Name: using single-worm data to quantify heterogeneity in caenorhabditis elegans-bacterial interactions
Uploaded: 2022-07-22T14:20:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using Single-Worm Data to Quantify Heterogeneity in Caenorhabditis elegans-Bacterial Interactions at JoVE.com

Gli autori vorrebbero ringraziare H. Schulenberg e C. LaRock per la loro generosa condivisione di ceppi batterici utilizzati in questi esperimenti. Questo lavoro è stato supportato da finanziamenti della Emory University e NSF (PHY2014173).

I vermi utilizzati in questi esperimenti sono stati ottenuti dal Caenorhabditis Genetic Center, che è finanziato dal NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440). Bristol N2 è il wild-type. I mutanti DAF-2/IGF daf-16(mu86) I (CGC CF1038) e daf-2(e1370) III (CGC CB1370) sono usati per illustrare le differenze nella carica batterica intestinale.
HT115(DE3) E. coli che trasporta il vettore pos-1 RNAi proviene dalla libreria Ahringer<...

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	<li>Armitage, D. W., Jones, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+sample+heterogeneity+can+obscure+the+signal+of+microbial+interactions.">How sample heterogeneity can obscure the signal of microbial interactions.</a> The ISME Journal. 13 (11), 2639-2646 (2019).</li><li>Stephenson, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+heterogeneity+affects+both+parasite+transmission+to+and+fitness+on+subsequent+hosts.">Host heterogeneity affects both parasite transmission to and fitness on subsequent hosts.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 372 (1719), 20160093 (2017).</li><li>VanderWaal, K. L., Ezenwa, V. 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V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput,+high-content,+liquid-based+C.+elegans+pathosystem.">A high-throughput, high-content, liquid-based C. elegans pathosystem.</a> JoVE (Journal of Visualized Experiments. (137), e58068 (2018).</li><li>Scholz, M., Dinner, A. R., Levine, E., Biron, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stochastic+feeding+dynamics+arise+from+the+need+for+information+and+energy.">Stochastic feeding dynamics arise from the need for information and energy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (35), 9261-9266 (2017).</li><li>Wu, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pheromones+modulate+learning+by+regulating+the+balanced+signals+of+two+insulin-like+peptides.">Pheromones modulate learning by regulating the balanced signals of two insulin-like peptides.</a> Neuron. 104 (6), 1095-1109 (2019).</li><li>Ching, T. -. T., Hsu, A. -. 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R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cold+shock+induces+a+terminal+investment+reproductive+response+in+C.+elegans.">Cold shock induces a terminal investment reproductive response in C. elegans.</a> Scientific Reports. 12 (1), 1338 (2022).</li><li>Jiang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetic+program+mediates+cold-warming+response+and+promotes+stress-induced+phenoptosis+in+C.+elegans.">A genetic program mediates cold-warming response and promotes stress-induced phenoptosis in C. elegans.</a> eLife. 7, 35037 (2018).</li><li>Robinson, J. D., Powell, J. 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Qui vengono presentati i dati sui vantaggi della quantificazione a verme singolo della carica batterica in C. elegans, insieme a un protocollo di interruzione a 96 pozzi per consentire l'acquisizione rapida e coerente di grandi set di dati di questo tipo. Rispetto ai metodi esistenti33, questi protocolli consentono una misurazione a più alto rendimento delle comunità microbiche intestinali nel verme.
Questo approccio ha la placcatura come un passaggio limitan...

