Name: using single-worm data to quantify heterogeneity in caenorhabditis elegans-bacterial interactions
Uploaded: 2022-07-22T14:20:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using Single-Worm Data to Quantify Heterogeneity in Caenorhabditis elegans-Bacterial Interactions at JoVE.com

著者らは、H. SchulenbergとC. LaRockがこれらの実験で使用した細菌株を寛大に共有したことを認めたいと考えている。この研究は、エモリー大学とNSF(PHY2014173)からの資金提供によって支援されました。

これらの実験で使用されたワームは、NIH研究インフラプログラム局(P40 OD010440)が資金提供している Caenorhabditis 遺伝子センターから入手した。ブリストルN2はワイルドタイプです。DAF-2/IGF変異体 daf-16(mu86)I( CGC CF1038)および daf-2(e1370)III(CGC CB1370) は、腸内細菌負荷の違いを説明するために使用される。
pos-1 RNAiベクターを搭載したHT115(DE3)大腸菌</em...

<ol>
	<li>Armitage, D. W., Jones, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+sample+heterogeneity+can+obscure+the+signal+of+microbial+interactions.">How sample heterogeneity can obscure the signal of microbial interactions.</a> The ISME Journal. 13 (11), 2639-2646 (2019).</li><li>Stephenson, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+heterogeneity+affects+both+parasite+transmission+to+and+fitness+on+subsequent+hosts.">Host heterogeneity affects both parasite transmission to and fitness on subsequent hosts.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 372 (1719), 20160093 (2017).</li><li>VanderWaal, K. L., Ezenwa, V. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+in+pathogen+transmission:+mechanisms+and+methodology.">Heterogeneity in pathogen transmission: mechanisms and methodology.</a> Functional Ecology. 30 (10), 1606-1622 (2016).</li><li>Dwyer, G., Elkinton, J. S., Buonaccorsi, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+heterogeneity+in+susceptibility+and+disease+dynamics:+tests+of+a+mathematical+model.">Host heterogeneity in susceptibility and disease dynamics: tests of a mathematical model.</a> The American Naturalist. 150 (6), 685-707 (1997).</li><li>Wu, D., Rea, S. L., Yashin, A. I., Johnson, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+hidden+heterogeneity+in+isogenic+populations+of+C.+elegans.">Visualizing hidden heterogeneity in isogenic populations of C. elegans.</a> Experimental Gerontology. 41 (3), 261-270 (2006).</li><li>Yashin, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heat+shock+changes+the+heterogeneity+distribution+in+populations+of+Caenorhabditis+elegans+does+it+tell+us+anything+about+the+biological+mechanism+of+stress+response.">Heat shock changes the heterogeneity distribution in populations of Caenorhabditis elegans does it tell us anything about the biological mechanism of stress response.</a> The Journals of Gerontology Series A: Biological Sciences and Medical Sciences. 57 (3), 83-92 (2002).</li><li>Zhao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+forms+of+death+in+ageing+Caenorhabditis+elegans.">Two forms of death in ageing Caenorhabditis elegans.</a> Nature Communications. 8 (1), 1-8 (2017).</li><li>Eckley, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+characterization+of+the+transition+to+mid-life+in+Caenorhabditis+elegans.">Molecular characterization of the transition to mid-life in Caenorhabditis elegans.</a> AGE. 35 (3), 689-703 (2012).</li><li>Rea, S. L., Wu, D., Cypser, J. R., Vaupel, J. W., Johnson, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+stress-sensitive+reporter+predicts+longevity+in+isogenic+populations+of+Caenorhabditis+elegans.">A stress-sensitive reporter predicts longevity in isogenic populations of Caenorhabditis elegans.</a> Nature Genetics. 37 (8), 894-898 (2005).</li><li>Kinser, H. E., Mosley, M. C., Plutzer, I. B., Pincus, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global,+cell+non-autonomous+gene+regulation+drives+individual+lifespan+among+isogenic+C.+elegans.">Global, cell non-autonomous gene regulation drives individual lifespan among isogenic C. elegans.</a> eLife. , (2021).</li><li>Churgin, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Longitudinal+imaging+of+Caenorhabditis+elegans+in+a+microfabricated+device+reveals+variation+in+behavioral+decline+during+aging.">Longitudinal imaging of Caenorhabditis elegans in a microfabricated device reveals variation in behavioral decline during aging.</a> eLife. 6, 26652 (2017).</li><li>Perez, M. F., Francesconi, M., Hidalgo-Carcedo, C., Lehner, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maternal+age+generates+phenotypic+variation+in+Caenorhabditis+elegans.">Maternal age generates phenotypic variation in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 552 (7683), 106-109 (2017).</li><li>Baeriswyl, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+aging+profiles+in+isogenic+populations+of+Caenorhabditis+elegans+by+bacteria+causing+different+extrinsic+mortality+rates.">Modulation of aging profiles in isogenic populations of Caenorhabditis elegans by bacteria causing different extrinsic mortality rates.