Name: using single-worm data to quantify heterogeneity in caenorhabditis elegans-bacterial interactions
Uploaded: 2022-07-22T14:20:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using Single-Worm Data to Quantify Heterogeneity in Caenorhabditis elegans-Bacterial Interactions at JoVE.com

Авторы хотели бы поблагодарить Х. Шуленберга и К. ЛаРока за их щедрое совместное использование бактериальных штаммов, используемых в этих экспериментах. Эта работа была поддержана финансированием Университета Эмори и NSF (PHY2014173).

Черви, используемые в этих экспериментах, были получены из Генетического центра Caenorhabditis , который финансируется Управлением исследовательских инфраструктурных программ NIH (P40 OD010440). Бристоль N2 относится к дикому типу. Мутанты DAF-2/IGF daf-16(mu86) I (CGC CF1038) и daf-2(e1370) III (CGC CB1370) исполь?...

<ol>
	<li>Armitage, D. W., Jones, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+sample+heterogeneity+can+obscure+the+signal+of+microbial+interactions.">How sample heterogeneity can obscure the signal of microbial interactions.</a> The ISME Journal. 13 (11), 2639-2646 (2019).</li><li>Stephenson, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+heterogeneity+affects+both+parasite+transmission+to+and+fitness+on+subsequent+hosts.">Host heterogeneity affects both parasite transmission to and fitness on subsequent hosts.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 372 (1719), 20160093 (2017).</li><li>VanderWaal, K. L., Ezenwa, V. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+in+pathogen+transmission:+mechanisms+and+methodology.">Heterogeneity in pathogen transmission: mechanisms and methodology.</a> Functional Ecology. 30 (10), 1606-1622 (2016).</li><li>Dwyer, G., Elkinton, J. S., Buonaccorsi, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+heterogeneity+in+susceptibility+and+disease+dynamics:+tests+of+a+mathematical+model.">Host heterogeneity in susceptibility and disease dynamics: tests of a mathematical model.</a> The American Naturalist. 150 (6), 685-707 (1997).</li><li>Wu, D., Rea, S. L., Yashin, A. I., Johnson, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+hidden+heterogeneity+in+isogenic+populations+of+C.+elegans.">Visualizing hidden heterogeneity in isogenic populations of C. elegans.</a> Experimental Gerontology. 41 (3), 261-270 (2006).</li><li>Yashin, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heat+shock+changes+the+heterogeneity+distribution+in+populations+of+Caenorhabditis+elegans+does+it+tell+us+anything+about+the+biological+mechanism+of+stress+response.">Heat shock changes the heterogeneity distribution in populations of Caenorhabditis elegans does it tell us anything about the biological mechanism of stress response.</a> The Journals of Gerontology Series A: Biological Sciences and Medical Sciences. 57 (3), 83-92 (2002).</li><li>Zhao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+forms+of+death+in+ageing+Caenorhabditis+elegans.">Two forms of death in ageing Caenorhabditis elegans.</a> Nature Communications. 8 (1), 1-8 (2017).</li><li>Eckley, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+characterization+of+the+transition+to+mid-life+in+Caenorhabditis+elegans.">Molecular characterization of the transition to mid-life in Caenorhabditis elegans.</a> AGE. 35 (3), 689-703 (2012).</li><li>Rea, S. L., Wu, D., Cypser, J. R., Vaupel, J. W., Johnson, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+stress-sensitive+reporter+predicts+longevity+in+isogenic+populations+of+Caenorhabditis+elegans.">A stress-sensitive reporter predicts longevity in isogenic populations of Caenorhabditis elegans.</a> Nature Genetics. 37 (8), 894-898 (2005).</li><li>Kinser, H. E., Mosley, M. C., Plutzer, I. B., Pincus, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global,+cell+non-autonomous+gene+regulation+drives+individual+lifespan+among+isogenic+C.+elegans.">Global, cell non-autonomous gene regulation drives individual lifespan among isogenic C. elegans.</a> eLife. , (2021).</li><li>Churgin, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Longitudinal+imaging+of+Caenorhabditis+elegans+in+a+microfabricated+device+reveals+variation+in+behavioral+decline+during+aging.">Longitudinal imaging of Caenorhabditis elegans in a microfabricated device reveals variation in behavioral decline during aging.</a> eLife. 6, 26652 (2017).</li><li>Perez, M. F., Francesconi, M., Hidalgo-Carcedo, C., Lehner, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maternal+age+generates+phenotypic+variation+in+Caenorhabditis+elegans.">Maternal age generates phenotypic variation in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 552 (7683), 106-109 (2017).