L'eterogeneità nelle associazioni ospite-microbo è osservata ovunque e la variazione tra gli individui è sempre più riconosciuta come un fattore che contribuisce ai processi a livello di popolazione dalla competizione e coesistenza1 alla trasmissione della malattia 2,3,4. In C. elegans, "eterogeneità nascosta" all'interno di popolazioni isogeniche è stata osservata ripetutamente, con sottopopolazioni di individui che mostrano fenotipi distinti nella risposta allo shock termico 5,6, invecchiamento e durata della vita 7,8,9,10,11 e molti altri aspetti della fisiologia e dello sviluppo12 . La maggior parte delle analisi che tentano di identificare la struttura della sottopopolazione forniscono prove di due sottopopolazioni in popolazioni sperimentali di vermi isogenici e sincronizzati 5,7,8, sebbene altri dati suggeriscano la possibilità di distribuzioni all'interno della popolazione di tratti piuttosto che gruppi distinti 7,12,13 . Di rilevanza qui, l'eterogeneità sostanziale nelle popolazioni intestinali è osservata anche all'interno di popolazioni isogeniche di vermi colonizzati da una fonte condivisa di microbi 13,14,15,16, e questa eterogeneità può essere nascosta dalle misurazioni del digest batch che sono ampiamente utilizzate 17,18,19,20 per la quantificazione batterica nel verme.
Questo lavoro presenta dati che suggeriscono la necessità di una maggiore dipendenza dalle misurazioni a singolo worm nell'associazione ospite-microbo, nonché dai protocolli per aumentare l'accuratezza e il throughput nell'interruzione del singolo worm. Questi protocolli sono progettati per facilitare l'interruzione meccanica di un gran numero di singoli C. elegans per la quantificazione della carica batterica vitale, fornendo al contempo una migliore ripetibilità e uno sforzo inferiore per campione rispetto all'interruzione basata sui parassiti dei singoli vermi. Una fase raccomandata di spurgo intestinale, in cui i vermi sono autorizzati a nutrirsi di E. coli ucciso dal calore prima della preparazione per l'interruzione, è inclusa per ridurre al minimo i contributi di batteri recentemente ingeriti e altri batteri transitori (non aderenti). Questi protocolli includono un metodo di paralisi a freddo per la pulizia della cuticola con un trattamento di candeggina superficiale a bassa concentrazione; lo sbiancamento superficiale può essere utilizzato come fase preparatoria nella distruzione di un singolo verme o come metodo per preparare vermi vivi e privi di germi esternamente. Questo metodo di sbiancamento superficiale è sufficiente per rimuovere una vasta gamma di microbi esterni e il trattamento a freddo fornisce un'alternativa alla paralisi convenzionale basata sul levamisolo; mentre il levamisolo sarà preferito per gli esperimenti sensibili al freddo, la paralisi a freddo riduce al minimo i contributi ai flussi di rifiuti pericolosi e consente una rapida ripresa della normale attività. Mentre il protocollo completo descrive un esperimento di laboratorio in cui i vermi sono colonizzati con batteri noti, le procedure per la pulizia dei vermi e l'interruzione del verme singolo possono essere prontamente applicate a vermi isolati da campioni selvatici o colonizzati in esperimenti di microcosmo. I protocolli qui descritti producono batteri vivi estratti dall'intestino del verme, adatti per la placcatura e la quantificazione di unità formanti colonie (CFU) in singoli vermi; per l'analisi della comunità intestinale basata sul sequenziamento, a questi protocolli devono essere aggiunte successive fasi di lisi cellulare e di estrazione dell'acido nucleico.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>96-well flat-bottom polypropylene plates, 300 uL</td>
			<td>Evergreen Labware</td>
			<td>290-8350-03F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate sealing mat, silicon, square wells (AxyMat)</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>AM-2ML-SQ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plates, 2 mL, square wells</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>P-2ML-SQ-C-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well polypropylene plate lids</td>
			<td>Evergreen Labware</td>
			<td>290-8020-03L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>443570050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bead mill adapter set for 96-well plates</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>119900</td>
			<td>Adapter plates for use with two 96-well plates on the TissueLyser II</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bead mill tissue homogenizer (TissueLyser II)</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>85300</td>
			<td>Mechanical homogenizer for medium to high-throughput sample disruption</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioSorter</td>
			<td>Union Biometrica</td>
			<td>By quotation</td>
			<td>Large object sorter equipped with a 250 micron focus for C. elegans</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bleach, commercial, 8.25% sodium hypochlorite</td>
			<td>Clorox</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Breathe-Easy 96-well gas permeable sealing membrane</td>
			<td>Diversified Biotech</td>
			<td>BEM-1</td>
			<td>Multiwell plate gas permeable polyurethane membranes. Thin sealing film is permeable to O2, CO2, and water vapors and is UV transparent down to 300 nm. Sterile, 100/box.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride dihydrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC423525000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>AAA11470-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citric acid monohydrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC124910010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper (II) sulfate pentahydrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC197722500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 6765 LSE Mini Microcentrifuge</td>
			<td>Corning</td>
			<td>&#160;COR-6765</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disodium EDTA</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>409971000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL 1,4 Dithiothreitol, 99+%, for mol biology, DNAse, RNAse and Protease free, ACROS Organics</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>327190010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf 1.5 mL microcentrifuge tubes, natural</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf 5424R microcentrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5406000640</td>
			<td>24-place refrigerated benchtop microcentrifuge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf 5810R centrifuge with rotor S-4-104</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22627040</td>
			<td>3L benchtop centrifuge with adaptors for 15-50 mL tubes and plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf plate bucket (x2), for Rotor S-4-104</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22638930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 100%</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP2818500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass beads, 2.7 mm</td>
			<td>Life Science Products</td>
			<td>LS-79127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass beads, acid-washed, 425-600 &#181;m</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G877-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass plating beads</td>
			<td>VWR</td>
			<td>76005-124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH7204-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iron (II) sulfate heptahydrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>423731000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimble Kontes pellet pestle motor</td>
			<td>DWK Life Sciences</td>
			<td>749540-0000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimble Kontes polypropylene pellet pestles and microtubes, 0.5 mL</td>
			<td>DWK Life Sciences</td>
			<td>749520-0590</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica DMi8 motorized inverted microscope with motorized stage</td>
			<td>Leica</td>
			<td>11889113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica LAS X Premium software</td>
			<td>Leica</td>
			<td>11640687</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate heptahydrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC124900010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manganese(II) chloride tetrahydrate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>470301-706</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PARAFILM M flexible laboratory sealing film</td>
			<td>Amcor</td>
			<td>PM996</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptone</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1420-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes, round, 10 cm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25384-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes, round, 6 cm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25384-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes, square, 10 x 10 cm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10799-140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phospho-buffered saline (1X PBS)</td>
			<td>Gold Bio</td>
			<td>P-271-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene autoclave tray, shallow</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-361-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium hydroxide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC134062500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate dibasic</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP363-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP362-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R 4.1.3/RStudio 2022.02.0 build 443</td>
			<td>R Foundation</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scoop-type laboratory spatula, metal</td>
			<td>VWR</td>
			<td>470149-438</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon carbide 36 grit</td>
			<td>MJR Tumblers</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Black extra coarse silicon carbide grit. Available in 0.5-5 lb sizes from this vendor.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP166-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH7247-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic anhydrous</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP332-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodum chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP358-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC419760010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tri-potassium citrate monohydrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC611755000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP151-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zinc sulfate heptahydrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC205982500</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using single-worm data to quantify heterogeneity in caenorhabditis elegans-bacterial interactions

