Name: using single-worm data to quantify heterogeneity in caenorhabditis elegans-bacterial interactions
Uploaded: 2022-07-22T14:20:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using Single-Worm Data to Quantify Heterogeneity in Caenorhabditis elegans-Bacterial Interactions at JoVE.com

Os autores gostariam de reconhecer H. Schulenberg e C. LaRock por seu generoso compartilhamento de cepas bacterianas usadas nesses experimentos. Este trabalho foi apoiado por financiamento da Universidade Emory e da NSF (PHY2014173).

Os vermes utilizados nesses experimentos foram obtidos do Centro Genético de Caenorhabditis , que é financiado pelo NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440). Bristol N2 é do tipo selvagem. Os mutantes DAF-2/IGF daf-16(mu86) I (CGC CF1038) e daf-2(e1370) III (CGC CB1370) são usados para ilustrar diferenças na carga bacteriana intestinal.
HT115(DE3) E. coli carregando o vetor pos-1 RNAi é da biblioteca Ahringer<sup class="xr...

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	<li>Armitage, D. W., Jones, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+sample+heterogeneity+can+obscure+the+signal+of+microbial+interactions.">How sample heterogeneity can obscure the signal of microbial interactions.</a> The ISME Journal. 13 (11), 2639-2646 (2019).</li><li>Stephenson, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+heterogeneity+affects+both+parasite+transmission+to+and+fitness+on+subsequent+hosts.">Host heterogeneity affects both parasite transmission to and fitness on subsequent hosts.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 372 (1719), 20160093 (2017).</li><li>VanderWaal, K. L., Ezenwa, V. 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I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heat+shock+changes+the+heterogeneity+distribution+in+populations+of+Caenorhabditis+elegans+does+it+tell+us+anything+about+the+biological+mechanism+of+stress+response.">Heat shock changes the heterogeneity distribution in populations of Caenorhabditis elegans does it tell us anything about the biological mechanism of stress response.</a> The Journals of Gerontology Series A: Biological Sciences and Medical Sciences. 57 (3), 83-92 (2002).</li><li>Zhao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+forms+of+death+in+ageing+Caenorhabditis+elegans.">Two forms of death in ageing Caenorhabditis elegans.</a> Nature Communications. 8 (1), 1-8 (2017).</li><li>Eckley, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+characterization+of+the+transition+to+mid-life+in+Caenorhabditis+elegans.">Molecular characterization of the transition to mid-life in Caenorhabditis elegans.</a> AGE. 35 (3), 689-703 (2012).</li><li>Rea, S. L., Wu, D., Cypser, J. R., Vaupel, J. W., Johnson, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+stress-sensitive+reporter+predicts+longevity+in+isogenic+populations+of+Caenorhabditis+elegans.">A stress-sensitive reporter predicts longevity in isogenic populations of Caenorhabditis elegans.</a> Nature Genetics. 37 (8), 894-898 (2005).</li><li>Kinser, H. E., Mosley, M. C., Plutzer, I. 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M., Ratzke, C., Gore, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interspecies+bacterial+competition+regulates+community+assembly+in+the+C.+elegans+intestine.">Interspecies bacterial competition regulates community assembly in the C. elegans intestine.</a> The ISME Journal. 15 (7), 2131-2145 (2021).</li><li>Berg, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGF&#946;/BMP+immune+signaling+affects+abundance+and+function+of+C.+elegans+gut+commensals.">TGF&#946;/BMP immune signaling affects abundance and function of C. elegans gut commensals.</a> Nature Communications. 10 (1), 604 (2019).</li><li>Portal-Celhay, C., Blaser, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Competition+and+resilience+between+founder+and+introduced+bacteria+in+the+Caenorhabditis+elegans+gut.">Competition and resilience between founder and introduced bacteria in the Caenorhabditis elegans gut.</a> Infection and Immunity. 80 (3), 1288-1299 (2012).</li><li>Scott, E., Holden-Dye, L., O'Connor, V., Wand, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intra+strain+variation+of+the+effects+of+gram-negative+ESKAPE+pathogens+on+intestinal+colonization,+host+viability,+and+host+response+in+the+model+organism+Caenorhabditis+elegans.">Intra strain variation of the effects of gram-negative ESKAPE pathogens on intestinal colonization, host viability, and host response in the model organism Caenorhabditis elegans.</a> Frontiers in Microbiology. 10, 3113 (2020).</li><li>Kamath, R. S., Martinez-Campos, M., Zipperlen, P., Fraser, A. 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F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+improving+Caenorhabditis+elegans+phenome+mapping+with+an+ORFeome-based+RNAi+library.">Toward improving Caenorhabditis elegans phenome mapping with an ORFeome-based RNAi library.</a> Genome Research. 14 (10), 2162-2168 (2004).</li><li>Revtovich, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+characterization+of+high-throughput+Caenorhabditis+elegans+-+Enterococcus+faecium+infection+model.">Development and characterization of high-throughput Caenorhabditis elegans - Enterococcus faecium infection model.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 11, 667327 (2021).</li><li>Anderson, Q. L., Revtovich, A. V., Kirienko, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput,+high-content,+liquid-based+C.+elegans+pathosystem.">A high-throughput, high-content, liquid-based C. elegans pathosystem.</a> JoVE (Journal of Visualized Experiments. (137), e58068 (2018).</li><li>Scholz, M., Dinner, A. R., Levine, E., Biron, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stochastic+feeding+dynamics+arise+from+the+need+for+information+and+energy.">Stochastic feeding dynamics arise from the need for information and energy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (35), 9261-9266 (2017).</li><li>Wu, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pheromones+modulate+learning+by+regulating+the+balanced+signals+of+two+insulin-like+peptides.">Pheromones modulate learning by regulating the balanced signals of two insulin-like peptides.</a> Neuron. 104 (6), 1095-1109 (2019).</li><li>Ching, T. -. T., Hsu, A. -. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solid+plate-based+dietary+restriction+in+Caenorhabditis+elegans.">Solid plate-based dietary restriction in Caenorhabditis elegans.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (51), e2701 (2011).</li><li>Walker, A. C., Bhargava, R., Vaziriyan-Sani, A. S., Brust, A. S., Czyz, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+bacterial+loads+in+Caenorhabditis+elegans.">Quantification of bacterial loads in Caenorhabditis elegans.</a> Bio-protocol. 12 (2), 4291-4291 (2022).</li><li>Manjarrez, J. 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M., Gore, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stochastic+assembly+produces+heterogeneous+communities+in+the+Caenorhabditis+elegans+intestine.">Stochastic assembly produces heterogeneous communities in the Caenorhabditis elegans intestine.</a> PLOS Biology. 15 (3), 2000633 (2017).</li><li>Gulyas, L., Powell, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cold+shock+induces+a+terminal+investment+reproductive+response+in+C.+elegans.">Cold shock induces a terminal investment reproductive response in C. elegans.</a> Scientific Reports. 12 (1), 1338 (2022).</li><li>Jiang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetic+program+mediates+cold-warming+response+and+promotes+stress-induced+phenoptosis+in+C.+elegans.">A genetic program mediates cold-warming response and promotes stress-induced phenoptosis in C. elegans.</a> eLife. 7, 35037 (2018).</li><li>Robinson, J. D., Powell, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+recovery+from+acute+cold+shock+in+Caenorhabditis+elegans.">Long-term recovery from acute cold shock in Caenorhabditis elegans.</a> BMC Cell Biology. 17 (1), 2 (2016).</li></ol>

