Name: using single-worm data to quantify heterogeneity in caenorhabditis elegans-bacterial interactions
Uploaded: 2022-07-22T14:20:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using Single-Worm Data to Quantify Heterogeneity in Caenorhabditis elegans-Bacterial Interactions at JoVE.com

Forfatterne vil gjerne anerkjenne H. Schulenberg og C. LaRock for deres sjenerøse deling av bakteriestammer som brukes i disse forsøkene. Dette arbeidet ble støttet av finansiering fra Emory University og NSF (PHY2014173).

Ormer som ble brukt i disse forsøkene ble hentet fra Caenorhabditis Genetic Center, som er finansiert av NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440). Bristol N2 er villtypen. DAF-2/IGF mutantene daf-16(mu86) I (CGC CF1038) og daf-2(e1370) III (CGC CB1370) brukes for å illustrere forskjeller i intestinal bakteriebelastning.
HT115 (DE3) E. coli som bærer pos-1 RNAi-vektoren er fra Ahringer-biblioteket21. MY...

<ol>
	<li>Armitage, D. W., Jones, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+sample+heterogeneity+can+obscure+the+signal+of+microbial+interactions.">How sample heterogeneity can obscure the signal of microbial interactions.</a> The ISME Journal. 13 (11), 2639-2646 (2019).</li><li>Stephenson, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+heterogeneity+affects+both+parasite+transmission+to+and+fitness+on+subsequent+hosts.">Host heterogeneity affects both parasite transmission to and fitness on subsequent hosts.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 372 (1719), 20160093 (2017).</li><li>VanderWaal, K. L., Ezenwa, V. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+in+pathogen+transmission:+mechanisms+and+methodology.">Heterogeneity in pathogen transmission: mechanisms and methodology.</a> Functional Ecology. 30 (10), 1606-1622 (2016).</li><li>Dwyer, G., Elkinton, J. S., Buonaccorsi, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+heterogeneity+in+susceptibility+and+disease+dynamics:+tests+of+a+mathematical+model.">Host heterogeneity in susceptibility and disease dynamics: tests of a mathematical model.</a> The American Naturalist. 150 (6), 685-707 (1997).</li><li>Wu, D., Rea, S. L., Yashin, A. I., Johnson, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+hidden+heterogeneity+in+isogenic+populations+of+C.+elegans.">Visualizing hidden heterogeneity in isogenic populations of C. elegans.</a> Experimental Gerontology. 41 (3), 261-270 (2006).</li><li>Yashin, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heat+shock+changes+the+heterogeneity+distribution+in+populations+of+Caenorhabditis+elegans+does+it+tell+us+anything+about+the+biological+mechanism+of+stress+response.">Heat shock changes the heterogeneity distribution in populations of Caenorhabditis elegans does it tell us anything about the biological mechanism of stress response.</a> The Journals of Gerontology Series A: Biological Sciences and Medical Sciences. 57 (3), 83-92 (2002).</li><li>Zhao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+forms+of+death+in+ageing+Caenorhabditis+elegans.">Two forms of death in ageing Caenorhabditis elegans.</a> Nature Communications. 8 (1), 1-8 (2017).</li><li>Eckley, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+characterization+of+the+transition+to+mid-life+in+Caenorhabditis+elegans.">Molecular characterization of the transition to mid-life in Caenorhabditis elegans.</a> AGE. 35 (3), 689-703 (2012).</li><li>Rea, S. L., Wu, D., Cypser, J. R., Vaupel, J. W., Johnson, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+stress-sensitive+reporter+predicts+longevity+in+isogenic+populations+of+Caenorhabditis+elegans.">A stress-sensitive reporter predicts longevity in isogenic populations of Caenorhabditis elegans.</a> Nature Genetics. 37 (8), 894-898 (2005).</li><li>Kinser, H. E., Mosley, M. C., Plutzer, I. B., Pincus, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global,+cell+non-autonomous+gene+regulation+drives+individual+lifespan+among+isogenic+C.+elegans.">Global, cell non-autonomous gene regulation drives individual lifespan among isogenic C. elegans.</a> eLife. , (2021).</li><li>Churgin, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Longitudinal+imaging+of+Caenorhabditis+elegans+in+a+microfabricated+device+reveals+variation+in+behavioral+decline+during+aging.">Longitudinal imaging of Caenorhabditis elegans in a microfabricated device reveals variation in behavioral decline during aging.</a> eLife. 6, 26652 (2017).</li><li>Perez, M. F., Francesconi, M., Hidalgo-Carcedo, C., Lehner, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maternal+age+generates+phenotypic+variation+in+Caenorhabditis+elegans.">Maternal age generates phenotypic variation in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 552 (7683), 106-109 (2017).