Name: using single-worm data to quantify heterogeneity in caenorhabditis elegans-bacterial interactions
Uploaded: 2022-07-22T14:20:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using Single-Worm Data to Quantify Heterogeneity in Caenorhabditis elegans-Bacterial Interactions at JoVE.com

저자들은 H. Schulenberg와 C. LaRock이이 실험에 사용 된 박테리아 균주를 관대하게 공유 한 것을 인정하고 싶습니다. 이 작업은 Emory University와 NSF (PHY2014173)의 기금으로 지원되었습니다.

이 실험에 사용 된 웜은 NIH Office of Research Infrastructure Program (P40 OD010440)이 자금을 지원하는 Caenorhabditis Genetic Center에서 얻었습니다. 브리스톨 N2는 야생형입니다. DAF-2/IGF 돌연변이체 daf-16(mu86) I(CGC CF1038) 및 daf-2 (e1370) III(CGC CB1370) 는 장내 박테리아 부하의 차이를 설명하기 위해 사용된다.
포즈-1 RNAi 벡터를 운반하는 HT115(DE3) 대장균은 아링거 라이...

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V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput,+high-content,+liquid-based+C.+elegans+pathosystem.">A high-throughput, high-content, liquid-based C. elegans pathosystem.</a> JoVE (Journal of Visualized Experiments. (137), e58068 (2018).</li><li>Scholz, M., Dinner, A. R., Levine, E., Biron, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stochastic+feeding+dynamics+arise+from+the+need+for+information+and+energy.">Stochastic feeding dynamics arise from the need for information and energy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (35), 9261-9266 (2017).</li><li>Wu, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pheromones+modulate+learning+by+regulating+the+balanced+signals+of+two+insulin-like+peptides.">Pheromones modulate learning by regulating the balanced signals of two insulin-like peptides.</a> Neuron. 104 (6), 1095-1109 (2019).</li><li>Ching, T. -. T., Hsu, A. -. 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R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cold+shock+induces+a+terminal+investment+reproductive+response+in+C.+elegans.">Cold shock induces a terminal investment reproductive response in C. elegans.</a> Scientific Reports. 12 (1), 1338 (2022).</li><li>Jiang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetic+program+mediates+cold-warming+response+and+promotes+stress-induced+phenoptosis+in+C.+elegans.">A genetic program mediates cold-warming response and promotes stress-induced phenoptosis in C. elegans.</a> eLife. 7, 35037 (2018).</li><li>Robinson, J. D., Powell, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+recovery+from+acute+cold+shock+in+Caenorhabditis+elegans.">Long-term recovery from acute cold shock in Caenorhabditis elegans.</a> BMC Cell Biology. 17 (1), 2 (2016).</li></ol>

여기서 데이터는 C. elegans의 박테리아 부하의 단일 웜 정량화의 이점과 96-well 파괴 프로토콜에 대해 제시되어 이러한 유형의 대규모 데이터 세트를 신속하고 일관되게 수집 할 수 있습니다. 기존의 방법(33)과 비교하여, 이들 프로토콜은 웜 내의 장내 미생물 군집의 더 높은 처리량 측정을 허용한다.
이 접근법은 도금을 속도 제한 단계로 가지며 진정한 ...