</li><li>Baeriswyl, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+aging+profiles+in+isogenic+populations+of+Caenorhabditis+elegans+by+bacteria+causing+different+extrinsic+mortality+rates.">Modulation of aging profiles in isogenic populations of Caenorhabditis elegans by bacteria causing different extrinsic mortality rates.</a> Biogerontology. 11 (1), 53 (2009).</li><li>Taylor, M., Vega, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+immunity+alters+community+ecology+and+stability+of+the+microbiome+in+a+Caenorhabditis+elegans+model.">Host immunity alters community ecology and stability of the microbiome in a Caenorhabditis elegans model.</a> mSystems. 6 (2), 00608-00620 (2021).</li><li>Diaz, S. A., Restif, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spread+and+transmission+of+bacterial+pathogens+in+experimental+populations+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">Spread and transmission of bacterial pathogens in experimental populations of the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Applied and Environmental Microbiology. 80 (17), 5411-5418 (2014).</li><li>Twumasi-Boateng, K., Berg, M., Shapira, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+separation+of+C.+elegans+variably+colonized+by+a+bacterial+pathogen.">Automated separation of C. elegans variably colonized by a bacterial pathogen.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (85), e51090 (2014).</li><li>Ortiz, A., Vega, N. M., Ratzke, C., Gore, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interspecies+bacterial+competition+regulates+community+assembly+in+the+C.+elegans+intestine.">Interspecies bacterial competition regulates community assembly in the C. elegans intestine.</a> The ISME Journal. 15 (7), 2131-2145 (2021).</li><li>Berg, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGF&#946;/BMP+immune+signaling+affects+abundance+and+function+of+C.+elegans+gut+commensals.">TGF&#946;/BMP immune signaling affects abundance and function of C. elegans gut commensals.</a> Nature Communications. 10 (1), 604 (2019).</li><li>Portal-Celhay, C., Blaser, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Competition+and+resilience+between+founder+and+introduced+bacteria+in+the+Caenorhabditis+elegans+gut.">Competition and resilience between founder and introduced bacteria in the Caenorhabditis elegans gut.</a> Infection and Immunity. 80 (3), 1288-1299 (2012).</li><li>Scott, E., Holden-Dye, L., O'Connor, V., Wand, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intra+strain+variation+of+the+effects+of+gram-negative+ESKAPE+pathogens+on+intestinal+colonization,+host+viability,+and+host+response+in+the+model+organism+Caenorhabditis+elegans.">Intra strain variation of the effects of gram-negative ESKAPE pathogens on intestinal colonization, host viability, and host response in the model organism Caenorhabditis elegans.</a> Frontiers in Microbiology. 10, 3113 (2020).</li><li>Kamath, R. S., Martinez-Campos, M., Zipperlen, P., Fraser, A. G., Ahringer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effectiveness+of+specific+RNA-mediated+interference+through+ingested+double-stranded+RNA+in+Caenorhabditis+elegans.">Effectiveness of specific RNA-mediated interference through ingested double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.</a> Genome Biology. 2 (1), (2001).</li><li>Dirksen, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+native+microbiome+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans:+gateway+to+a+new+host-microbiome+model.">The native microbiome of the nematode Caenorhabditis elegans: gateway to a new host-microbiome model.</a> BMC Biology. 14, 38 (2016).</li><li>Vega, N. M., Allison, K. R., Samuels, A. N., Klempner, M. S., Collins, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salmonella+typhimurium+intercepts+Escherichia+coli+signaling+to+enhance+antibiotic+tolerance.">Salmonella typhimurium intercepts Escherichia coli signaling to enhance antibiotic tolerance.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (35), 14420-14425 (2013).</li><li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+C.+elegans.">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook. , (2006).</li><li>Tabara, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+rde-1+gene,+RNA+interference,+and+transposon+silencing+in+C.+elegans.">The rde-1 gene, RNA interference, and transposon silencing in C. elegans.</a> Cell. 99 (2), 123-132 (1999).</li><li>Ahringer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reverse+genetics.">Reverse genetics.</a> WormBook. , (2006).</li><li>Rual, J. -. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+improving+Caenorhabditis+elegans+phenome+mapping+with+an+ORFeome-based+RNAi+library.">Toward improving Caenorhabditis elegans phenome mapping with an ORFeome-based RNAi library.