</li><li>Baeriswyl, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+aging+profiles+in+isogenic+populations+of+Caenorhabditis+elegans+by+bacteria+causing+different+extrinsic+mortality+rates.">Modulation of aging profiles in isogenic populations of Caenorhabditis elegans by bacteria causing different extrinsic mortality rates.</a> Biogerontology. 11 (1), 53 (2009).</li><li>Taylor, M., Vega, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+immunity+alters+community+ecology+and+stability+of+the+microbiome+in+a+Caenorhabditis+elegans+model.">Host immunity alters community ecology and stability of the microbiome in a Caenorhabditis elegans model.</a> mSystems. 6 (2), 00608-00620 (2021).</li><li>Diaz, S. A., Restif, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spread+and+transmission+of+bacterial+pathogens+in+experimental+populations+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">Spread and transmission of bacterial pathogens in experimental populations of the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Applied and Environmental Microbiology. 80 (17), 5411-5418 (2014).</li><li>Twumasi-Boateng, K., Berg, M., Shapira, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+separation+of+C.+elegans+variably+colonized+by+a+bacterial+pathogen.">Automated separation of C. elegans variably colonized by a bacterial pathogen.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (85), e51090 (2014).</li><li>Ortiz, A., Vega, N. M., Ratzke, C., Gore, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interspecies+bacterial+competition+regulates+community+assembly+in+the+C.+elegans+intestine.">Interspecies bacterial competition regulates community assembly in the C. elegans intestine.</a> The ISME Journal. 15 (7), 2131-2145 (2021).</li><li>Berg, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGF&#946;/BMP+immune+signaling+affects+abundance+and+function+of+C.+elegans+gut+commensals.">TGF&#946;/BMP immune signaling affects abundance and function of C. elegans gut commensals.</a> Nature Communications. 10 (1), 604 (2019).</li><li>Portal-Celhay, C., Blaser, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Competition+and+resilience+between+founder+and+introduced+bacteria+in+the+Caenorhabditis+elegans+gut.">Competition and resilience between founder and introduced bacteria in the Caenorhabditis elegans gut.</a> Infection and Immunity. 80 (3), 1288-1299 (2012).</li><li>Scott, E., Holden-Dye, L., O'Connor, V., Wand, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intra+strain+variation+of+the+effects+of+gram-negative+ESKAPE+pathogens+on+intestinal+colonization,+host+viability,+and+host+response+in+the+model+organism+Caenorhabditis+elegans.">Intra strain variation of the effects of gram-negative ESKAPE pathogens on intestinal colonization, host viability, and host response in the model organism Caenorhabditis elegans.</a> Frontiers in Microbiology. 10, 3113 (2020).</li><li>Kamath, R. S., Martinez-Campos, M., Zipperlen, P., Fraser, A. G., Ahringer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effectiveness+of+specific+RNA-mediated+interference+through+ingested+double-stranded+RNA+in+Caenorhabditis+elegans.">Effectiveness of specific RNA-mediated interference through ingested double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.</a> Genome Biology. 2 (1), (2001).</li><li>Dirksen, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+native+microbiome+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans:+gateway+to+a+new+host-microbiome+model.">The native microbiome of the nematode Caenorhabditis elegans: gateway to a new host-microbiome model.</a> BMC Biology. 14, 38 (2016).</li><li>Vega, N. M., Allison, K. R., Samuels, A. N., Klempner, M. S., Collins, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salmonella+typhimurium+intercepts+Escherichia+coli+signaling+to+enhance+antibiotic+tolerance.">Salmonella typhimurium intercepts Escherichia coli signaling to enhance antibiotic tolerance.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (35), 14420-14425 (2013).</li><li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+C.+elegans.">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook. , (2006).</li><li>Tabara, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+rde-1+gene,+RNA+interference,+and+transposon+silencing+in+C.+elegans.">The rde-1 gene, RNA interference, and transposon silencing in C. elegans.</a> Cell. 99 (2), 123-132 (1999).</li><li>Ahringer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reverse+genetics.">Reverse genetics.</a> WormBook. , (2006).</li><li>Rual, J. -. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+improving+Caenorhabditis+elegans+phenome+mapping+with+an+ORFeome-based+RNAi+library.">Toward improving Caenorhabditis elegans phenome mapping with an ORFeome-based RNAi library.