</a> Biogerontology. 11 (1), 53 (2009).</li><li>Taylor, M., Vega, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+immunity+alters+community+ecology+and+stability+of+the+microbiome+in+a+Caenorhabditis+elegans+model.">Host immunity alters community ecology and stability of the microbiome in a Caenorhabditis elegans model.</a> mSystems. 6 (2), 00608-00620 (2021).</li><li>Diaz, S. A., Restif, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spread+and+transmission+of+bacterial+pathogens+in+experimental+populations+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">Spread and transmission of bacterial pathogens in experimental populations of the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Applied and Environmental Microbiology. 80 (17), 5411-5418 (2014).</li><li>Twumasi-Boateng, K., Berg, M., Shapira, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+separation+of+C.+elegans+variably+colonized+by+a+bacterial+pathogen.">Automated separation of C. elegans variably colonized by a bacterial pathogen.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (85), e51090 (2014).</li><li>Ortiz, A., Vega, N. M., Ratzke, C., Gore, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interspecies+bacterial+competition+regulates+community+assembly+in+the+C.+elegans+intestine.">Interspecies bacterial competition regulates community assembly in the C. elegans intestine.</a> The ISME Journal. 15 (7), 2131-2145 (2021).</li><li>Berg, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGF&#946;/BMP+immune+signaling+affects+abundance+and+function+of+C.+elegans+gut+commensals.">TGF&#946;/BMP immune signaling affects abundance and function of C. elegans gut commensals.</a> Nature Communications. 10 (1), 604 (2019).</li><li>Portal-Celhay, C., Blaser, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Competition+and+resilience+between+founder+and+introduced+bacteria+in+the+Caenorhabditis+elegans+gut.">Competition and resilience between founder and introduced bacteria in the Caenorhabditis elegans gut.</a> Infection and Immunity. 80 (3), 1288-1299 (2012).</li><li>Scott, E., Holden-Dye, L., O'Connor, V., Wand, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intra+strain+variation+of+the+effects+of+gram-negative+ESKAPE+pathogens+on+intestinal+colonization,+host+viability,+and+host+response+in+the+model+organism+Caenorhabditis+elegans.">Intra strain variation of the effects of gram-negative ESKAPE pathogens on intestinal colonization, host viability, and host response in the model organism Caenorhabditis elegans.</a> Frontiers in Microbiology. 10, 3113 (2020).</li><li>Kamath, R. S., Martinez-Campos, M., Zipperlen, P., Fraser, A. G., Ahringer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effectiveness+of+specific+RNA-mediated+interference+through+ingested+double-stranded+RNA+in+Caenorhabditis+elegans.">Effectiveness of specific RNA-mediated interference through ingested double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.</a> Genome Biology. 2 (1), (2001).</li><li>Dirksen, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+native+microbiome+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans:+gateway+to+a+new+host-microbiome+model.">The native microbiome of the nematode Caenorhabditis elegans: gateway to a new host-microbiome model.</a> BMC Biology. 14, 38 (2016).</li><li>Vega, N. M., Allison, K. R., Samuels, A. N., Klempner, M. S., Collins, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salmonella+typhimurium+intercepts+Escherichia+coli+signaling+to+enhance+antibiotic+tolerance.">Salmonella typhimurium intercepts Escherichia coli signaling to enhance antibiotic tolerance.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (35), 14420-14425 (2013).</li><li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+C.+elegans.">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook. , (2006).</li><li>Tabara, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+rde-1+gene,+RNA+interference,+and+transposon+silencing+in+C.+elegans.">The rde-1 gene, RNA interference, and transposon silencing in C. elegans.</a> Cell. 99 (2), 123-132 (1999).</li><li>Ahringer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reverse+genetics.">Reverse genetics.</a> WormBook. , (2006).</li><li>Rual, J. -. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+improving+Caenorhabditis+elegans+phenome+mapping+with+an+ORFeome-based+RNAi+library.">Toward improving Caenorhabditis elegans phenome mapping with an ORFeome-based RNAi library.</a> Genome Research. 14 (10), 2162-2168 (2004).