</a> Genome Research. 14 (10), 2162-2168 (2004).</li><li>Revtovich, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+characterization+of+high-throughput+Caenorhabditis+elegans+-+Enterococcus+faecium+infection+model.">Development and characterization of high-throughput Caenorhabditis elegans - Enterococcus faecium infection model.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 11, 667327 (2021).</li><li>Anderson, Q. L., Revtovich, A. V., Kirienko, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput,+high-content,+liquid-based+C.+elegans+pathosystem.">A high-throughput, high-content, liquid-based C. elegans pathosystem.</a> JoVE (Journal of Visualized Experiments. (137), e58068 (2018).</li><li>Scholz, M., Dinner, A. R., Levine, E., Biron, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stochastic+feeding+dynamics+arise+from+the+need+for+information+and+energy.">Stochastic feeding dynamics arise from the need for information and energy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (35), 9261-9266 (2017).</li><li>Wu, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pheromones+modulate+learning+by+regulating+the+balanced+signals+of+two+insulin-like+peptides.">Pheromones modulate learning by regulating the balanced signals of two insulin-like peptides.</a> Neuron. 104 (6), 1095-1109 (2019).</li><li>Ching, T. -. T., Hsu, A. -. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solid+plate-based+dietary+restriction+in+Caenorhabditis+elegans.">Solid plate-based dietary restriction in Caenorhabditis elegans.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (51), e2701 (2011).</li><li>Walker, A. C., Bhargava, R., Vaziriyan-Sani, A. S., Brust, A. S., Czyz, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+bacterial+loads+in+Caenorhabditis+elegans.">Quantification of bacterial loads in Caenorhabditis elegans.</a> Bio-protocol. 12 (2), 4291-4291 (2022).</li><li>Manjarrez, J. R., Mailler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress+and+timing+associated+with+Caenorhabditis+elegans+immobilization+methods.">Stress and timing associated with Caenorhabditis elegans immobilization methods.</a> Heliyon. 6 (7), 04263 (2020).</li><li>Zhang, S., Banerjee, D., Kuhn, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+larval+cells+from+C.+elegans.">Isolation and culture of larval cells from C. elegans.</a> PLoS ONE. 6 (4), 0019505 (2011).</li><li>Garsin, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-lived+C.+elegans+daf-2+mutants+are+resistant+to+bacterial+pathogens.">Long-lived C. elegans daf-2 mutants are resistant to bacterial pathogens.</a> Science. 300 (5627), 1921 (2003).</li><li>Thutupalli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Farming+and+public+goods+production+in+Caenorhabditis+elegans+populations.">Farming and public goods production in Caenorhabditis elegans populations.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (9), 2289-2294 (2017).</li><li>Ly, K., Reid, S. J., Snell, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+RNA+analysis+of+individual+Caenorhabditis+elegans.">Rapid RNA analysis of individual Caenorhabditis elegans.</a> MethodsX. 2, 59-63 (2015).</li><li>Johnke, J., Dirksen, P., Schulenburg, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Community+assembly+of+the+native+C.+elegans+microbiome+is+influenced+by+time,+substrate,+and+individual+bacterial+taxa.">Community assembly of the native C. elegans microbiome is influenced by time, substrate, and individual bacterial taxa.</a> Environmental Microbiology. 22 (4), 1265-1279 (2020).</li><li>Vega, N. M., Gore, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stochastic+assembly+produces+heterogeneous+communities+in+the+Caenorhabditis+elegans+intestine.">Stochastic assembly produces heterogeneous communities in the Caenorhabditis elegans intestine.</a> PLOS Biology. 15 (3), 2000633 (2017).</li><li>Gulyas, L., Powell, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cold+shock+induces+a+terminal+investment+reproductive+response+in+C.+elegans.">Cold shock induces a terminal investment reproductive response in C. elegans.</a> Scientific Reports. 12 (1), 1338 (2022).</li><li>Jiang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetic+program+mediates+cold-warming+response+and+promotes+stress-induced+phenoptosis+in+C.+elegans.">A genetic program mediates cold-warming response and promotes stress-induced phenoptosis in C. elegans.</a> eLife. 7, 35037 (2018).</li><li>Robinson, J. D., Powell, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+recovery+from+acute+cold+shock+in+Caenorhabditis+elegans.">Long-term recovery from acute cold shock in Caenorhabditis elegans.</a> BMC Cell Biology. 17 (1), 2 (2016).</li></ol>

