes, 0.5 mL</td>
			<td>DWK Life Sciences</td>
			<td>749520-0590</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica DMi8 motorized inverted microscope with motorized stage</td>
			<td>Leica</td>
			<td>11889113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica LAS X Premium software</td>
			<td>Leica</td>
			<td>11640687</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate heptahydrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC124900010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manganese(II) chloride tetrahydrate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>470301-706</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PARAFILM M flexible laboratory sealing film</td>
			<td>Amcor</td>
			<td>PM996</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptone</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1420-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes, round, 10 cm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25384-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes, round, 6 cm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25384-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes, square, 10 x 10 cm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10799-140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phospho-buffered saline (1X PBS)</td>
			<td>Gold Bio</td>
			<td>P-271-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene autoclave tray, shallow</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-361-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium hydroxide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC134062500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate dibasic</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP363-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP362-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R 4.1.3/RStudio 2022.02.0 build 443</td>
			<td>R Foundation</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scoop-type laboratory spatula, metal</td>
			<td>VWR</td>
			<td>470149-438</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon carbide 36 grit</td>
			<td>MJR Tumblers</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Black extra coarse silicon carbide grit. Available in 0.5-5 lb sizes from this vendor.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP166-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH7247-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic anhydrous</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP332-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodum chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP358-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC419760010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tri-potassium citrate monohydrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC611755000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP151-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zinc sulfate heptahydrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC205982500</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using single-worm data to quantify heterogeneity in caenorhabditis elegans-bacterial interactions

Le nématode Caenorhabditis elegans est un système modèle pour les interactions hôte-microbe et hôte-microbiome. À ce jour, de nombreuses études utilisent des digestes par lots plutôt que des échantillons individuels de vers pour quantifier la charge bactérienne dans cet organisme. Ici, il est soutenu que la grande variabilité interindividuelle observée dans la colonisation bactérienne de l’intestin de C. elegans est informative et que les méthodes de digestion par lots rejettent les informations importantes pour une comparaison précise entre les conditions. Comme la description de la variation inhérente à ces échantillons nécessite un grand nombre d’individus, un protocole pratique de plaque de 96 puits pour la perturbation et le placage des colonies de vers individuels est établi.

Stérilisation à l’eau de Javel des vers vivants Les vers blanchis en surface sont effectivement exempts de bactéries externes jusqu’à ce que la motilité revienne et que l’excrétion reprenne. Dans les conditions utilisées ici, on observe une extinction rapide des bactéries dans le tampon (Figure 1A-C, Figure supplémentaire 2, Vidéo 1) sans perturber les bactéries associées à l’intestin chez les vers paralysés par le f...

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Using Single-Worm Data to Quantify Heterogeneity in Caenorhabditis elegans-Bacterial Interactions

Ce protocole décrit une perturbation de 96 puits de Caenorhabditis elegans colonisés par des bactéries individuelles à la suite d’une paralysie par le froid et d’un blanchiment de surface pour éliminer les bactéries externes. La suspension résultante est plaquée sur des plaques de gélose pour permettre une quantification précise et à débit moyen de la charge bactérienne dans un grand nombre de vers individuels.

Utilisation de données à un seul ver pour quantifier l’hétérogénéité dans les interactions caenorhabditis elegans-bactériennes

The nematode Caenorhabditis elegans is a model system for host-microbe and host-microbiome interactions. Many studies to date use batch digests rather ...