</li><li>Revtovich, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+characterization+of+high-throughput+Caenorhabditis+elegans+-+Enterococcus+faecium+infection+model.">Development and characterization of high-throughput Caenorhabditis elegans - Enterococcus faecium infection model.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 11, 667327 (2021).</li><li>Anderson, Q. L., Revtovich, A. V., Kirienko, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput,+high-content,+liquid-based+C.+elegans+pathosystem.">A high-throughput, high-content, liquid-based C. elegans pathosystem.</a> JoVE (Journal of Visualized Experiments. (137), e58068 (2018).</li><li>Scholz, M., Dinner, A. R., Levine, E., Biron, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stochastic+feeding+dynamics+arise+from+the+need+for+information+and+energy.">Stochastic feeding dynamics arise from the need for information and energy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (35), 9261-9266 (2017).</li><li>Wu, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pheromones+modulate+learning+by+regulating+the+balanced+signals+of+two+insulin-like+peptides.">Pheromones modulate learning by regulating the balanced signals of two insulin-like peptides.</a> Neuron. 104 (6), 1095-1109 (2019).</li><li>Ching, T. -. T., Hsu, A. -. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solid+plate-based+dietary+restriction+in+Caenorhabditis+elegans.">Solid plate-based dietary restriction in Caenorhabditis elegans.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (51), e2701 (2011).</li><li>Walker, A. C., Bhargava, R., Vaziriyan-Sani, A. S., Brust, A. S., Czyz, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+bacterial+loads+in+Caenorhabditis+elegans.">Quantification of bacterial loads in Caenorhabditis elegans.</a> Bio-protocol. 12 (2), 4291-4291 (2022).</li><li>Manjarrez, J. R., Mailler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress+and+timing+associated+with+Caenorhabditis+elegans+immobilization+methods.">Stress and timing associated with Caenorhabditis elegans immobilization methods.</a> Heliyon. 6 (7), 04263 (2020).</li><li>Zhang, S., Banerjee, D., Kuhn, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+larval+cells+from+C.+elegans.">Isolation and culture of larval cells from C. elegans.</a> PLoS ONE. 6 (4), 0019505 (2011).</li><li>Garsin, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-lived+C.+elegans+daf-2+mutants+are+resistant+to+bacterial+pathogens.">Long-lived C. elegans daf-2 mutants are resistant to bacterial pathogens.</a> Science. 300 (5627), 1921 (2003).</li><li>Thutupalli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Farming+and+public+goods+production+in+Caenorhabditis+elegans+populations.">Farming and public goods production in Caenorhabditis elegans populations.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (9), 2289-2294 (2017).</li><li>Ly, K., Reid, S. J., Snell, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+RNA+analysis+of+individual+Caenorhabditis+elegans.">Rapid RNA analysis of individual Caenorhabditis elegans.</a> MethodsX. 2, 59-63 (2015).</li><li>Johnke, J., Dirksen, P., Schulenburg, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Community+assembly+of+the+native+C.+elegans+microbiome+is+influenced+by+time,+substrate,+and+individual+bacterial+taxa.">Community assembly of the native C. elegans microbiome is influenced by time, substrate, and individual bacterial taxa.</a> Environmental Microbiology. 22 (4), 1265-1279 (2020).</li><li>Vega, N. M., Gore, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stochastic+assembly+produces+heterogeneous+communities+in+the+Caenorhabditis+elegans+intestine.">Stochastic assembly produces heterogeneous communities in the Caenorhabditis elegans intestine.</a> PLOS Biology. 15 (3), 2000633 (2017).</li><li>Gulyas, L., Powell, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cold+shock+induces+a+terminal+investment+reproductive+response+in+C.+elegans.">Cold shock induces a terminal investment reproductive response in C. elegans.</a> Scientific Reports. 12 (1), 1338 (2022).</li><li>Jiang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetic+program+mediates+cold-warming+response+and+promotes+stress-induced+phenoptosis+in+C.+elegans.">A genetic program mediates cold-warming response and promotes stress-induced phenoptosis in C. elegans.</a> eLife. 7, 35037 (2018).</li><li>Robinson, J. D., Powell, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+recovery+from+acute+cold+shock+in+Caenorhabditis+elegans.">Long-term recovery from acute cold shock in Caenorhabditis elegans.</a> BMC Cell Biology. 17 (1), 2 (2016).</li></ol>