Здесь представлены данные о преимуществах количественной оценки бактериальной нагрузки у C. elegans одним червем, а также протокола разрушения 96 скважин, позволяющего быстро и последовательно получать большие наборы данных этого типа. По сравнению с существующими методами3...

Гетерогенность в ассоциациях хозяин-микроб наблюдается повсеместно, и различия между индивидуумами все чаще признаются в качестве фактора, способствующего процессам на уровне популяции от конкуренции и сосуществования1 до передачи болезни 2,3,4. У C. elegans «скрытая гетерогенность» в изогенных популяциях наблюдалась неоднократно, причем субпопуляции особей демонстрировали различные фенотипы в реакции теплового шока 5,6, старении и продолжительности жизни 7,8,9,10,11 и многих других аспектах физиологии и развития12. . Большинство анализов, которые пытаются идентифицировать субпопуляционную структуру, дают доказательства для двух субпопуляций в экспериментальных популяциях изогенных, синхронизированных червей 5,7,8, хотя другие данные предполагают возможность внутрипопуляционного распределения признаков, а не отдельных групп 7,12,13 . Здесь уместно отметить, что существенная гетерогенность в кишечных популяциях наблюдается даже в пределах изогенных популяций червей, колонизированных из общего источника микробов 13,14,15,16, и эта неоднородность может быть скрыта измерениями периодического переваривания, которые широко используются 17,18,19,20 для количественной оценки бактерий у червя.
В этой работе представлены данные, свидетельствующие о необходимости большей зависимости от измерений одного червя в ассоциации между хозяином и микробом, а также протоколов для повышения точности и пропускной способности при нарушении работы одного червя. Эти протоколы предназначены для облегчения механического разрушения большого количества отдельных C. elegans для количественной оценки жизнеспособной бактериальной нагрузки, обеспечивая при этом лучшую повторяемость и более низкое усилие на образец, чем разрушение отдельных червей на основе пестика. Рекомендуемый этап очистки кишечника, на котором червям разрешается питаться убитой теплом кишечной палочкой до подготовки к нарушению, включен для минимизации вклада недавно проглоченных и других переходных (неприлипших) бактерий. Эти протоколы включают метод холодного паралича для очистки кутикулы с низкоконцентрированной поверхностной отбеливающей обработкой; Поверхностное отбеливание может быть использовано в качестве подготовительного этапа при разрушении одиночных червей или в качестве метода подготовки живых, внешне свободных от микробов червей. Этот метод поверхностного отбеливания достаточен для удаления широкого спектра внешних микробов, а холодная обработка обеспечивает альтернативу обычному параличу на основе левамизола; в то время как левамизол будет предпочтительным для экспериментов, чувствительных к холоду, холодный паралич сводит к минимуму вклад в потоки опасных отходов и позволяет быстро возобновить нормальную деятельность. В то время как полный протокол описывает лабораторный эксперимент, в котором черви колонизируются известными бактериями, процедуры очистки червей и разрушения одного червя могут быть легко применены к червям, выделенным из диких образцов или колонизированным в экспериментах с микромиром. Протоколы, описанные здесь, производят живые бактерии, извлеченные из кишечника червя, пригодные для покрытия и количественной оценки колониеобразующих единиц (КОЕ) у отдельных червей; для анализа кишечного сообщества на основе секвенирования к этим протоколам следует добавить последующие этапы лизиса клеток и экстракции нуклеиновых кислот.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>96-well flat-bottom polypropylene plates, 300 uL</td>
			<td>Evergreen Labware</td>
			<td>290-8350-03F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate sealing mat, silicon, square wells (AxyMat)</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>AM-2ML-SQ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plates, 2 mL, square wells</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>P-2ML-SQ-C-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well polypropylene plate lids</td>
			<td>Evergreen Labware</td>
			<td>290-8020-03L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>443570050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bead mill adapter set for 96-well plates</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>119900</td>
			<td>Adapter plates for use with two 96-well plates on the TissueLyser II</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bead mill tissue homogenizer (TissueLyser II)</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>85300</td>
			<td>Mechanical homogenizer for medium to high-throughput sample disruption</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioSorter</td>
			<td>Union Biometrica</td>
			<td>By quotation</td>
			<td>Large object sorter equipped with a 250 micron focus for C. elegans</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bleach, commercial, 8.25% sodium hypochlorite</td>
			<td>Clorox</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Breathe-Easy 96-well gas permeable sealing membrane</td>
			<td>Diversified Biotech</td>
			<td>BEM-1</td>