</a> Genome Research. 14 (10), 2162-2168 (2004).</li><li>Revtovich, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+characterization+of+high-throughput+Caenorhabditis+elegans+-+Enterococcus+faecium+infection+model.">Development and characterization of high-throughput Caenorhabditis elegans - Enterococcus faecium infection model.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 11, 667327 (2021).</li><li>Anderson, Q. L., Revtovich, A. V., Kirienko, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput,+high-content,+liquid-based+C.+elegans+pathosystem.">A high-throughput, high-content, liquid-based C. elegans pathosystem.</a> JoVE (Journal of Visualized Experiments. (137), e58068 (2018).</li><li>Scholz, M., Dinner, A. R., Levine, E., Biron, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stochastic+feeding+dynamics+arise+from+the+need+for+information+and+energy.">Stochastic feeding dynamics arise from the need for information and energy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (35), 9261-9266 (2017).</li><li>Wu, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pheromones+modulate+learning+by+regulating+the+balanced+signals+of+two+insulin-like+peptides.">Pheromones modulate learning by regulating the balanced signals of two insulin-like peptides.</a> Neuron. 104 (6), 1095-1109 (2019).</li><li>Ching, T. -. T., Hsu, A. -. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solid+plate-based+dietary+restriction+in+Caenorhabditis+elegans.">Solid plate-based dietary restriction in Caenorhabditis elegans.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (51), e2701 (2011).</li><li>Walker, A. C., Bhargava, R., Vaziriyan-Sani, A. S., Brust, A. S., Czyz, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+bacterial+loads+in+Caenorhabditis+elegans.">Quantification of bacterial loads in Caenorhabditis elegans.</a> Bio-protocol. 12 (2), 4291-4291 (2022).</li><li>Manjarrez, J. R., Mailler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress+and+timing+associated+with+Caenorhabditis+elegans+immobilization+methods.">Stress and timing associated with Caenorhabditis elegans immobilization methods.</a> Heliyon. 6 (7), 04263 (2020).</li><li>Zhang, S., Banerjee, D., Kuhn, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+larval+cells+from+C.+elegans.">Isolation and culture of larval cells from C. elegans.</a> PLoS ONE. 6 (4), 0019505 (2011).</li><li>Garsin, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-lived+C.+elegans+daf-2+mutants+are+resistant+to+bacterial+pathogens.">Long-lived C. elegans daf-2 mutants are resistant to bacterial pathogens.</a> Science. 300 (5627), 1921 (2003).</li><li>Thutupalli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Farming+and+public+goods+production+in+Caenorhabditis+elegans+populations.">Farming and public goods production in Caenorhabditis elegans populations.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (9), 2289-2294 (2017).</li><li>Ly, K., Reid, S. J., Snell, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+RNA+analysis+of+individual+Caenorhabditis+elegans.">Rapid RNA analysis of individual Caenorhabditis elegans.</a> MethodsX. 2, 59-63 (2015).</li><li>Johnke, J., Dirksen, P., Schulenburg, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Community+assembly+of+the+native+C.+elegans+microbiome+is+influenced+by+time,+substrate,+and+individual+bacterial+taxa.">Community assembly of the native C. elegans microbiome is influenced by time, substrate, and individual bacterial taxa.</a> Environmental Microbiology. 22 (4), 1265-1279 (2020).</li><li>Vega, N. M., Gore, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stochastic+assembly+produces+heterogeneous+communities+in+the+Caenorhabditis+elegans+intestine.">Stochastic assembly produces heterogeneous communities in the Caenorhabditis elegans intestine.</a> PLOS Biology. 15 (3), 2000633 (2017).</li><li>Gulyas, L., Powell, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cold+shock+induces+a+terminal+investment+reproductive+response+in+C.+elegans.">Cold shock induces a terminal investment reproductive response in C. elegans.</a> Scientific Reports. 12 (1), 1338 (2022).</li><li>Jiang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetic+program+mediates+cold-warming+response+and+promotes+stress-induced+phenoptosis+in+C.+elegans.">A genetic program mediates cold-warming response and promotes stress-induced phenoptosis in C. elegans.</a> eLife. 7, 35037 (2018).</li><li>Robinson, J. D., Powell, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+recovery+from+acute+cold+shock+in+Caenorhabditis+elegans.">Long-term recovery from acute cold shock in Caenorhabditis elegans.</a> BMC Cell Biology. 17 (1), 2 (2016).</li></ol>