숙주-미생물 연관성에서의 이질성은 유비쿼터스적으로 관찰되며, 개인들 사이의 변이는 경쟁과 공 존1에서 질병 전달 2,3,4에 이르는 집단 수준 과정에 기여하는 요인으로 점점 더 인식되고 있다. C. elegans에서, isogenic 집단 내의 "숨겨진 이질성"이 반복적으로 관찰되었으며, 열 충격 반응 5,6, 노화 및 수명 7,8,9,10,11 및 생리학 및 발달의 많은 다른 측면에서 뚜렷한 표현형을 보이는 개인의 하위 집단 12 . 하위 집단 구조를 확인하려는 대부분의 분석은 동종 동기화 된 웜5,7,8의 실험 집단에서 두 개의 하위 집단에 대한 증거를 제공하지만, 다른 데이터는 별개의 그룹보다는 형질의 인구 내 분포의 가능성을 시사합니다 7,12,13 . 여기서와 관련성이 있는 경우, 미생물 13,14,15,16의 공유 공급원으로부터 콜로니화된 웜의 isogenic 집단 내에서도 장 집단에서의 실질적인 이질성이 관찰되며, 이러한 이질성은 웜의 박테리아 정량화를 위해 널리 사용되는 배치 다이제스트 측정치(17,18,19,20)에 의해 은폐될 수 있다.
이 연구는 숙주-미생물 연관에서 단일 웜 측정에 대한 의존도가 높아질 필요성을 시사하는 데이터와 단일 웜 중단에서 정확도와 처리량을 높이기 위한 프로토콜을 제시합니다. 이러한 프로토콜은 생존 가능한 박테리아 부하의 정량화를 위해 많은 수의 개별 C. elegans 의 기계적 파괴를 촉진하도록 설계되었으며, 개별 웜의 유역 기반 파괴보다 샘플 당 더 나은 반복성과 낮은 노력을 제공합니다. 벌레가 파괴를 준비하기 전에 열로 죽인 대장균 을 먹일 수 있도록 허용하는 권장 장 정화 단계가 포함되어 최근에 섭취 한 박테리아 및 기타 일시적 (부착되지 않은) 박테리아의 기여를 최소화합니다. 이들 프로토콜은 저농도 표면 표백제 처리로 큐티클을 세척하기 위한 냉 마비 방법; 표면 표백은 단일 웜 파괴의 준비 단계 또는 살아있는 외부 세균이없는 웜을 준비하는 방법으로 사용할 수 있습니다. 이러한 표면-표백 방법은 광범위한 외부 미생물을 제거하기에 충분하며, 냉간 처리는 종래의 레바미솔-기반 마비에 대한 대안을 제공한다; 레바미솔은 감기에 민감한 실험에 선호되는 반면, 냉간 마비는 위험한 폐기물 흐름에 대한 기여를 최소화하고 정상적인 활동을 신속하게 재개 할 수있게합니다. 전체 프로토콜은 웜이 알려진 박테리아로 식민지화되는 실험실 실험을 설명하지만, 웜 및 단일 웜 파괴를 청소하는 절차는 야생 샘플에서 분리되거나 소우주 실험에서 식민지화 된 웜에 쉽게 적용될 수 있습니다. 여기에 설명 된 프로토콜은 웜 장에서 추출 된 살아있는 박테리아를 생산하며, 개별 웜에서 콜로니 형성 단위 (CFU)의 도금 및 정량화에 적합합니다. 시퀀싱 기반 장 군집 분석을 위해, 후속 세포 용해 및 핵산 추출 단계가 이들 프로토콜에 추가되어야 한다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>96-well flat-bottom polypropylene plates, 300 uL</td>
			<td>Evergreen Labware</td>
			<td>290-8350-03F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate sealing mat, silicon, square wells (AxyMat)</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>AM-2ML-SQ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plates, 2 mL, square wells</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>P-2ML-SQ-C-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well polypropylene plate lids</td>
			<td>Evergreen Labware</td>
			<td>290-8020-03L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>443570050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bead mill adapter set for 96-well plates</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>119900</td>
			<td>Adapter plates for use with two 96-well plates on the TissueLyser II</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bead mill tissue homogenizer (TissueLyser II)</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>85300</td>
			<td>Mechanical homogenizer for medium to high-throughput sample disruption</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioSorter</td>
			<td>Union Biometrica</td>
			<td>By quotation</td>
			<td>Large object sorter equipped with a 250 micron focus for C. elegans</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bleach, commercial, 8.25% sodium hypochlorite</td>
			<td>Clorox</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Breathe-Easy 96-well gas permeable sealing membrane</td>
			<td>Diversified Biotech</td>
			<td>BEM-1</td>
			<td>Multiwell plate gas permeable polyurethane membranes. Thin sealing film is permeable to O2, CO2, and water vapors and is UV transparent down to 300 nm. Sterile, 100/box.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride dihydrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC423525000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>AAA11470-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citric acid monohydrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC124910010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper (II) sulfate pentahydrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC197722500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 6765 LSE Mini Microcentrifuge</td>
			<td>Corning</td>
			<td>&#160;COR-6765</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disodium EDTA</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>409971000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL 1,4 Dithiothreitol, 99+%, for mol biology, DNAse, RNAse and Protease free, ACROS Organics</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>327190010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf 1.5 mL microcentrifuge tubes, natural</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf 5424R microcentrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5406000640</td>
			<td>24-place refrigerated benchtop microcentrifuge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf 5810R centrifuge with rotor S-4-104</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22627040</td>
			<td>3L benchtop centrifuge with adaptors for 15-50 mL tubes and plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf plate bucket (x2), for Rotor S-4-104</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22638930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 100%</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP2818500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass beads, 2.7 mm</td>
			<td>Life Science Products</td>
			<td>LS-79127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass beads, acid-washed, 425-600 &#181;m</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G877-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass plating beads</td>
			<td>VWR</td>
			<td>76005-124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH7204-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iron (II) sulfate heptahydrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>423731000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimble Kontes pellet pestle motor</td>
			<td>DWK Life Sciences</td>
			<td>749540-0000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimble Kontes polypropylene pellet pestles and microtubes, 0.5 mL</td>
			<td>DWK Life Sciences</td>
			<td>749520-0590</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica DMi8 motorized inverted microscope with motorized stage</td>
			<td>Leica</td>
			<td>11889113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica LAS X Premium software</td>
			<td>Leica</td>
			<td>11640687</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate heptahydrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC124900010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manganese(II) chloride tetrahydrate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>470301-706</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PARAFILM M flexible laboratory sealing film</td>
			<td>Amcor</td>
			<td>PM996</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptone</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1420-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes, round, 10 cm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25384-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes, round, 6 cm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25384-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes, square, 10 x 10 cm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10799-140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phospho-buffered saline (1X PBS)</td>
			<td>Gold Bio</td>
			<td>P-271-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene autoclave tray, shallow</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-361-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium hydroxide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC134062500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate dibasic</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP363-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP362-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R 4.1.3/RStudio 2022.02.0 build 443</td>
			<td>R Foundation</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scoop-type laboratory spatula, metal</td>
			<td>VWR</td>
			<td>470149-438</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon carbide 36 grit</td>
			<td>MJR Tumblers</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Black extra coarse silicon carbide grit. Available in 0.5-5 lb sizes from this vendor.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP166-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH7247-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic anhydrous</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP332-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodum chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP358-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC419760010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tri-potassium citrate monohydrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC611755000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP151-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zinc sulfate heptahydrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC205982500</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using single-worm data to quantify heterogeneity in caenorhabditis elegans-bacterial interactions