ここでは、 C. elegansにおける細菌負荷の単一ワーム定量化の利点と、このタイプの大規模なデータセットの迅速かつ一貫した取得を可能にする96ウェル破壊プロトコルに関するデータが提示されています。既存の方法33と比較して、これらのプロトコルは、ワーム内の腸内微生物群集のより高いスループット測定を可能にする。
このアプローチは?...

宿主と微生物の関連における不均一性は遍在的に観察され、個体間の変動は、競争と共存1から疾患伝染2、3、4までの集団レベルのプロセスに寄与する要因としてますます認識されている。 C. elegansでは、アイソジェニック集団内の「隠れた不均一性」が繰り返し観察されており、個体のサブ集団はヒートショック応答5,6、老化、寿命7,8,9,10,11、および生理学および発達の他の多くの側面において明確な表現型を示している12.亜集団構造を同定しようとするほとんどの解析は、同種異系の同期ワーム5,7,8の実験集団における2つの亜集団の証拠を提供するが、他のデータは、別個のグループではなく集団内の形質分布の可能性を示唆している7,12,13.ここでの関連性は、微生物の共有供給源からコロニー化されたワームの同種性集団内においても腸集団における実質的な不均一性が観察され13、14、15、16であり、この不均一性は、ワームにおける細菌定量のために広く使用されているバッチ消化測定17、18、19、20によって隠蔽することができる。
この研究は、宿主と微生物の関連における単一ワーム測定への依存度を高める必要性を示唆するデータと、単一ワームの中断における精度とスループットを向上させるためのプロトコルを提示する。これらのプロトコルは、個々のワームの乳棒ベースの破壊よりも優れた再現性とサンプルあたりの労力を提供しながら、生存可能な細菌負荷の定量化のために多数の 個々のC. elegans の機械的破壊を容易にするように設計されています。破壊の準備の前にワームが熱死した 大腸菌 を食べることが許可されている推奨される腸内パージステップは、最近摂取された他の一過性(非付着)細菌からの寄与を最小限に抑えるために含まれています。これらのプロトコルには、低濃度の表面漂白剤処理でキューティクルを洗浄するための冷麻痺法が含まれる。表面漂白は、単一ワーム破壊の準備ステップとして、または生きた外部無菌ワームを調製するための方法として使用することができる。この表面漂白方法は、広範囲の外部微生物を除去するのに十分であり、低温処理は、従来のレバミゾールベースの麻痺に代わるものを提供する。レバミゾールは寒さに敏感な実験に好まれるが、冷たい麻痺は有害な廃棄物の流れへの寄与を最小限に抑え、正常な活動の迅速な再開を可能にする。完全なプロトコルは、ワームが既知の細菌にコロニー形成される実験室実験を説明しているが、ワームの洗浄および単一ワーム破壊の手順は、野生のサンプルから単離されたワームまたは小宇宙実験でコロニー化されたワームに容易に適用することができる。ここで説明するプロトコルは、ワームの腸から抽出された生細菌を産生し、個々のワームのコロニー形成単位(CFU)のメッキおよび定量化に適しています。シーケンシングベースの腸群集分析では、その後の細胞溶解および核酸抽出ステップをこれらのプロトコルに追加する必要があります。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>96-well flat-bottom polypropylene plates, 300 uL</td>
			<td>Evergreen Labware</td>
			<td>290-8350-03F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate sealing mat, silicon, square wells (AxyMat)</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>AM-2ML-SQ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plates, 2 mL, square wells</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>P-2ML-SQ-C-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well polypropylene plate lids</td>
			<td>Evergreen Labware</td>
			<td>290-8020-03L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>443570050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bead mill adapter set for 96-well plates</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>119900</td>
			<td>Adapter plates for use with two 96-well plates on the TissueLyser II</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bead mill tissue homogenizer (TissueLyser II)</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>85300</td>
			<td>Mechanical homogenizer for medium to high-throughput sample disruption</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioSorter</td>
			<td>Union Biometrica</td>
			<td>By quotation</td>
			<td>Large object sorter equipped with a 250 micron focus for C. elegans</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bleach, commercial, 8.25% sodium hypochlorite</td>
			<td>Clorox</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Breathe-Easy 96-well gas permeable sealing membrane</td>
			<td>Diversified Biotech</td>
			<td>BEM-1</td>
			<td>Multiwell plate gas permeable polyurethane membranes. Thin sealing film is permeable to O2, CO2, and water vapors and is UV transparent down to 300 nm. Sterile, 100/box.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride dihydrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC423525000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>AAA11470-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citric acid monohydrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC124910010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper (II) sulfate pentahydrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC197722500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 6765 LSE Mini Microcentrifuge</td>
			<td>Corning</td>
			<td>&#160;COR-6765</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disodium EDTA</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>409971000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL 1,4 Dithiothreitol, 99+%, for mol biology, DNAse, RNAse and Protease free, ACROS Organics</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>327190010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf 1.5 mL microcentrifuge tubes, natural</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf 5424R microcentrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5406000640</td>
			<td>24-place refrigerated benchtop microcentrifuge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf 5810R centrifuge with rotor S-4-104</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22627040</td>