Her presenteres data om fordelene med enkeltormskvantifisering av bakteriell belastning i C. elegans, sammen med en 96-brønns forstyrrelsesprotokoll for å muliggjøre rask og konsistent innsamling av store datasett av denne typen. Sammenlignet med eksisterende metoder33 tillater disse protokollene høyere gjennomstrømningsmåling av intestinale mikrobielle samfunn i ormen.
Denne tilnærmingen har plating som et hastighetsbegrensende trinn og er ikke virkelig...

Heterogenitet i vertsmikrobeforeninger observeres allestedsnærværende, og variasjon mellom individer blir i økende grad anerkjent som en medvirkende faktor i prosesser på populasjonsnivå fra konkurranse og sameksistens1 til sykdomsoverføring 2,3,4. I C. elegans har "skjult heterogenitet" innen isogene populasjoner blitt observert gjentatte ganger, med underpopulasjoner av individer som viser forskjellige fenotyper i varmesjokkrespons 5,6, aldring og levetid 7,8,9,10,11, og mange andre aspekter av fysiologi og utvikling12 . De fleste analyser som forsøker å identifisere subpopulasjonsstruktur gir bevis for to underpopulasjoner i eksperimentelle populasjoner av isogene, synkroniserte ormer 5,7,8, selv om andre data antyder muligheten for innenfor populasjonsfordeling av egenskaper i stedet for forskjellige grupper 7,12,13 . Av relevans her observeres betydelig heterogenitet i tarmpopulasjoner selv innenfor isogene populasjoner av ormer kolonisert fra en delt kilde til mikrober 13,14,15,16, og denne heterogeniteten kan skjules av batchfordøyelsesmålingene som er mye brukt 17,18,19,20 for bakteriell kvantifisering i ormen.
Dette arbeidet presenterer data som tyder på et behov for større avhengighet av enkeltormmålinger i vertsmikrobeforening, samt protokoller for å øke nøyaktigheten og gjennomstrømningen i enkeltormforstyrrelser. Disse protokollene er utformet for å lette mekanisk forstyrrelse av et stort antall individuelle C. elegans for kvantifisering av levedyktig bakteriebelastning, samtidig som det gir bedre repeterbarhet og lavere innsats per prøve enn pestlebasert forstyrrelse av individuelle ormer. Et anbefalt tarmrensende trinn, hvor ormer får lov til å mate på varmedrept E. coli før preparatet for forstyrrelse, er inkludert for å minimere bidrag fra nylig inntatt og andre forbigående (ikke-adhered) bakterier. Disse protokollene inkluderer en kaldlammelsesmetode for rengjøring av neglebåndet med en overflateblekemiddelbehandling med lav konsentrasjon; overflatebleking kan brukes som et forberedende trinn i enkeltormforstyrrelser eller som en metode for å forberede levende, eksternt bakteriefrie ormer. Denne overflateblekingsmetoden er tilstrekkelig til å fjerne et bredt spekter av eksterne mikrober, og kald behandling gir et alternativ til konvensjonell levamisolbasert lammelse; mens levamisol vil bli foretrukket for kaldfølsomme eksperimenter, minimerer kald lammelse bidrag til farlige avfallsstrømmer og tillater rask gjenopptakelse av normal aktivitet. Mens den fullstendige protokollen beskriver et laboratorieeksperiment der ormer koloniseres med kjente bakterier, kan prosedyrene for rengjøring av ormer og enkeltormforstyrrelser lett brukes på ormer isolert fra ville prøver eller kolonisert i mikrokosmoseksperimenter. Protokollene beskrevet her produserer levende bakterier ekstrahert fra ormtarmen, egnet for plating og kvantifisering av kolonidannende enheter (CFU) i individuelle ormer; for sekvenseringsbasert intestinal samfunnsanalyse, bør påfølgende cellelyse og nukleinsyreekstraksjonstrinn legges til disse protokollene.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>96-well flat-bottom polypropylene plates, 300 uL</td>
			<td>Evergreen Labware</td>
			<td>290-8350-03F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate sealing mat, silicon, square wells (AxyMat)</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>AM-2ML-SQ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plates, 2 mL, square wells</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>P-2ML-SQ-C-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well polypropylene plate lids</td>
			<td>Evergreen Labware</td>
			<td>290-8020-03L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>443570050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bead mill adapter set for 96-well plates</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>119900</td>
			<td>Adapter plates for use with two 96-well plates on the TissueLyser II</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bead mill tissue homogenizer (TissueLyser II)</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>85300</td>
			<td>Mechanical homogenizer for medium to high-throughput sample disruption</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioSorter</td>
			<td>Union Biometrica</td>
			<td>By quotation</td>
			<td>Large object sorter equipped with a 250 micron focus for C. elegans</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bleach, commercial, 8.25% sodium hypochlorite</td>
			<td>Clorox</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Breathe-Easy 96-well gas permeable sealing membrane</td>
			<td>Diversified Biotech</td>
			<td>BEM-1</td>
			<td>Multiwell plate gas permeable polyurethane membranes. Thin sealing film is permeable to O2, CO2, and water vapors and is UV transparent down to 300 nm. Sterile, 100/box.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride dihydrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC423525000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>AAA11470-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citric acid monohydrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC124910010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper (II) sulfate pentahydrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC197722500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 6765 LSE Mini Microcentrifuge</td>