Aqui os dados são apresentados sobre as vantagens da quantificação de um único verme da carga bacteriana em C. elegans, juntamente com um protocolo de interrupção de 96 poços para permitir a rápida e consistente aquisição de grandes conjuntos de dados deste tipo. Em comparação com os métodos existentes33, esses protocolos permitem uma medição de maior rendimento das comunidades microbianas intestinais no verme.
Essa abordagem tem o revestimento c...

A heterogeneidade nas associações hospedeiras-micróbios é observada de forma onipresente, e a variação entre os indivíduos é cada vez mais reconhecida como fator contribuinte nos processos de nível populacional desde a concorrência e a convivência1 até a transmissão da doença 2,3,4. Em C. elegans, a "heterogeneidade oculta" dentro das populações isogênicas tem sido observada repetidamente, com sub-populações de indivíduos apresentando fenótipos distintos na resposta ao choque térmico 5,6, envelhecimento e vida útil 7,8,9,10,11, e muitos outros aspectos da fisiologia e desenvolvimento12 . A maioria das análises que tentam identificar a estrutura sub-populacional fornecem evidências para duas subsédias em populações experimentais de vermes isogênicos e sincronizados 5,7,8, embora outros dados sugiram a possibilidade de distribuições dentro da população de traços em vez de grupos distintos 7,12,13 . De relevância aqui, observa-se uma heterogeneidade substancial nas populações intestinais mesmo dentro de populações isogênicas de vermes colonizados a partir de uma fonte compartilhada de micróbios 13,14,15,16, e essa heterogeneidade pode ser ocultada pelas medições de digestão em lote que são amplamente utilizadas 17,18,19,20 para quantificação bacteriana no verme.
Este trabalho apresenta dados que sugerem uma necessidade de maior dependência de medições de um único verme na associação hospedeiro-micróbio, bem como protocolos para aumentar a precisão e o throughput na interrupção de um único worm. Estes protocolos são projetados para facilitar a interrupção mecânica de um grande número de C. elegans individuais para quantificação de carga bacteriana viável, ao mesmo tempo em que fornecem melhor repetibilidade e menor esforço por amostra do que a interrupção baseada em pilão de vermes individuais. Uma etapa recomendada de purificação intestinal, onde os vermes são autorizados a se alimentar de E. coli morto pelo calor antes da preparação para a interrupção, está incluído para minimizar contribuições de bactérias recém-ingeridas e outras bactérias transitórias (não aderidas). Estes protocolos incluem um método de paralisia fria para limpar a cutícula com um tratamento de alvejante superficial de baixa concentração; o branqueamento da superfície pode ser usado como um passo preparatório na interrupção de um único verme ou como um método para preparar vermes vivos e externamente livres de germes. Este método de branqueamento superficial é suficiente para remover uma ampla gama de micróbios externos, e o tratamento a frio fornece uma alternativa à paralisia convencional à base de levamisola; Enquanto o levamisole será preferido para experimentos sensíveis ao frio, a paralisia fria minimiza as contribuições para fluxos de resíduos perigosos e permite a rápida retomada da atividade normal. Enquanto o protocolo completo descreve um experimento de laboratório onde os vermes são colonizados com bactérias conhecidas, os procedimentos para limpar vermes e interrupção de um único verme podem ser facilmente aplicados a vermes isolados de amostras selvagens ou colonizados em experimentos de microcosmo. Os protocolos descritos aqui produzem bactérias vivas extraídas do intestino de verme, adequadas para chapeamento e quantificação de unidades formadoras de colônias (UFC) em vermes individuais; para análise da comunidade intestinal baseada em sequenciamento, devem ser adicionadas etapas subsequentes de lise celular e extração de ácido nucleico a esses protocolos.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>96-well flat-bottom polypropylene plates, 300 uL</td>
			<td>Evergreen Labware</td>
			<td>290-8350-03F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate sealing mat, silicon, square wells (AxyMat)</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>AM-2ML-SQ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plates, 2 mL, square wells</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>P-2ML-SQ-C-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well polypropylene plate lids</td>
			<td>Evergreen Labware</td>
			<td>290-8020-03L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>443570050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bead mill adapter set for 96-well plates</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>119900</td>
			<td>Adapter plates for use with two 96-well plates on the TissueLyser II</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bead mill tissue homogenizer (TissueLyser II)</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>85300</td>
			<td>Mechanical homogenizer for medium to high-throughput sample disruption</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioSorter</td>
			<td>Union Biometrica</td>
			<td>By quotation</td>
			<td>Large object sorter equipped with a 250 micron focus for C. elegans</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bleach, commercial, 8.25% sodium hypochlorite</td>
			<td>Clorox</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Breathe-Easy 96-well gas permeable sealing membrane</td>
			<td>Diversified Biotech</td>
			<td>BEM-1</td>