			<td>3L benchtop centrifuge with adaptors for 15-50 mL tubes and plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf plate bucket (x2), for Rotor S-4-104</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22638930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 100%</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP2818500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass beads, 2.7 mm</td>
			<td>Life Science Products</td>
			<td>LS-79127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass beads, acid-washed, 425-600 &#181;m</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G877-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass plating beads</td>
			<td>VWR</td>
			<td>76005-124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH7204-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iron (II) sulfate heptahydrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>423731000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimble Kontes pellet pestle motor</td>
			<td>DWK Life Sciences</td>
			<td>749540-0000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimble Kontes polypropylene pellet pestles and microtubes, 0.5 mL</td>
			<td>DWK Life Sciences</td>
			<td>749520-0590</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica DMi8 motorized inverted microscope with motorized stage</td>
			<td>Leica</td>
			<td>11889113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica LAS X Premium software</td>
			<td>Leica</td>
			<td>11640687</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate heptahydrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC124900010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manganese(II) chloride tetrahydrate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>470301-706</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PARAFILM M flexible laboratory sealing film</td>
			<td>Amcor</td>
			<td>PM996</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptone</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1420-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes, round, 10 cm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25384-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes, round, 6 cm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25384-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes, square, 10 x 10 cm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10799-140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phospho-buffered saline (1X PBS)</td>
			<td>Gold Bio</td>
			<td>P-271-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene autoclave tray, shallow</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-361-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium hydroxide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC134062500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate dibasic</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP363-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP362-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R 4.1.3/RStudio 2022.02.0 build 443</td>
			<td>R Foundation</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scoop-type laboratory spatula, metal</td>
			<td>VWR</td>
			<td>470149-438</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon carbide 36 grit</td>
			<td>MJR Tumblers</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Black extra coarse silicon carbide grit. Available in 0.5-5 lb sizes from this vendor.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP166-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH7247-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic anhydrous</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP332-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodum chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP358-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC419760010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tri-potassium citrate monohydrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC611755000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP151-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zinc sulfate heptahydrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC205982500</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using single-worm data to quantify heterogeneity in caenorhabditis elegans-bacterial interactions