			<td>Corning</td>
			<td>&#160;COR-6765</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disodium EDTA</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>409971000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL 1,4 Dithiothreitol, 99+%, for mol biology, DNAse, RNAse and Protease free, ACROS Organics</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>327190010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf 1.5 mL microcentrifuge tubes, natural</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf 5424R microcentrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5406000640</td>
			<td>24-place refrigerated benchtop microcentrifuge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf 5810R centrifuge with rotor S-4-104</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22627040</td>
			<td>3L benchtop centrifuge with adaptors for 15-50 mL tubes and plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf plate bucket (x2), for Rotor S-4-104</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22638930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 100%</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP2818500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass beads, 2.7 mm</td>
			<td>Life Science Products</td>
			<td>LS-79127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass beads, acid-washed, 425-600 &#181;m</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G877-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass plating beads</td>
			<td>VWR</td>
			<td>76005-124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH7204-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iron (II) sulfate heptahydrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>423731000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimble Kontes pellet pestle motor</td>
			<td>DWK Life Sciences</td>
			<td>749540-0000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimble Kontes polypropylene pellet pestles and microtubes, 0.5 mL</td>
			<td>DWK Life Sciences</td>
			<td>749520-0590</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica DMi8 motorized inverted microscope with motorized stage</td>
			<td>Leica</td>
			<td>11889113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica LAS X Premium software</td>
			<td>Leica</td>
			<td>11640687</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate heptahydrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC124900010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manganese(II) chloride tetrahydrate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>470301-706</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PARAFILM M flexible laboratory sealing film</td>
			<td>Amcor</td>
			<td>PM996</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptone</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1420-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes, round, 10 cm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25384-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes, round, 6 cm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25384-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes, square, 10 x 10 cm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10799-140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phospho-buffered saline (1X PBS)</td>
			<td>Gold Bio</td>
			<td>P-271-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene autoclave tray, shallow</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-361-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium hydroxide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC134062500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate dibasic</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP363-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP362-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R 4.1.3/RStudio 2022.02.0 build 443</td>
			<td>R Foundation</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scoop-type laboratory spatula, metal</td>
			<td>VWR</td>
			<td>470149-438</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon carbide 36 grit</td>
			<td>MJR Tumblers</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Black extra coarse silicon carbide grit. Available in 0.5-5 lb sizes from this vendor.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP166-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH7247-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic anhydrous</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP332-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodum chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP358-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC419760010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tri-potassium citrate monohydrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC611755000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP151-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zinc sulfate heptahydrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC205982500</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using single-worm data to quantify heterogeneity in caenorhabditis elegans-bacterial interactions