Il nematode Caenorhabditis elegans è un sistema modello per le interazioni ospite-microbo e ospite-microbioma. Molti studi fino ad oggi utilizzano digest batch piuttosto che singoli campioni di vermi per quantificare la carica batterica in questo organismo. Qui si sostiene che la grande variabilità inter-individuale osservata nella colonizzazione batterica dell'intestino di C. elegans è informativa e che i metodi di digestione batch scartano le informazioni che sono importanti per un confronto accurato tra le condizioni. Poiché la descrizione della variazione inerente a questi campioni richiede un gran numero di individui, viene stabilito un comodo protocollo a piastre a 96 pozzetti per l'interruzione e la placcatura della colonia di singoli vermi.

Sterilizzazione con candeggina di vermi vivi I vermi sbiancati in superficie sono effettivamente privi di batteri esterni fino a quando la motilità ritorna e l'escrezione riprende. Nelle condizioni qui utilizzate, si osserva una rapida estinzione dei batteri nel tampone (Figura 1A-C, Figura supplementare 2, Video 1) senza disturbare i batteri associati all'intestino nei vermi paralizzati dal freddo (Figura 1D-F</stro...

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Using Single-Worm Data to Quantify Heterogeneity in Caenorhabditis elegans-Bacterial Interactions

Questo protocollo descrive un'interruzione di 96 pozzi di singole Caenorhabditis elegans colonizzate battericamente a seguito di paralisi fredda e sbiancamento superficiale per rimuovere i batteri esterni. La sospensione risultante è placcata su piastre di agar per consentire una quantificazione accurata e di media produttività della carica batterica in un gran numero di singoli vermi.