線虫 Caenorhabditis elegans は、宿主-微生物および宿主-微生物叢相互作用のモデル系である。これまでの多くの研究では、個々のワームサンプルではなくバッチ消化を使用して、この生物の細菌負荷を定量化しています。ここでは、 C. elegans 腸の細菌コロニー形成に見られる大きな個人間変動が有益であり、バッチ消化法は条件間の正確な比較に重要な情報を破棄すると主張している。これらのサンプルに固有の変動を記述するにつれて、多数の個体を必要とし、個々のワームの破壊およびコロニーメッキのための便利な96ウェルプレートプロトコルが確立される。

生きた虫の漂白剤滅菌 表面漂白されたワームは、運動性が戻り、排泄が再開するまで、外部細菌を効果的に含まない。ここで使用した条件下では、低温麻痺したワームの腸内関連細菌を乱すことなく(図1A-C、補足図2、ビデオ1)、緩衝液中の細菌の急速な絶滅が観察される(図1D-F、ビデオ2</s...

Watch this Scientific Journal Video about Using Single-Worm Data to Quantify Heterogeneity in Caenorhabditis elegans-Bacterial Interactions at JoVE.com

Using Single-Worm Data to Quantify Heterogeneity in Caenorhabditis elegans-Bacterial Interactions

このプロトコルは、外部細菌を除去するための低温麻痺および表面漂白後の個々の細菌的にコロニー形成された Caenorhabditis elegansの 96ウェル破壊を記載している。得られた懸濁液を寒天プレートに播種し、多数の個々のワームにおける細菌負荷の正確で中程度のスループット定量を可能にする。

単一ワームデータを使用して 、Caenorhabditisエレガンス-細菌相互作用における不均一性を定量化

The nematode Caenorhabditis elegans is a model system for host-microbe and host-microbiome interactions. Many studies to date use batch digests rather ...