Ce protocole démontre la perturbation mécanique des elegans de mer. Dans un format de 96 puits permettant une quantification à débit moyen de la charge bactérienne dans les vers individuels. Cette technique augmente la vitesse et l’uniformité de la perturbation mécanique par rapport aux méthodes basées sur Pasel, ce qui permet aux chercheurs de produire facilement de plus grands ensembles de données de mesures de haute qualité sur un seul ver.Cette technique implique de nombreuses pièces mobiles et il est facile de perdre votre place. Assurez-vous d’avoir tous les matériaux, tubes étiquetés, tampons et plaques installés avant de commencer. La démonstration de la procédure sera assurée par Megan Taylor, une spécialiste de la recherche responsable de mon laboratoire.Commencez par remettre en suspension l’échantillon de vis sans fin dans un millilitre de M neuf TX zéro un dans un tube microcentrifugé. Recueillir les vers adultes par centrifugation et jeter le surnageant. En utilisant les mêmes paramètres de centrifugation.Rincez les vers deux fois avec un millilitre de M9TX01 et une fois avec un millilitre de tampon de ver M9, pour minimiser les bactéries externes. Ensuite, remettre en suspension chaque échantillon dans un millilitre de milieu S plus deux x OP50 tué par la chaleur dans un tube de culture. Incuber les tubes à 25 degrés Celsius pendant 20 à 30 minutes pour évacuer les bactéries non adhérées à la MA de l’intestin.Après l’incubation, rincer les vers purgés deux fois avec un millilitre de M9TX01 froid et jeter le super natant. Mettez les tubes sur de la glace pendant 10 minutes pour paralyser les vers. Ajoutez ensuite un millilitre de tampon de vers M neuf glacés avec de l’eau de Javel non parfumée à chaque tube.Incuber les tubes sur de la glace pendant au moins 10 minutes pour tuer les bactéries externes. Jetez le tampon d’eau de Javel et remettez les tubes dans la glace pour empêcher les vers de pomper. Ensuite, ajoutez un millilitre de M9TX01 froid à chaque tube et centrifugez pendant cinq secondes.Dans une mini centrifugeuse. Remettez les tubes sur la glace et retirez le surnageant. Répétez cette étape une fois.Pour la perméabilisation chimique de la cuticule du vers. Transférer les tubes contenant les vers dans 20 microlitres de tampon dans une grille à tubes à température ambiante. Ajoutez ensuite 100 microlitres de solution SDS/DTT à chaque échantillon chaud.Incuber les tubes jusqu’à huit minutes sur le banc pour décomposer partiellement la cuticule des vers adultes. À ce stade, les vers mourront et s’installeront au fond du tube. Après l’incubation, jetez soigneusement le surnageant SDS/DTT.Ensuite, ajoutez un millilitre de M9TX01 à chaque tube et centrifugez brièvement pour enduire les vers. Jeter le surnageant et remettre les vers en suspension dans un tampon de neuf vers M d’un millilitre avec 0,1% Triton x-100. Pour vous préparer à la perturbation mécanique des vers, procurez-vous une plaque stérile de puits 96 de deux millilitres de profondeur et un couvercle de plaque de silicone.Utilisez une spatule à cuillère stérile pour ajouter une petite quantité de carbure de silicone stérile à grille 36 à chaque puits, de sorte que la grille recouvre à peine le fond du puits. Ajouter 180 microlitres de tampon de vers M nine à chaque puits. Étiquetez les colonnes et les rangées, puis couvrez la plaque lâchement avec le couvercle de la plaque en silicone.Ensuite, transférez les vers perméabilisés dans une petite boîte de Petri remplie de M9TX01 jusqu’à une profondeur d’un centimètre. À l’aide d’une pipette de microscope disséquante, éliminez les vers individuels dans des volumes de 20 microlitres et transférez-les dans des puits individuels de la plaque de 96 puits pour éjecter tous les vers collés à la pipette, aspirez 20 microlitres de M9TX01 d’une zone dégagée de la boîte de Petri et relâchez-le dans la parabole. Une fois tous les vers transférés, recouvrez la plaque de 96 puits avec une feuille de film de plafond flexible avec le côté du dos en papier vers le bas sur les puits d’échantillonnage.Placez légèrement le tapis de plafond en silicone sur le film de plafond flexible sans appuyer sur le couvercle dans les puits. Placez la plaque à quatre degrés Celsius pendant 30 à 60 minutes pour éviter la surchauffe pendant les perturbations. Après avoir refroidi la plaque, appuyez fermement sur le tapis de plafond en silicone dans les puits pour les sceller.Ensuite, fixez les plaques dans le perturbateur tissulaire. Secouez les assiettes pendant une minute à 30 hertz. Ensuite, faites pivoter les plaques de 180 degrés et répétez les secousses pendant une minute.Tapotez fermement les plaques sur le banc deux ou trois fois pour déloger tout grain du film flexible du plafond. Centrifuger la plaque réglée 2 400 fois G pendant deux minutes pour prélever les échantillons au fond des puits. Ensuite, retirez le couvercle en silicone et retirez le film de plafond.Pour préparer une dilution en série décuplée des digestions de vers, remplir 180 microlitres d’un X PBS dans les rangées B à D d’une plaque de 96 puits. À l’aide d’un pipeter multipuits réglé à 200 microlitres, mélangez lentement la digestion du ver par pipetage. Transférer la quantité maximale de liquide à la rangée A de la plaque de 96 puits contenant du PBS.À l’aide d’une pipette multicanal, retirer 20 microlitres de la rangée supérieure et distribuer dans la rangée B.Suivi d’un mélange. Répétez cette étape pour la rangée B à C, puis la ligne C à D pour obtenir une dilution de 1000 fois Pour la quantification bactérienne des vers monocolonisés. Plaquette 10 à 20 microlitres de chaque dilution sur gélose solide.Pour la colonisation multi-espèces, plaquez 100 microlitres de chaque dilution sur des plaques de gélose de 10 centimètres. À l’aide de ce protocole, une désinfection externe efficace a été observée après le blanchiment de surface des vers paralysés à froid, comme en témoigne le déclin des bactéries externes dans le tampon. Sans affecter les bactéries associées à l’intestin.La perturbation manuelle des vers a entraîné une plus grande hétérogénéité. Le grain en carbure de silicone était idéal pour les perturbations avec ou sans Tri Andex. Dans la méthode des 96 puits, les grosses billes de verre ne convenaient pas à la technique des 96 puits.Les petites perles de verre produisaient des résultats cohérents, mais obstruaient le tuyau à l’extrémité. Les vers colonisés sur le même groupe de bactéries ont montré une forte variation de la charge intestinale lorsqu’ils ont été observés pour des bactéries individuelles et des communautés bactériennes multi-espèces. Les vers colonisés par des bactéries exprimant la GFP ont montré une hétérogénéité dans les mesures individuelles des vers.Pour cette souche bactérienne exprimant GFP comparant la colonisation de type sauvage Bristol Len deux vers. Pour DAF, deux mutants IGF ont montré que le mutant DAF 16 soutient de plus grandes populations de bactéries, tandis que DAF deux est résistant à la colonisation. Cette hétérogénéité était caractéristique et constante au cours des différentes séries d’une même expérience.On a constaté que le rééchantillonnage des données pour simuler les résumés par lots modifiait la distribution par rapport aux données individuelles sur les vers. Le lot extrapolé UFC par ver était centré autour de la moyenne arithmétique des données individuelles, ce qui entraînait une perte de variation biologique. Au lieu de procéder à la digestion de l’eau de Javel et de rinçage de surface vivante, les vers peuvent être utilisés pour d’autres expériences.Le mouvement reprendra rapidement une fois que les vers seront retirés du froid.

Research

JoVE Journal

Biology

Using Single-Worm Data to Quantify Heterogeneity in Caenorhabditis elegans-Bacterial Interactions

Analysis of Schwann-astrocyte Interactions Using In Vitro Assays

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