선충류 Caenorhabditis elegans 는 숙주 - 미생물 및 숙주 - 미생물 상호 작용을위한 모델 시스템입니다. 현재까지 많은 연구는이 유기체의 박테리아 부하를 정량화하기 위해 개별 웜 샘플보다는 배치 다이제스트를 사용합니다. 여기서 C. elegans 장의 박테리아 식민지화에서 볼 수있는 큰 개인 간 변동성은 유익하며, 배치 소화 방법은 조건 간 정확한 비교에 중요한 정보를 폐기한다고 주장합니다. 이러한 샘플에 내재 된 변형을 설명하는 것은 많은 수의 개인을 필요로하기 때문에 개별 웜의 파괴 및 콜로니 도금을위한 편리한 96 웰 플레이트 프로토콜이 확립됩니다.

살아있는 벌레의 표백제 살균 표면 표백 된 웜은 운동성이 회복되고 배설이 재개 될 때까지 외부 박테리아가 효과적으로 없습니다. 여기에 사용된 조건 하에서, 냉마비 웜에서 장-관련 박테리아를 방해하지 않으면서 완충액 내의 박테리아의 급속한 멸종이 관찰된다(도 1A-C, 보충 그림 2, 비디오 1).<st...

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Using Single-Worm Data to Quantify Heterogeneity in Caenorhabditis elegans-Bacterial Interactions

이 프로토콜은 외부 박테리아를 제거하기 위해 감기 마비 및 표면 표백에 이어 박테리아 식민지화 된 Caenorhabditis elegans의 96-well 파괴를 설명합니다. 생성 된 현탁액은 한천 플레이트에 도금되어 많은 수의 개별 웜에서 박테리아 부하의 정확하고 중간 처리량 정량화를 허용합니다.

단일 웜 데이터를 사용하여 예쁜꼬마선충-박테리아 상호작용의 이질성 정량화

The nematode Caenorhabditis elegans is a model system for host-microbe and host-microbiome interactions. Many studies to date use batch digests rather ...