			<td>Multiwell plate gas permeable polyurethane membranes. Thin sealing film is permeable to O2, CO2, and water vapors and is UV transparent down to 300 nm. Sterile, 100/box.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride dihydrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC423525000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>AAA11470-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citric acid monohydrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC124910010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper (II) sulfate pentahydrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC197722500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 6765 LSE Mini Microcentrifuge</td>
			<td>Corning</td>
			<td>&#160;COR-6765</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disodium EDTA</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>409971000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL 1,4 Dithiothreitol, 99+%, for mol biology, DNAse, RNAse and Protease free, ACROS Organics</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>327190010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf 1.5 mL microcentrifuge tubes, natural</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf 5424R microcentrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5406000640</td>
			<td>24-place refrigerated benchtop microcentrifuge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf 5810R centrifuge with rotor S-4-104</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22627040</td>
			<td>3L benchtop centrifuge with adaptors for 15-50 mL tubes and plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf plate bucket (x2), for Rotor S-4-104</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22638930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 100%</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP2818500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass beads, 2.7 mm</td>
			<td>Life Science Products</td>
			<td>LS-79127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass beads, acid-washed, 425-600 &#181;m</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G877-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass plating beads</td>
			<td>VWR</td>
			<td>76005-124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH7204-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iron (II) sulfate heptahydrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>423731000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimble Kontes pellet pestle motor</td>
			<td>DWK Life Sciences</td>
			<td>749540-0000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimble Kontes polypropylene pellet pestles and microtubes, 0.5 mL</td>
			<td>DWK Life Sciences</td>
			<td>749520-0590</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica DMi8 motorized inverted microscope with motorized stage</td>
			<td>Leica</td>
			<td>11889113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica LAS X Premium software</td>
			<td>Leica</td>
			<td>11640687</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate heptahydrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC124900010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manganese(II) chloride tetrahydrate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>470301-706</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PARAFILM M flexible laboratory sealing film</td>
			<td>Amcor</td>
			<td>PM996</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptone</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1420-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes, round, 10 cm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25384-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes, round, 6 cm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25384-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes, square, 10 x 10 cm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10799-140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phospho-buffered saline (1X PBS)</td>
			<td>Gold Bio</td>
			<td>P-271-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene autoclave tray, shallow</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-361-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium hydroxide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC134062500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate dibasic</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP363-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP362-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R 4.1.3/RStudio 2022.02.0 build 443</td>
			<td>R Foundation</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scoop-type laboratory spatula, metal</td>
			<td>VWR</td>
			<td>470149-438</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon carbide 36 grit</td>
			<td>MJR Tumblers</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Black extra coarse silicon carbide grit. Available in 0.5-5 lb sizes from this vendor.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP166-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH7247-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic anhydrous</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP332-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodum chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP358-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC419760010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tri-potassium citrate monohydrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC611755000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP151-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zinc sulfate heptahydrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC205982500</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using single-worm data to quantify heterogeneity in caenorhabditis elegans-bacterial interactions