このプロトコルは、海のエレガンスの機械的破壊を示しています。96ウェルフォーマットで、個々のワームの細菌負荷を中程度のスループットで定量化できます。この手法は、Paselベースの方法と比較して、機械的破壊の速度と均一性を向上させ、研究者が高品質のシングルワーム測定のより大きなデータセットを簡単に作成できるようにします。このテクニックには多くの可動部品が含まれており、場所を失うのは簡単です。開始する前に、すべての材料、ラベル付きチューブ、バッファー、プレートがセットアップされていることを確認してください。手順を実演するのは、私の研究室の研究スペシャリストリーダーであるミーガンテイラーです。まず、ワームサンプルをマイクロ遠心チューブ内の1ミリリットルのM nine TX zero oneに再懸濁します。成虫を遠心分離で回収し、上清を廃棄する。同じ遠心分離パラメータを使用する。外部細菌を最小限に抑えるために、1ミリリットルのM9TX01で2回、1ミリリットルのM9ワームバッファーで1回、ワームをすすぎます。次に、各サンプルを1ミリリットルのS培地に2倍の熱死体OP50を加えた培養チューブに再懸濁します。チューブを摂氏25度で20〜30分間インキュベートして、非広告付着細菌を腸から通過させます。インキュベーション後、パージしたワームを1ミリリットルの冷たいM9TX01で2回すすぎ、上清を捨てます。ワームを麻痺させるために10分間チューブを氷の上に置きます。次に、無香料の漂白剤を含む1ミリリットルの氷冷Mナインワームバッファーを各チューブに追加します。チューブを氷上で最低10分間インキュベートして、外部のバクテリアを殺します。漂白剤バッファーを廃棄し、チューブを氷に戻して、ワームがポンピングするのを防ぎます。次に、各チューブに1ミリリットルの冷たいM9TX01を加え、5秒間遠心分離します。ミニ遠心分離機で。チューブを氷に戻し、上清を取り除きます。この手順を一度繰り返します。ワームキューティクルの化学透過処理用。20マイクロリットルのバッファーに入ったワームを含むチューブを室温のチューブラックに移します。次に、各ウォームサンプルに100マイクロリットルのSDS / DTT溶液を追加します。成虫のキューティクルを部分的に分解するためにベンチで最大8分間チューブをインキュベートします。この時点で、ワームは死んでチューブの底に落ち着きます。インキュベーション後、SDS/DTT上清を注意深く廃棄します。次に、各チューブに1ミリリットルのM9TX01を追加し、短時間遠心分離してワームをペレット化します。上清を廃棄し、0.1%Triton x-100を含む1ミリリットルのM 9ワームバッファーにワームを再懸濁します。ワームの機械的破壊に備えるために、滅菌2ミリリットルの深さのウェル96ウェルプレートとシリコンプレートカバーを入手してください。滅菌スクープスヘラを使用して、グリッドがウェルの底をかろうじて覆うように、少量の滅菌36グリッド炭化物を各ウェルに追加します。180マイクロリットルのM 9ワームバッファーを各ウェルに加えます。列と行にラベルを付けてから、シリコンプレートカバーでプレートをゆるく覆います。次に、透過処理したワームを、M9TX01を1センチメートルの深さまで満たした小さなペトリ皿に移します。解剖顕微鏡を使用して、20マイクロリットルの容量の個々のワームをピペットで取り出し、96ウェルプレートの個々のウェルに移して、ピペットに付着したワームを排出し、ペトリ皿の透明な領域から20マイクロリットルのM9TX01を吸引し、皿に戻します。すべてのワームが移されたら、96ウェルプレートを柔軟な天井フィルムのシートで覆い、紙の裏面をサンプルウェルに下に向けています。カバーをウェルに押し下げることなく、シリコンシーリングマットをフレキシブルシーリングフィルムの上に軽く置きます。中断中の過熱を防ぐために、プレートを摂氏4度で30〜60分間置きます。プレートを冷やした後、シリコンシーリングマットをウェルにしっかりと押し下げて密閉します。次に、プレートを組織破壊剤に固定します。プレートを30ヘルツで1分間振とうします。次に、プレートを180度回転させ、1分間振とうを繰り返します。プレートをベンチに2〜3回しっかりと叩いて、柔軟な天井フィルムから砂を取り除きます。プレートセットを2、400回Gで2分間遠心分離し、ウェルの底にサンプルを回収した。次に、シリコンの蓋を外し、天井フィルムを引き剥がします。ワームダイジェストの10倍段階希釈を調製するには、96ウェルプレートの行BからDに180マイクロリットルの1X PBSを充填します。200マイクロリットルに設定されたマルチウェルピペッターを使用して、ピペッティングによってワームダイジェストをゆっくりと混合します。最大量の液体をPBSを含む96穴プレートのA列に移す。マルチチャンネルピペットを使用して、一番上の列から20マイクロリットルを取り出し、列Bに分注し、続いて混合します。この手順を行BからC、次に行CからDに対して繰り返して、モノコロニー化ワームの細菌定量用に1000倍希釈します。プレート10〜20マイクロリットルの各希釈液を固体寒天プレート上に。複数種のコロニー形成のために、各希釈液100マイクロリットルを10センチメートル寒天プレートにプレートする。このプロトコルを使用すると、バッファー中の外部細菌の減少に見られるように、低温麻痺ワームの表面漂白後に効果的な外部消毒が観察されました。腸関連細菌に影響を与えることなく。ワームを手動で中断すると、異質性が高まりました。シリコーンカーバイドグリットは、Tri Andexの有無にかかわらず、破壊に理想的でした。96ウェル法では、大きなガラスビーズは96ウェル法には適していませんでした。小さなガラスビーズは一貫した結果を生み出しましたが、先端のパイプを詰まらせました。同じ細菌のプールにコロニーを形成した線虫は、個々の細菌および複数種の細菌群集について観察された場合、腸内負荷の高い変動を示しました。GFPを発現する細菌でコロニーを形成したワームは、個々のワーム測定において不均一性を示した。このGFP発現細菌株について、野生型ブリストルレン2匹の虫のコロニー形成を比較した。DAFに対して2つのIGF変異体は、DAF 16変異体が細菌のより大きな集団をサポートするのに対し、DAF 2はコロニー形成に対して耐性であることを示した。この異質性は特徴的であり、同じ実験の異なる実行にわたって一貫していました。バッチダイジェストをシミュレートするためのデータの再サンプリングは、個々のワームデータと比較して分布を変更することがわかりました。ワームごとのバッチ外挿CFUは、生物学的変動の損失につながる個々のデータの算術平均を中心にしていました。生きた表面漂白剤の消化に進む代わりに、ワームをすすぎ、さらなる実験に使用することができます。ワームが寒さから取り除かれると、動きはすぐに再開されます。