			<td>Multiwell plate gas permeable polyurethane membranes. Thin sealing film is permeable to O2, CO2, and water vapors and is UV transparent down to 300 nm. Sterile, 100/box.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride dihydrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC423525000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>AAA11470-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citric acid monohydrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC124910010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper (II) sulfate pentahydrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC197722500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 6765 LSE Mini Microcentrifuge</td>
			<td>Corning</td>
			<td>&#160;COR-6765</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disodium EDTA</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>409971000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL 1,4 Dithiothreitol, 99+%, for mol biology, DNAse, RNAse and Protease free, ACROS Organics</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>327190010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf 1.5 mL microcentrifuge tubes, natural</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf 5424R microcentrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5406000640</td>
			<td>24-place refrigerated benchtop microcentrifuge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf 5810R centrifuge with rotor S-4-104</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22627040</td>
			<td>3L benchtop centrifuge with adaptors for 15-50 mL tubes and plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf plate bucket (x2), for Rotor S-4-104</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22638930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 100%</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP2818500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass beads, 2.7 mm</td>
			<td>Life Science Products</td>
			<td>LS-79127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass beads, acid-washed, 425-600 &#181;m</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G877-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass plating beads</td>
			<td>VWR</td>
			<td>76005-124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH7204-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iron (II) sulfate heptahydrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>423731000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimble Kontes pellet pestle motor</td>
			<td>DWK Life Sciences</td>
			<td>749540-0000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimble Kontes polypropylene pellet pestles and microtubes, 0.5 mL</td>
			<td>DWK Life Sciences</td>
			<td>749520-0590</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica DMi8 motorized inverted microscope with motorized stage</td>
			<td>Leica</td>
			<td>11889113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica LAS X Premium software</td>
			<td>Leica</td>
			<td>11640687</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate heptahydrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC124900010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manganese(II) chloride tetrahydrate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>470301-706</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PARAFILM M flexible laboratory sealing film</td>
			<td>Amcor</td>
			<td>PM996</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptone</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1420-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes, round, 10 cm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25384-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes, round, 6 cm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25384-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes, square, 10 x 10 cm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10799-140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phospho-buffered saline (1X PBS)</td>
			<td>Gold Bio</td>
			<td>P-271-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene autoclave tray, shallow</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-361-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium hydroxide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC134062500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate dibasic</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP363-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP362-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R 4.1.3/RStudio 2022.02.0 build 443</td>
			<td>R Foundation</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scoop-type laboratory spatula, metal</td>
			<td>VWR</td>
			<td>470149-438</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon carbide 36 grit</td>
			<td>MJR Tumblers</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Black extra coarse silicon carbide grit. Available in 0.5-5 lb sizes from this vendor.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP166-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH7247-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic anhydrous</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP332-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodum chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP358-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC419760010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tri-potassium citrate monohydrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC611755000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP151-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zinc sulfate heptahydrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC205982500</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using single-worm data to quantify heterogeneity in caenorhabditis elegans-bacterial interactions