Utilizzo di dati single-worm per quantificare l'eterogeneità nelle interazioni caenorhabditis elegans-batteriche

The nematode Caenorhabditis elegans is a model system for host-microbe and host-microbiome interactions. Many studies to date use batch digests rather ...

Questo protocollo dimostra l'interruzione meccanica degli elegans marini. In un formato a 96 pozzetti che consente la quantificazione della carica batterica nei singoli vermi. Questa tecnica aumenta la velocità e l'uniformità della rottura meccanica rispetto ai metodi basati su Pasel consentendo ai ricercatori di produrre facilmente set di dati più grandi di misurazioni di singoli vermi di alta qualità.Questa tecnica coinvolge molte parti mobili ed è facile perdere il posto. Assicurati di avere tutti i materiali, i tubi etichettati, i tamponi e le piastre impostati prima di iniziare. A dimostrare la procedura sarà Megan Taylor, specialista di ricerca del mio laboratorio.Iniziare risospendendo il campione di vite senza fine in un millilitro di M nove TX zero uno in una provetta da microcentrifuga. Raccogliere i vermi adulti mediante centrifugazione e scartare il surnatante. Utilizzando gli stessi parametri di centrifugazione.Risciacquare i vermi due volte con un millilitro di M9TX01 e una volta con un millilitro di tampone per vermi M9, per ridurre al minimo i batteri esterni. Quindi, risospendere ogni campione in un millilitro di mezzo S più due x OP50 ucciso dal calore in una provetta di coltura. Incubare i tubi a 25 gradi Celsius per 20-30 minuti per passare i batteri non aderenti dall'intestino.Dopo l'incubazione, sciacquare i vermi spurgati due volte con un millilitro di M9TX01 freddo e scartare il super natante. Metti i tubi sul ghiaccio per 10 minuti per paralizzare i vermi. Quindi aggiungere un millilitro di tampone per vermi M nine ghiacciato con candeggina non profumata a ciascun tubo.Incubare i tubi sul ghiaccio per un minimo di 10 minuti per uccidere i batteri esterni. Scartare il tampone di candeggina e riportare i tubi nel ghiaccio per evitare che i vermi. Quindi, aggiungere un millilitro di M9TX01 freddo a ciascun tubo e centrifugare per cinque secondi.In una mini centrifuga. Riportare i tubi sul ghiaccio e rimuovere il surnatante. Ripetere questo passaggio una volta.Per la permeabilizzazione chimica della cuticola del verme. Trasferire i tubi contenenti i vermi in 20 microlitri di tampone in un rack di tubi a temperatura ambiente. Quindi aggiungere 100 microlitri di soluzione SDS/DTT a ciascun campione caldo.Incubare i tubi per un massimo di otto minuti sulla panchina per abbattere parzialmente la cuticola dei vermi adulti. A questo punto, i vermi moriranno e si depositeranno sul fondo del tubo. Dopo l'incubazione, gettare con cautela il surnatante SDS/DTT.Quindi, aggiungere un millilitro di M9TX01 a ciascun tubo e centrifugare brevemente per pellettare i vermi. Scartare il surnatante e risospendere i worm in un millilitro di tampone M nove worm con 0,1% Triton x-100. Per prepararsi alla rottura meccanica dei vermi, ottenere una piastra sterile profonda due millilitri fino a 96 pozzetti e un coperchio della piastra in silicone.Utilizzare una spatola sterile per aggiungere una piccola quantità di carburo di silicone sterile a griglia 36 a ciascun pozzetto in modo tale che la griglia copra a malapena il fondo del pozzetto. Aggiungere 180 microlitri di tampone senza fine M nove a ciascun pozzetto. Etichettare le colonne e le righe e quindi coprire la piastra liberamente con il coperchio della piastra di silicone.Quindi, trasferire i vermi permeabilizzati in una piccola capsula di Petri con M9TX01 riempito fino a una profondità di un centimetro. Utilizzando un microscopio da dissezione pipetta i singoli vermi in volumi da 20 microlitri e trasferirli nei singoli pozzetti della piastra del pozzetto 96 per espellere eventuali vermi attaccati