Нематода Caenorhabditis elegans является модельной системой для взаимодействия хозяин-микроб и хозяин-микробиом. Многие исследования на сегодняшний день используют периодические дайджесты, а не отдельные образцы червей для количественной оценки бактериальной нагрузки в этом организме. Здесь утверждается, что большая межиндивидуальная изменчивость, наблюдаемая при бактериальной колонизации кишечника C. elegans , является информативной, и что методы периодического переваривания отбрасывают информацию, которая важна для точного сравнения между условиями. Поскольку описание вариаций, присущих этим образцам, требует большого количества особей, установлен удобный протокол плиты из 96 скважин для разрушения и покрытия колоний отдельных червей.

Отбеливающая стерилизация живых червей Поверхностно обесцвеченные черви эффективно свободны от внешних бактерий до тех пор, пока подвижность не вернется и выделение не возобновится. В условиях, используемых здесь, наблюдается быстрое вымирание бактерий в буфер?...

Watch this Scientific Journal Video about Using Single-Worm Data to Quantify Heterogeneity in Caenorhabditis elegans-Bacterial Interactions at JoVE.com

Using Single-Worm Data to Quantify Heterogeneity in Caenorhabditis elegans-Bacterial Interactions

Этот протокол описывает 96-луночное нарушение отдельных бактериально колонизированных Caenorhabditis elegans после холодного паралича и поверхностного обесцвечивания для удаления внешних бактерий. Полученная суспензия наносится на агаровые пластины, чтобы обеспечить точную, среднепроизводительную количественную количественную оценку бактериальной нагрузки у большого количества отдельных червей.

Использование данных об одном черве для количественной оценки гетерогенности в caenorhabditis elegans-бактериальных взаимодействиях

The nematode Caenorhabditis elegans is a model system for host-microbe and host-microbiome interactions. Many studies to date use batch digests rather ...