O nematode Caenorhabditis elegans é um sistema modelo para interações hospedeiro-micróbio e hospedeiro-microbioma. Muitos estudos até o momento usam digerir em lote em vez de amostras individuais de vermes para quantificar a carga bacteriana neste organismo. Argumenta-se aqui que a grande variabilidade inter-individual observada na colonização bacteriana do intestino C. elegans é informativa, e que os métodos de digestão em lote descartam informações que são importantes para uma comparação precisa entre as condições. Como descrever a variação inerente a essas amostras requer um grande número de indivíduos, um conveniente protocolo de placa de 96 poços para interrupção e revestimento de colônia de vermes individuais é estabelecido.

Esterilização alvejante de vermes vivos Vermes branqueados na superfície são efetivamente livres de bactérias externas até que a motilidade retorne e a excreção retome. Nas condições aqui utilizadas, observa-se a rápida extinção de bactérias no tampão (Figura 1A-C, Figura Suplementar 2, Vídeo 1) sem perturbar as bactérias associadas ao intestino em vermes paralisados a frio (Figura 1D-F<stron...

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Using Single-Worm Data to Quantify Heterogeneity in Caenorhabditis elegans-Bacterial Interactions

Este protocolo descreve uma interrupção de 96 poços de caenorhabditis colonizada individualmente elegans após paralisia fria e branqueamento superficial para remover bactérias externas. A suspensão resultante é emplacada em placas de ágar para permitir quantificação precisa e média de carga bacteriana em um grande número de vermes individuais.

Usando dados de verme único para quantificar a heterogeneidade em Interações elegans-bacterianas de Caenorhabditis

The nematode Caenorhabditis elegans is a model system for host-microbe and host-microbiome interactions. Many studies to date use batch digests rather ...