alla pipetta, aspirare 20 microlitri di M9TX01 da un'area libera della capsula di Petri e rilasciarlo nel piatto. Una volta trasferiti tutti i vermi, coprire la piastra da 96 pozzetti con un foglio di pellicola flessibile per soffitti con il lato posteriore di carta rivolto verso il basso sui pozzetti del campione.Posizionare leggermente il tappetino in silicone sopra la pellicola flessibile del soffitto senza premere il coperchio verso il basso nei pozzetti. Posizionare la piastra a quattro gradi Celsius per 30-60 minuti per evitare il surriscaldamento durante l'interruzione. Dopo aver raffreddato la piastra, premere saldamente il tappetino in silicone nei pozzetti per sigillarli.Quindi fissare le piastre nel disgregatore tissutale. Agitare le piastre per un minuto a 30 hertz. Quindi ruotare le piastre di 180 gradi e ripetere l'agitazione per un minuto.Picchiettare saldamente le piastre sul banco due o tre volte per rimuovere la graniglia dalla pellicola flessibile del soffitto. Centrifugare il set di piastre 2.400 volte G per due minuti per raccogliere i campioni sul fondo dei pozzetti. Quindi rimuovere il coperchio in silicone e rimuovere la pellicola del soffitto.Per preparare una diluizione seriale decuplicata dei digest del verme, riempire 180 microlitri di un X PBS nelle file da B a D di una piastra da 96 pozzetti. Utilizzando un pipetter multi-pozzetto impostato a 200 microlitri, mescolare lentamente il digest del verme mediante pipettaggio. Trasferire la quantità massima del liquido nella riga A della piastra a 96 pozzetti contenente PBS.Utilizzando una pipetta multicanale, rimuovere 20 microlitri dalla fila superiore e erogare nella fila B.Seguito dalla miscelazione. Ripetere questo passaggio per le righe da B a C e quindi per le righe da C a D per ottenere una diluizione di 1000 volte per la quantificazione batterica dei vermi monocolonizzati. Piastra da 10 a 20 microlitri di ogni diluizione su piastre di agar solido.Per la colonizzazione multi-specie, piastra 100 microlitri di ciascuna diluizione su piastre di agar da 10 centimetri. Utilizzando questo protocollo, è stata osservata un'efficace sanificazione esterna dopo lo sbiancamento superficiale di vermi paralizzati a freddo, come visto dal declino dei batteri esterni nel tampone. Senza influenzare i batteri associati all'intestino.L'interruzione manuale dei vermi ha portato a una maggiore eterogeneità. La graniglia in carburo di silicone era ideale per la rottura con o senza Tri Andex. Nel metodo dei 96 pozzi, le grandi perle di vetro non erano adatte alla tecnica dei 96 pozzi.Piccole perle di vetro hanno prodotto risultati coerenti ma hanno intasato il tubo in punta. I vermi colonizzati sullo stesso pool di batteri hanno mostrato un'elevata variazione nel carico intestinale quando osservati per singoli batteri e comunità batteriche multispecie. I vermi colonizzati con batteri che esprimono GFP, hanno mostrato eterogeneità nelle misurazioni dei singoli vermi.Per questo GFP che esprime ceppo batterico confrontando la colonizzazione di Bristol Len tipo selvatico due vermi. A DAF due mutanti IGF hanno dimostrato che il mutante DAF 16 supporta popolazioni più grandi di batteri, mentre DAF due è resistente alla colonizzazione. Questa eterogeneità era caratteristica e coerente su diverse serie dello stesso esperimento.È stato riscontrato che il ricampionamento dei dati per simulare i digest in batch altera la distribuzione rispetto ai singoli dati dei worm. Il lotto estrapolato CFU per verme era incentrato sulla media aritmetica dei singoli dati che portavano alla perdita di variazione biologica. Invece di procedere a digerire la candeggina superficiale viva e il risciacquo, i vermi possono essere utilizzati per ulteriori esperimenti.Il movimento riprenderà rapidamente una volta rimossi i vermi dal freddo.

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