Этот протокол демонстрирует механическое разрушение морских элеганов. В формате 96 лунок, позволяющем среднюю пропускную способность количественно определять бактериальную нагрузку у отдельных червей. Этот метод увеличивает скорость и однородность механических разрушений по сравнению с методами, основанными на Паселе, что позволяет исследователям легко создавать большие наборы данных высококачественных измерений одного червя.Эта техника включает в себя множество движущихся частей, и легко потерять свое место. Убедитесь, что у вас есть все материалы, маркированные трубки, буферы и пластины, установленные перед началом. Продемонстрировать процедуру будет Меган Тейлор, специалист-исследователь из моей лаборатории.Начните с повторной приостановки образца червя в одном миллилитре M девять TX ноль один в микроцентрифужной трубке. Соберите взрослых червей путем центрифугирования и выбросьте супернатант. Использование тех же параметров центрифугирования.Промыть червей дважды одним миллилитром M9TX01 и один раз одним миллилитром червячного буфера M9, чтобы свести к минимуму внешние бактерии. Затем повторно суспендировать каждый образец в одном миллилитре S-среды плюс два x термоубитых OP50 в культуральной трубке. Инкубируйте трубки при температуре 25 градусов цельсия в течение 20-30 минут, чтобы пропустить неприлипшие бактерии из кишечника.После инкубации дважды промойте очищенных червей одним миллилитром холодного M9TX01 и выбросьте супернатант. Положите трубки на лед на 10 минут, чтобы парализовать червей. Затем добавьте один миллилитр ледяного холода M девять червячного буфера с неароматизированным отбеливателем в каждую трубку.Инкубируйте трубки на льду в течение минимум 10 минут, чтобы убить внешние бактерии. Выбросьте буфер отбеливателя и верните трубки на лед, чтобы предотвратить откачку червей. Затем добавьте по одному миллилитру холодного M9TX01 к каждой трубке и центрифуге в течение пяти секунд.В мини-центрифуге. Верните трубки в лед и удалите супернатант. Повторите этот шаг один раз.Для химической пермеабилизации кутикулы червя. Перенесите трубки, содержащие червей, в 20 микролитрах буфера в стойку трубки комнатной температуры. Затем добавьте 100 микролитров раствора SDS/DTT к каждому теплому образцу.Высиживайте трубки до восьми минут на скамейке, чтобы частично разрушить кутикулу взрослых червей. В этот момент черви погибнут и осядут на дне трубки. После инкубации осторожно выбросьте супернатант SDS/DTT.Затем добавьте по одному миллилитру M9TX01 в каждую трубку и ненадолго центрифугируйте червей. Отбросьте супернатант и повторно суспендируйте червей в одном миллилитре M девять червячного буфера с 0,1% Triton x-100. Чтобы подготовиться к механическому разрушению червей, получают стерильную двухмиллилитровую скважинную пластину глубиной 96 скважин и силиконовую пластинчатую крышку.Используйте стерильный совковый шпатель, чтобы добавить небольшое количество стерильного 36-ти сетчатого карбида силикона в каждую лунку таким образом, чтобы сетка едва закрывала дно колодца. Добавьте 180 микролитров червячного буфера M nine в каждую лунку. Пометьте колонны и ряды, а затем накройте пластину свободно силиконовой крышкой пластины.Далее переложите пермеабилизированных червей в небольшую чашку Петри с заполненной на глубину до одного сантиметра. С помощью рассекающего микроскопа пипетку вынимают отдельных червей в объемах 20 микролитров и переносят их в отдельные колодцы пластины 96 скважин, чтобы извлечь любых червей, прилипших к пипетке, аспирировать 20 микролитров M9TX01 из чистой области чашки Петри и выпустить ее обратно в чашку. После переноса всех червей накройте плиту из 96 скважин листом гибкой потолочной пленки с бумажной стороной, обращенной вниз к колодцам для образцов.Поместите силиконовый потолочный коврик слегка поверх гибкой потолочной пленки, не прижимая крышку к колодцам. Поместите пластину при четырех градусах Цельсия на 30-60 минут, чтобы предотвратить перегрев во время разрушения. После охлаждения пластины плотно прижмите силиконовый потолочный мат к колодцам, чтобы запечатать их.Затем закрепите пластины в тканевом разрушителе. Встряхните тарелки в течение одной минуты при 30 герцах. Затем поверните пластины на 180 градусов и повторите встряхивание в течение одной минуты.Плотно постучите по плитам на скамейке два или три раза, чтобы выбить песок из гибкой потолочной пленки. Центрифугу пластины устанавливают 2, 400 раз G в течение двух минут для сбора проб на дне скважин. Затем снимите силиконовую крышку и снимите потолочную пленку.Чтобы подготовить десятикратное последовательное разведение червячных дайджестов, заполните 180 микролитров одного X PBS в ряды от B до D 96-луночной пластины. Используя многолуночный пипетку, установленную на 200 микролитров, медленно перемешайте переваривание червя путем пипетирования. Перенесите максимальное количество жидкости в ряд А плиты 96 скважин, содержащей PBS.Используя многоканальную пипетку, удалите 20 микролитров из верхнего ряда и распределите в ряд B. С последующим смешиванием. Повторите этот шаг для строк B до C, а затем от строки C до D, чтобы получить 1000-кратное разбавление для бактериальной количественной оценки моноколонизированных червей. Пластина от 10 до 20 микролитров каждого разведения на твердых агаровых пластинах.Для многовидовой колонизации наносят по 100 микролитров каждого разведения на 10-сантиметровые агаровые пластины. Используя этот протокол, эффективная внешняя дезинфекция наблюдалась после поверхностного обесцвечивания холодных парализованных червей, что видно по снижению внешних бактерий в буфере. Не затрагивая кишечные ассоциированные бактерии.Ручное разрушение червей приводило к большей неоднородности. Твердосплавная крупа силикона идеально подходила для разрушения с Tri Andex или без него. В методе 96 скважин большие стеклянные бусины не подходили для техники 96 скважин.Небольшие стеклянные бусины давали стабильные результаты, но забивали трубу на кончике. Черви, колонизированные в одном пуле бактерий, показали высокие различия в кишечной нагрузке при наблюдении за отдельными бактериями и многовидовыми бактериальными сообществами. Черви, колонизированные бактериями, экспрессирующими GFP, показали гетерогенность в отдельных измерениях червей.Для этого GFP экспрессирующий бактериальный штамм сравнивают колонизацию дикого типа Bristol Len двумя червями. Для DAF два мутанта IGF показали, что мутант DAF 16 поддерживает большие популяции бактерий, в то время как DAF два устойчивы к колонизации. Эта неоднородность была характерной и последовательной для разных запусков одного и того же эксперимента.Было обнаружено, что повторная выборка данных для моделирования пакетных дайджестов изменяет распределение по сравнению с отдельными данными о червях. Пакетная экстраполированная КОЕ на червя была сосредоточена вокруг среднего арифметического отдельных данных, что привело к потере биологической изменчивости. Вместо того, чтобы приступать к перевариванию живой поверхности отбеливателя и полоскания, черви могут быть использованы для дальнейших экспериментов.Движение быстро возобновится, как только черви будут удалены с холода.