Este protocolo demonstra a interrupção mecânica dos elegans marinhos. Em um formato de poço 96 permitindo quantificação média de rendimento de carga bacteriana em vermes individuais. Esta técnica aumenta a velocidade e a uniformidade da interrupção mecânica em comparação com os métodos baseados em Pasel, permitindo que os pesquisadores produzam facilmente conjuntos de dados maiores de medições de vermes únicos de alta qualidade.Esta técnica envolve muitas partes móveis e é fácil perder seu lugar. Certifique-se de ter todos os materiais, tubos rotulados, tampões e placas configurados antes do início. Demonstrando o procedimento será Megan Taylor uma especialista em pesquisa líder do meu laboratório.Comece suspendendo a amostra de vermes em um mililitro de M9 TX zero um em um tubo de micro centrífuga. Colete os vermes adultos por centrifugação e descarte o supernatante. Usando os mesmos parâmetros de centrifugação.Enxágüe os vermes duas vezes com um mililitro de M9TX01 e uma vez com um mililitro de tampão de minhoca M9, para minimizar as bactérias externas. Em seguida, suspender novamente cada amostra em um mililitro de S médio mais dois x calor matou OP50 em um tubo de cultura. Incubar os tubos a 25 graus Celsius por 20 a 30 minutos para passar as bactérias não ad aderidas do intestino.Após a incubação, enxágue os vermes purgados duas vezes com um mililitro de M9TX01 frio e descarte o super natant. Coloque os tubos no gelo por 10 minutos para paralisar os vermes. Em seguida, adicione um mililitro de gelo frio M nove tampão de verme com alvejante não perfumado a cada tubo.Incubar os tubos no gelo por um mínimo de 10 minutos para matar bactérias externas. Descarte o tampão de alvejante e devolva os tubos ao gelo para evitar que os vermes bombeiem. Em seguida, adicione um mililitro de M9TX01 frio a cada tubo e centrífuga por cinco segundos.Em uma mini centrífuga. Devolva os tubos ao gelo e remova o supernasal. Repita este passo uma vez.Para permeabilização química da cutícula de verme. Transfira os tubos contendo os vermes em 20 microliters de tampão para um rack de tubo de temperatura ambiente. Em seguida, adicione 100 microliters de solução SDS/DTT a cada amostra quente.Incubar os tubos por até oito minutos no banco para quebrar parcialmente a cutícula dos vermes adultos. Neste ponto, os vermes morrerão e se estabelecerão no fundo do tubo. Após a incubação, descarte cuidadosamente o supernatante SDS/DTT.Em seguida, adicione um mililitro de M9TX01 a cada tubo e centrífuga brevemente para pellet os vermes. Descarte o supernasal e suspenda os vermes em um mililitro M nove tampão de verme com 0,1%Triton x-100. Para se preparar para a interrupção mecânica dos vermes, obtenha um poço de dois mililitros de profundidade e uma tampa de placa de silicone.Use uma espátula estéril para adicionar uma pequena quantidade de carboneto de silicone de 36 grade estéril a cada poço, de tal forma que a grade mal cubra a parte inferior do poço. Adicione 180 microliters de M nove tampão de vermes a cada poço. Rotule as colunas e as linhas e cubra a placa com a tampa da placa de silicone.Em seguida, transfira os vermes permeabilizados para uma pequena placa de Petri com M9TX01 preenchido até uma profundidade de um centímetro. Usando uma pipeta de microscópio dissecando vermes individuais em 20 volumes de microliteres e transferi-los para poços individuais da placa de poço 96 para ejetar quaisquer vermes presos à pipeta, aspirar 20 microlitros de M9TX01 de uma área clara da placa de Petri e liberá-lo de volta para a placa. Uma vez que todos os vermes são transferidos cubra a placa 96 com uma folha de filme de teto flexível com o lado apoiado de papel voltado para os poços de amostra.Coloque levemente o tapete do teto de silicone em cima do filme de teto flexível sem pressionar a tampa para baixo nos poços. Coloque a placa a quatro graus Celsius por 30 a 60 minutos para evitar superaquecimento durante a interrupção. Depois de esfriar a placa pressione o tapete do teto de silicone firmemente para baixo nos poços para selá-los.Em seguida, proteja as placas no disruptor do tecido. Agite as placas por um minuto a 30 hertz. Em seguida, gire as placas em 180 graus e repita tremendo por um minuto.Toque firmemente nas placas no banco duas ou três vezes para desalojar qualquer grão do filme de teto flexível. Centrifugar a placa definida 2.400 vezes G por dois minutos para coletar as amostras na parte inferior dos poços. Em seguida, remova a tampa de silicone e retire o filme do teto.Para preparar a diluição serial de dez vezes dos digestores de vermes, encha 180 microliters de um X PBS nas fileiras B a D de uma placa de 96 poços. Usando um pipetter multi-poço definido para 200 microliters, misture lentamente o digestor do verme por pipetação. Transfira o valor máximo do líquido para a linha A da placa do poço 96 contendo PBS.Usando uma pipeta multicanal, remova 20 microliters da linha superior e dispense na linha B.Seguido pela mistura. Repita este passo para a linha B para C e, em seguida, linha C a D para obter uma diluição de 1000 vezes para quantificação bacteriana de vermes mono colonizados. Placa 10 a 20 microliters de cada diluição em placas de ágar sólidos.Para a colonização de várias espécies, placa 100 microlitres de cada diluição em placas de ágar de 10 centímetros. Utilizando este protocolo, observou-se higienização externa eficaz após o branqueamento superficial de vermes paralisados a frio, como visto pelo declínio de bactérias externas no buffer. Sem afetar as bactérias associadas ao intestino.A interrupção manual dos vermes resultou em mais heterogeneidade. O grão de carboneto de silicone era ideal para interrupção com ou sem Tri Andex. No método 96, grandes contas de vidro não foram adequadas para a técnica 96 bem.Pequenas contas de vidro produziram resultados consistentes, mas entupiram o tubo na ponta. Vermes colonizados no mesmo pool de bactérias apresentaram alta variação na carga intestinal quando observados para bactérias individuais e comunidades bacterianas multi-espécies. Vermes colonizados com bactérias que expressam GFP, mostraram heterogeneidade em medições individuais de vermes.Para este GFP expressando tensão bacteriana comparando a colonização do tipo selvagem Bristol Len dois vermes. Para daf dois mutantes IGF mostraram que o mutante DAF 16 suporta populações maiores de bactérias, enquanto DAF dois é resistente à colonização. Essa heterogeneidade foi característica e consistente ao longo de diferentes corridas do mesmo experimento.A re amostragem de dados para simular digestos em lote foi encontrada para alterar a distribuição em comparação com dados individuais de vermes. O lote extrapolado da UFC por verme foi centrado em torno da média aritmética dos dados individuais que levaram à perda de variação biológica. Em vez de proceder para digerir alvejante da superfície viva e enxaguar vermes pode ser usado para outros experimentos.O movimento será retomado rapidamente assim que os vermes forem removidos do frio.