Research

JoVE Journal

Biology

Using Single-Worm Data to Quantify Heterogeneity in Caenorhabditis elegans-Bacterial Interactions

Analysis of Schwann-astrocyte Interactions Using In Vitro Assays

Analysis of Schwann-astrocyte Interactions Using In Vitro Assays

使用シュワン-アストロサイト相互作用の解析インビトロアッセイ

Schwann cells are one of the commonly used cells in repair strategies following spinal cord injuries. Schwann cells are capable of supporting axonal ...

生物学

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

の初期発生のタイムラプス顕微鏡線虫（Caenorhabditis elegans）

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes.  The transparency of the 
embryos, the genetic ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

Using Coculture to Detect Chemically Mediated Interspecies Interactions

化学的に媒介種間相互作用を検出するための共培養を使用して

In nature, bacteria rarely exist in isolation; they are instead surrounded by a diverse array of other microorganisms that alter the local environment by ...

A Screenable In Vivo Assay for Mitochondrial Modulators Using Transgenic Bioluminescent Caenorhabditis elegans

A Screenable In Vivo Assay for Mitochondrial Modulators Using Transgenic Bioluminescent Caenorhabditis elegans

スクリーニング可能<em&gt;インビボ</em&gt;トランスジェニック生物発光を使用したミトコンドリアモジュレーターについてのアッセイ<em&gt;線虫（Caenorhabditis elegans）</em

The multicellular model organism Caenorhabditis elegans is a small nematode of approximately 1 mm in size in adulthood that is genetically and ...

Techniques to Induce and Quantify Cellular Senescence

誘導および定量化細胞老化するテクニック

In response to cellular stress or damage, proliferating cells can induce a specific program that initiates a state of long-term cell-cycle arrest, termed ...

Methods to Study Changes in Inherent Protein Aggregation with Age in Caenorhabditis elegans

Methods to Study Changes in Inherent Protein Aggregation with Age in Caenorhabditis elegans

線虫の加齢とともに固有の蛋白質の集合の変化を研究するためのメソッド

In the last decades, the prevalence of neurodegenerative disorders, such as Alzheimer's disease (AD) and Parkinson's disease (PD), has grown. These ...

Nasal Potential Difference to Quantify Trans-epithelial Ion Transport in Mice

マウスにおける上皮細胞のイオン輸送を定量化する鼻の潜在的な違い

The nasal potential difference test has been used for almost three decades to assist in the diagnosis of cystic fibrosis (CF). It has proven to be helpful ...

Using Caenorhabditis elegans to Screen for Tissue-Specific Chaperone Interactions

Using Caenorhabditis elegans to Screen for Tissue-Specific Chaperone Interactions

カエノハブディティス・エレガンスを使用して組織特異的シャペロン相互作用をスクリーニングする

Correct folding and assembly of proteins and protein complexes are essential for cellular function. Cells employ quality control pathways that correct, ...

High-Throughput Live Imaging of Microcolonies to Measure Heterogeneity in Growth and Gene Expression

成長と遺伝子発現の不均一性を測定するマイクロコロニーのハイスループットライブイメージング

Precise measurements of between- and within-strain heterogeneity in microbial growth rates are essential for understanding genetic and environmental ...

単一ワームデータを使用して 、Caenorhabditisエレガンス-細菌相互作用における不均一性を定量化

単一ワームデータを使用して、Caenorhabditisエレガンス-細菌相互作用における不均一性を定量化