이 프로토콜은 바다 엘레 간스의 기계적 파괴를 보여줍니다. 96 웰 형식으로 개별 웜에서 박테리아 부하의 중간 처리량 정량화가 가능합니다. 이 기술은 Pasel 기반 방법에 비해 기계적 파괴의 속도와 균일성을 높여 연구원이 고품질 단일 웜 측정의 더 큰 데이터 세트를 쉽게 생성할 수 있도록 합니다.이 기술은 많은 움직이는 부품을 포함하며 자리를 잃기 쉽습니다. 시작하기 전에 모든 재료, 라벨이 붙은 튜브, 버퍼 및 플레이트가 설정되어 있는지 확인하십시오. 절차를 시연하는 것은 내 실험실의 연구 전문가 인 Megan Taylor가 될 것입니다.웜 샘플을 마이크로 원심분리 튜브에서 M9TX제로 1의 1 밀리리터에 재현탁시키는 것으로 시작한다. 원심분리에 의해 성충을 수집하고 상청액을 버린다. 동일한 원심분리 파라미터 사용.외부 박테리아를 최소화하기 위해 1 밀리리터의 M9TX01로 웜을 두 번, M9 웜 버퍼 1 밀리리터로 한 번 헹굽니다. 그런 다음 각 샘플을 1 밀리리터의 S 배지에 2 x 열 사멸 OP50을 배양 튜브에 다시 현탁시킵니다. 튜브를 섭씨 25도에서 20-30 분 동안 배양하여 부착되지 않은 박테리아를 장에서 통과시킵니다.배양 후, 퍼지 된 웜을 차가운 M9TX01 1 밀리리터로 두 번 헹구고 상아 액을 버립니다. 튜브를 얼음 위에 10 분 동안 올려 벌레를 마비시킵니다. 그런 다음 무향 표백제가 함유 된 얼음처럼 차가운 M 9 웜 버퍼 1 밀리리터를 각 튜브에 첨가하십시오.외부 박테리아를 죽이기 위해 튜브를 얼음 위에 최소 10분 동안 배양합니다. 표백제 버퍼를 버리고 튜브를 얼음으로 되돌려 벌레가 펌핑되는 것을 방지합니다. 다음으로 차가운 M9TX01 1 밀리리터를 각 튜브에 넣고 5 초 동안 원심 분리합니다.미니 원심 분리기에서. 튜브를 얼음으로 되돌리고 상층액을 제거하십시오. 이 단계를 한 번 반복합니다.웜 큐티클의 화학 투과용. 20 마이크로 리터의 버퍼에 웜이 들어있는 튜브를 실온 튜브 랙으로 옮깁니다. 그런 다음 각 따뜻한 샘플에 100마이크로리터의 SDS/DTT 용액을 추가합니다.튜브를 벤치에서 최대 8 분 동안 배양하여 성인 벌레의 표피를 부분적으로 분해하십시오. 이 시점에서 웜은 죽어 튜브 바닥에 정착합니다. 배양 후 SDS/DTT 상청액을 조심스럽게 폐기합니다.그런 다음 각 튜브에 M9TX01 1밀리리터를 추가하고 잠시 원심분리하여 웜을 펠릿으로 만듭니다. 상청액을 버리고 0.1% Triton x-100으로 1밀리리터 M 9 웜 완충액에 웜을 다시 현탁시킨다. 웜의 기계적 파괴에 대비하려면 멸균 2 밀리리터 깊은 우물 96 웰 플레이트와 실리콘 플레이트 덮개를 확보하십시오.멸균 스쿱 주걱을 사용하여 그리드가 우물 바닥을 거의 덮지 않도록 소량의 멸균 36 그리드 실리콘 카바이드를 각 웰에 첨가하십시오. 180 마이크로리터의 M 나인 웜 버퍼를 각 웰에 추가합니다. 기둥과 행에 레이블을 지정한 다음 실리콘 플레이트 덮개로 플레이트를 느슨하게 덮습니다.다음으로, 투과 된 웜을 M9TX01이 1cm 깊이까지 채워진 작은 페트리 접시로 옮깁니다. 해부 현미경 피펫을 사용하여 20 마이크로 리터 부피의 개별 웜을 제거하고 96 웰 플레이트의 개별 웰로 옮겨 피펫에 붙어있는 웜을 꺼내고 페트리 접시의 깨끗한 영역에서 20 마이크로 리터의 M9TX01을 흡인하여 접시에 다시 놓습니다. 모든 웜이 옮겨지면 96 웰 플레이트를 유연한 천장 필름 시트로 덮고 종이를 받쳐서 샘플 웰을 아래로 향하게합니다.