Research

JoVE Journal

Biology

Using Single-Worm Data to Quantify Heterogeneity in Caenorhabditis elegans-Bacterial Interactions

Analysis of Schwann-astrocyte Interactions Using In Vitro Assays

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Análise de Schwann-astrócito Interações Usando In Vitro Ensaios

Schwann cells are one of the commonly used cells in repair strategies following spinal cord injuries. Schwann cells are capable of supporting axonal ...

Biologia

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

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Lapso de tempo Microscopia de embriogênese inicial em Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes.  The transparency of the 
embryos, the genetic ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

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The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

Using Coculture to Detect Chemically Mediated Interspecies Interactions

Usando Coculture detectar quimicamente mediada interespécies Interações

In nature, bacteria rarely exist in isolation; they are instead surrounded by a diverse array of other microorganisms that alter the local environment by ...

A Screenable In Vivo Assay for Mitochondrial Modulators Using Transgenic Bioluminescent Caenorhabditis elegans

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A rastreï¿½el<em&gt; In Vivo</em&gt; Ensaio para mitocondrial Modulators Usando Transgenic Bioluminescent<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

The multicellular model organism Caenorhabditis elegans is a small nematode of approximately 1 mm in size in adulthood that is genetically and ...

Techniques to Induce and Quantify Cellular Senescence

Técnicas para induzir e quantificar a senescência celular

In response to cellular stress or damage, proliferating cells can induce a specific program that initiates a state of long-term cell-cycle arrest, termed ...

Methods to Study Changes in Inherent Protein Aggregation with Age in Caenorhabditis elegans

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Métodos de estudo mudanças na agregação de proteínas inerente com a idade em Caenorhabditis elegans

In the last decades, the prevalence of neurodegenerative disorders, such as Alzheimer's disease (AD) and Parkinson's disease (PD), has grown. These ...

Nasal Potential Difference to Quantify Trans-epithelial Ion Transport in Mice

Diferença de potencial nasal para quantificar o transporte do íon Trans-epitelial em ratos

The nasal potential difference test has been used for almost three decades to assist in the diagnosis of cystic fibrosis (CF). It has proven to be helpful ...

Using Caenorhabditis elegans to Screen for Tissue-Specific Chaperone Interactions

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Usando elegans caenorhabditis para tela para interações de acompanhantes específicas de tecido

Correct folding and assembly of proteins and protein complexes are essential for cellular function. Cells employ quality control pathways that correct, ...

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Imagem ao vivo de alta taxa de microcolônias para medir heterogeneidade no crescimento e expressão genética

Precise measurements of between- and within-strain heterogeneity in microbial growth rates are essential for understanding genetic and environmental ...