Nematoden Caenorhabditis elegans er et modellsystem for vert-mikrobe- og vertsmikrobiom-interaksjoner. Mange studier til dags dato bruker batchfordøyelser i stedet for individuelle ormprøver for å kvantifisere bakteriell belastning i denne organismen. Her argumenteres det for at den store interindividuelle variabiliteten sett i bakteriell kolonisering av C. elegans tarmen er informativ, og at batchfordøyelsesmetoder forkaster informasjon som er viktig for nøyaktig sammenligning på tvers av forhold. Som å beskrive variasjonen som ligger i disse prøvene krever et stort antall individer, etableres en praktisk 96-brønns plateprotokoll for forstyrrelse og kolonibelegg av individuelle ormer.

Blekemiddelsterilisering av levende ormer Overflateblekede ormer er effektivt fri for eksterne bakterier til motiliteten kommer tilbake og utskillelsen gjenopptas. Under de forhold som er brukt her, observeres rask utryddelse av bakterier i buffer (Figur 1A-C, Supplerende figur 2, Video 1) uten å forstyrre tarmassosierte bakterier i kaldparalyserte ormer (Figur 1D-F, Video 2...

Watch this Scientific Journal Video about Using Single-Worm Data to Quantify Heterogeneity in Caenorhabditis elegans-Bacterial Interactions at JoVE.com

Using Single-Worm Data to Quantify Heterogeneity in Caenorhabditis elegans-Bacterial Interactions

Denne protokollen beskriver en 96-brønns forstyrrelse av individuelle bakteriell koloniserte Caenorhabditis elegans etter kald lammelse og overflatebleking for å fjerne eksterne bakterier. Den resulterende suspensjonen er belagt på agarplater for å muliggjøre nøyaktig kvantifisering av bakteriebelastning i et stort antall individuelle ormer.

Bruke single-worm data for å kvantifisere heterogenitet i Caenorhabditis elegans-bakterielle interaksjoner

The nematode Caenorhabditis elegans is a model system for host-microbe and host-microbiome interactions. Many studies to date use batch digests rather ...