Research

JoVE Journal

Biology

Using Single-Worm Data to Quantify Heterogeneity in Caenorhabditis elegans-Bacterial Interactions

Analysis of Schwann-astrocyte Interactions Using In Vitro Assays

Analysis of Schwann-astrocyte Interactions Using In Vitro Assays

Анализ Шванн-астроцитов взаимодействий с использованием In Vitro Анализы

Schwann cells are one of the commonly used cells in repair strategies following spinal cord injuries. Schwann cells are capable of supporting axonal ...

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Покадровый Микроскопия раннего эмбриогенеза в Caenorhabditis Элеганс

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes.  The transparency of the 
embryos, the genetic ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

Using Coculture to Detect Chemically Mediated Interspecies Interactions

Использование сокультивирования обнаружить химически опосредованной межвидовых взаимодействий

In nature, bacteria rarely exist in isolation; they are instead surrounded by a diverse array of other microorganisms that alter the local environment by ...

A Screenable In Vivo Assay for Mitochondrial Modulators Using Transgenic Bioluminescent Caenorhabditis elegans

A Screenable In Vivo Assay for Mitochondrial Modulators Using Transgenic Bioluminescent Caenorhabditis elegans

Скринируемый<em&gt; В Vivo</em&gt; Анализ митохондриальных Модуляторы с использованием трансгенных БИОЛЮМИНЕСЦЕНТНЫЕ<em&gt; Caenorhabditis Элеганс</em

The multicellular model organism Caenorhabditis elegans is a small nematode of approximately 1 mm in size in adulthood that is genetically and ...

Techniques to Induce and Quantify Cellular Senescence

Методы индуцируют и Quantify Cellular Старение

In response to cellular stress or damage, proliferating cells can induce a specific program that initiates a state of long-term cell-cycle arrest, termed ...

Methods to Study Changes in Inherent Protein Aggregation with Age in Caenorhabditis elegans

Methods to Study Changes in Inherent Protein Aggregation with Age in Caenorhabditis elegans

Методы для изучения изменений в присущих агрегации белков с возрастом у нематоды Caenorhabditis elegans

In the last decades, the prevalence of neurodegenerative disorders, such as Alzheimer's disease (AD) and Parkinson's disease (PD), has grown. These ...

Nasal Potential Difference to Quantify Trans-epithelial Ion Transport in Mice

Носовые разности потенциалов для количественного определения транс эпителиальных ионный транспорт в мышей

The nasal potential difference test has been used for almost three decades to assist in the diagnosis of cystic fibrosis (CF). It has proven to be helpful ...

Using Caenorhabditis elegans to Screen for Tissue-Specific Chaperone Interactions

Using Caenorhabditis elegans to Screen for Tissue-Specific Chaperone Interactions

Использование Caenorhabditis elegans для скрининга тканеспецифических взаимодействий шаперонов

Correct folding and assembly of proteins and protein complexes are essential for cellular function. Cells employ quality control pathways that correct, ...

High-Throughput Live Imaging of Microcolonies to Measure Heterogeneity in Growth and Gene Expression

Высокая пропускная способность Live Imaging микроколоний для измерения неоднородности в росте и экспрессии генов

Precise measurements of between- and within-strain heterogeneity in microbial growth rates are essential for understanding genetic and environmental ...