덮개를 우물에 누르지 않고 유연한 천장 필름 위에 실리콘 천장 매트를 가볍게 놓습니다. 중단 중 과열을 방지하기 위해 플레이트를 섭씨 4도에서 30-60분 동안 두십시오. 플레이트를 식힌 후 실리콘 천장 매트를 우물에 단단히 눌러 밀봉합니다.그런 다음 조직 파괴 물질에 플레이트를 고정하십시오. 플레이트를 30헤르츠에서 1분 동안 흔듭니다. 그런 다음 플레이트를 180도 회전하고 1 분 동안 흔들기를 반복하십시오.벤치의 판을 두세 번 세게 두드려 유연한 천장 필름에서 모래를 제거합니다. 플레이트를 2분 동안 2, 400회 G로 원심분리하여 웰의 바닥에서 샘플을 수집한다. 그런 다음 실리콘 뚜껑을 제거하고 천장 필름을 잡아 당깁니다.웜 다이제스트의 10배 연속 희석을 준비하려면 180마이크로리터의 1X PBS를 96웰 플레이트의 행 B에서 D로 채웁니다. 200 마이크로리터로 설정된 멀티웰 피펫터를 사용하여, 웜 다이제스트를 피펫팅으로 천천히 혼합한다. 액체의 최대량을 PBS를 함유하는 96 웰 플레이트의 행 A로 옮긴다.다중 채널 피펫을 사용하여 맨 위 줄에서 20 마이크로 리터를 제거하고 B 열에 분주합니다. 행 B에서 C까지, 다음 행 C에서 D에 대해 이 단계를 반복하여 모노 식민지 웜의 박테리아 정량화를 위한 1000배 희석을 얻습니다. 각 희석액 10 내지 20 마이크로리터를 고체 한천 플레이트 상에 플레이트한다.다종 집락화의 경우, 10 센티미터 한천 플레이트에 각 희석액 100 마이크로 리터를 플레이트합니다. 이 프로토콜을 사용하여 완충액에서 외부 박테리아의 감소로 볼 수 있듯이 차가운 마비 된 벌레의 표면 표백 후 효과적인 외부 살균이 관찰되었습니다. 장내 관련 박테리아에 영향을 미치지 않고.웜의 수동 중단은 더 많은 이질성을 초래했습니다. 실리콘 카바이드 그릿은 Tri Andex의 유무에 관계없이 중단에 이상적이었습니다. 96 웰 방법에서 큰 유리 구슬은 96 웰 기술에 적합하지 않았습니다.작은 유리 구슬은 일관된 결과를 생성했지만 끝 부분에서 파이프를 막았습니다. 동일한 박테리아 풀에 서식하는 벌레는 개별 박테리아와 다종 박테리아 군집에 대해 관찰되었을 때 장 부하의 높은 변화를 보였습니다. GFP를 발현하는 박테리아로 식민지화 된 웜은 개별 웜 측정에서 이질성을 보였습니다.이러한 GFP 발현 박테리아 균주의 경우 야생형 브리스톨렌 2웜의 집락화를 비교하였다. DAF에 2개의 IGF 돌연변이체는 DAF 16 돌연변이체가 더 많은 박테리아 집단을 지원하는 반면, DAF2는 집락화에 내성이 있음을 보여주었다. 이 이질성은 동일한 실험의 다른 실행에서 특징적이고 일관되었습니다.배치 다이제스트를 시뮬레이션하기 위한 데이터의 재샘플링은 개별 웜 데이터와 비교하여 분포를 변경하는 것으로 밝혀졌습니다. 웜 당 배치 외삽 된 CFU는 생물학적 변이의 손실로 이어지는 개별 데이터의 산술 평균을 중심으로 이루어졌습니다. 살아있는 표면 표백제를 소화하는 대신 헹굼 웜을 추가 실험에 사용할 수 있습니다.추위에서 벌레가 제거되면 움직임이 빠르게 재개됩니다.

Research

JoVE Journal

Biology

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연구

생물학

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