Denne protokollen demonstrerer mekanisk forstyrrelse av sjøeleganer. I et 96-brønnformat som tillater middels gjennomstrømningskvantifisering av bakteriell belastning i individuelle ormer. Denne teknikken øker hastigheten og ensartetheten av mekanisk forstyrrelse sammenlignet med Pasel-baserte metoder, slik at forskere enkelt kan produsere større datasett av høykvalitets enkeltormmålinger.Denne teknikken involverer mange bevegelige deler, og det er lett å miste plassen din. Forsikre deg om at du har alle materialer, merkede rør, buffere og plater satt opp før du begynner. Demonstrere prosedyren vil være Megan Taylor en forskningsspesialist leder fra laboratoriet mitt.Begynn med å suspendere ormprøven i en milliliter M ni TX null en i et mikrosentrifugerør. Samle de voksne ormene ved sentrifugering og kast supernatanten. Bruk de samme sentrifugeringsparametrene.Skyll ormene to ganger med en milliliter M9TX01 og en gang med en milliliter M9 ormbuffer, for å minimere de eksterne bakteriene. Deretter suspendere hver prøve i en milliliter S medium pluss to x varme drept OP50 i et kulturrør. Inkuber rørene ved 25 grader Celsius i 20 til 30 minutter for å passere de ikke-ad-vedlagte bakteriene fra tarmen.Etter inkubasjon, skyll de rensede ormene to ganger med en milliliter kald M9TX01 og kast super natanten. Legg rørene på is i 10 minutter for å lamme ormene. Tilsett deretter en milliliter iskald M ni ormbuffer med uparfymert blekemiddel til hvert rør.Inkuber rørene på is i minst 10 minutter for å drepe eksterne bakterier. Kast blekemiddelbufferen og returner rørene til isen for å forhindre at ormene pumper. Deretter legger du til en milliliter kald M9TX01 til hvert rør og sentrifuger i fem sekunder.I en mini sentrifuge. Sett rørene tilbake til is og fjern supernatanten. Gjenta dette trinnet én gang.For kjemisk permeabilisering av orm kutikula. Overfør rørene som inneholder ormene i 20 mikroliter buffer til et romtemperatur rørstativ. Tilsett deretter 100 mikroliter SDS / DTT-løsning til hver varm prøve.Inkuber rørene i opptil åtte minutter på benken for delvis å bryte ned neglebåndet til de voksne ormene. På dette tidspunktet vil ormene dø og bosette seg på bunnen av røret. Etter inkubasjon, kast forsiktig SDS / DTT-supernatanten.Deretter legger du til en milliliter M9TX01 til hvert rør og sentrifuger kort for å pelletere ormene. Kast supernatanten og heng ormene i en milliliter M ni ormbuffer med 0,1% Triton x-100. For å forberede seg på mekanisk forstyrrelse av ormer, oppnå en steril to milliliter dyp brønn 96 brønnplate og et silikonplatedeksel.Bruk en steril scoop spatel for å legge til en liten mengde steril 36 grid silikonkarbid til hver brønn slik at rutenettet knapt dekker bunnen av brønnen. Tilsett 180 mikroliter M ni ormbuffer til hver brønn. Merk kolonnene og radene, og dekk deretter platen løst med silikonplatedekselet.Deretter overfører du permeabiliserte ormer til en liten petriskål med M9TX01 fylt opp til en dybde på en centimeter. Ved hjelp av et dissekeringsmikroskop pipetter ut individuelle ormer i 20 mikroliter volumer og overfør dem til individuelle brønner på 96-brønnplaten for å kaste ut eventuelle ormer som sitter fast i pipetten, aspirer 20 mikroliter M9TX01 fra et klart område av petriskålen og slipp den tilbake i parabolen. Når alle ormer er overført, dekk til 96-brønnplaten med et ark fleksibel takfilm med papirbaksiden vendt ned på prøvebrønnene.Plasser silikontakmatten lett på toppen av den fleksible takfilmen uten å trykke dekselet ned i brønnene. Plasser platen ved fire grader Celsius i 30 til 60 minutter for å forhindre overoppheting under forstyrrelse. Etter avkjøling presser du silikontakmatten godt ned i brønnene for å forsegle dem.Fest deretter plater i vevsforstyrreren. Rist platene i ett minutt på 30 hertz. Roter deretter platene 180 grader og gjenta ristingen i ett minutt.Trykk platene godt på benken to eller tre ganger for å løsne grus fra den fleksible takfilmen. Sentrifuge platen satt 2.400 ganger G i to minutter for å samle prøvene på bunnen av brønnene. Fjern deretter silikonlokket og trekk av takfilmen.For å forberede ti ganger seriell fortynning av ormen fordøyer, fyll 180 mikroliter av en X PBS i rad B til D av en 96 brønnplate. Bruk en pipetter med flere brønner satt til 200 mikroliter, bland sakte ormfordøyelsen ved pipettering. Overfør maksimal mengde væske til rad A av 96-brønnplaten som inneholder PBS.Bruk en flerkanalspipette, fjern 20 mikroliter fra den øverste raden og dispenser i rad B.Etterfulgt av blanding. Gjenta dette trinnet for rad B til C og deretter rad C til D for å få en 1000 ganger fortynning For bakteriell kvantifisering av monokoloniserte ormer. Plate 10 til 20 mikroliter av hver fortynning på faste agarplater.For kolonisering av flere arter, plate 100 mikroliter av hver fortynning på 10 centimeter agarplater. Ved hjelp av denne protokollen ble effektiv ekstern sanitisering observert etter overflatebleking av kalde lammede ormer sett ved nedgangen av eksterne bakterier i buffer. Uten å påvirke tarmassosierte bakterier.Manuell forstyrrelse av ormer resulterte i mer heterogenitet. Silikonkarbidkorn var ideell for forstyrrelser med eller uten Tri Andex. I 96-brønnmetoden var store glassperler ikke egnet for 96-brønnteknikken.Små glassperler ga konsistente resultater, men tettet røret på spissen. Ormer kolonisert på samme basseng av bakterier viste høy variasjon i tarmbelastning når observert for individuelle bakterier og multi-arter bakteriesamfunn. Ormer kolonisert med bakterier som uttrykker GFP, viste heterogenitet i individuelle ormmålinger.For denne GFP uttrykker bakteriestamme sammenligne kolonisering av vill type Bristol Len to ormer. For DAF viste to IGF-mutanter at DAF 16-mutanten støtter større populasjoner av bakterier, mens DAF to er resistente mot kolonisering. Denne heterogeniteten var karakteristisk og konsistent over forskjellige løp av samme eksperiment.Resampling av data for å simulere batchfordøyelser ble funnet å endre fordelingen sammenlignet med individuelle ormdata. Den batch-ekstrapolerte CFU per orm var sentrert rundt det aritmetiske gjennomsnittet av de individuelle dataene som førte til tap av biologisk variasjon. I stedet for å fortsette å fordøye levende overflateblekemiddel og skylle ormer kan brukes til videre eksperimenter.Bevegelsen vil fortsette raskt når ormer er fjernet fra kulde.

Research

JoVE Journal

Biology

Using Single-Worm Data to Quantify Heterogeneity in Caenorhabditis elegans-Bacterial Interactions

Analysis of Schwann-astrocyte Interactions Using In Vitro Assays

Analysis of Schwann-astrocyte Interactions Using In Vitro Assays

Schwann cells are one of the commonly used cells in repair strategies following spinal cord injuries. Schwann cells are capable of supporting axonal ...

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes.  The transparency of the 
embryos, the genetic ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

Using Coculture to Detect Chemically Mediated Interspecies Interactions

Bruke coculture å oppdage Kjemisk mediert uspesifikt Interaksjoner

In nature, bacteria rarely exist in isolation; they are instead surrounded by a diverse array of other microorganisms that alter the local environment by ...

A Screenable In Vivo Assay for Mitochondrial Modulators Using Transgenic Bioluminescent Caenorhabditis elegans

A Screenable In Vivo Assay for Mitochondrial Modulators Using Transgenic Bioluminescent Caenorhabditis elegans

En silbart<em&gt; I Vivo</em&gt; Analyse for mitokondrie modulatorer Bruke Transgenic Bioluminescent<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

The multicellular model organism Caenorhabditis elegans is a small nematode of approximately 1 mm in size in adulthood that is genetically and ...

Techniques to Induce and Quantify Cellular Senescence

Teknikker for å indusere og kvantifisere Cellular Senescence

In response to cellular stress or damage, proliferating cells can induce a specific program that initiates a state of long-term cell-cycle arrest, termed ...

Methods to Study Changes in Inherent Protein Aggregation with Age in Caenorhabditis elegans

Methods to Study Changes in Inherent Protein Aggregation with Age in Caenorhabditis elegans

Metoder for å studere endringer i iboende Protein samling med alder i Caenorhabditis elegans

In the last decades, the prevalence of neurodegenerative disorders, such as Alzheimer's disease (AD) and Parkinson's disease (PD), has grown. These ...

Nasal Potential Difference to Quantify Trans-epithelial Ion Transport in Mice

Nasal potensiell forskjell å kvantifisere Trans-epitelial Ion Transport i mus

The nasal potential difference test has been used for almost three decades to assist in the diagnosis of cystic fibrosis (CF). It has proven to be helpful ...

Using Caenorhabditis elegans to Screen for Tissue-Specific Chaperone Interactions

Using Caenorhabditis elegans to Screen for Tissue-Specific Chaperone Interactions

Bruke Caenorhabditis elegans til å screene for vevsspesifikke chaperone interaksjoner

Correct folding and assembly of proteins and protein complexes are essential for cellular function. Cells employ quality control pathways that correct, ...

High-Throughput Live Imaging of Microcolonies to Measure Heterogeneity in Growth and Gene Expression

Live Imaging av mikrokolonier med høy gjennomstrømning for å måle heterogenitet i vekst og genuttrykk

Precise measurements of between- and within-strain heterogeneity in microbial growth rates are essential for understanding genetic and environmental ...