Name: using single-worm data to quantify heterogeneity in caenorhabditis elegans-bacterial interactions
Uploaded: 2022-07-22T14:20:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using Single-Worm Data to Quantify Heterogeneity in Caenorhabditis elegans-Bacterial Interactions at JoVE.com

Los autores desean reconocer a H. Schulenberg y C. LaRock por su generoso intercambio de cepas bacterianas utilizadas en estos experimentos. Este trabajo fue apoyado por fondos de la Universidad de Emory y NSF (PHY2014173).

Los gusanos utilizados en estos experimentos se obtuvieron del Centro Genético Caenorhabditis , que está financiado por la Oficina de Programas de Infraestructura de Investigación de los NIH (P40 OD010440). Bristol N2 es el tipo salvaje. Los mutantes DAF-2/IGF daf-16(mu86) I (CGC CF1038) y daf-2(e1370) III (CGC CB1370) se utilizan para ilustrar las diferencias en la carga bacteriana intestinal.
HT115(DE3) E. coli que transporta el vector RNAi pos-1 </...

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	<li>Armitage, D. W., Jones, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+sample+heterogeneity+can+obscure+the+signal+of+microbial+interactions.">How sample heterogeneity can obscure the signal of microbial interactions.</a> The ISME Journal. 13 (11), 2639-2646 (2019).</li><li>Stephenson, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+heterogeneity+affects+both+parasite+transmission+to+and+fitness+on+subsequent+hosts.">Host heterogeneity affects both parasite transmission to and fitness on subsequent hosts.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 372 (1719), 20160093 (2017).</li><li>VanderWaal, K. L., Ezenwa, V. 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I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heat+shock+changes+the+heterogeneity+distribution+in+populations+of+Caenorhabditis+elegans+does+it+tell+us+anything+about+the+biological+mechanism+of+stress+response.">Heat shock changes the heterogeneity distribution in populations of Caenorhabditis elegans does it tell us anything about the biological mechanism of stress response.</a> The Journals of Gerontology Series A: Biological Sciences and Medical Sciences. 57 (3), 83-92 (2002).</li><li>Zhao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+forms+of+death+in+ageing+Caenorhabditis+elegans.">Two forms of death in ageing Caenorhabditis elegans.</a> Nature Communications. 8 (1), 1-8 (2017).</li><li>Eckley, D. 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M., Ratzke, C., Gore, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interspecies+bacterial+competition+regulates+community+assembly+in+the+C.+elegans+intestine.">Interspecies bacterial competition regulates community assembly in the C. elegans intestine.</a> The ISME Journal. 15 (7), 2131-2145 (2021).</li><li>Berg, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGF&#946;/BMP+immune+signaling+affects+abundance+and+function+of+C.+elegans+gut+commensals.">TGF&#946;/BMP immune signaling affects abundance and function of C. elegans gut commensals.</a> Nature Communications. 10 (1), 604 (2019).</li><li>Portal-Celhay, C., Blaser, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Competition+and+resilience+between+founder+and+introduced+bacteria+in+the+Caenorhabditis+elegans+gut.">Competition and resilience between founder and introduced bacteria in the Caenorhabditis elegans gut.</a> Infection and Immunity. 80 (3), 1288-1299 (2012).</li><li>Scott, E., Holden-Dye, L., O'Connor, V., Wand, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intra+strain+variation+of+the+effects+of+gram-negative+ESKAPE+pathogens+on+intestinal+colonization,+host+viability,+and+host+response+in+the+model+organism+Caenorhabditis+elegans.">Intra strain variation of the effects of gram-negative ESKAPE pathogens on intestinal colonization, host viability, and host response in the model organism Caenorhabditis elegans.</a> Frontiers in Microbiology. 10, 3113 (2020).</li><li>Kamath, R. S., Martinez-Campos, M., Zipperlen, P., Fraser, A. 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V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput,+high-content,+liquid-based+C.+elegans+pathosystem.">A high-throughput, high-content, liquid-based C. elegans pathosystem.</a> JoVE (Journal of Visualized Experiments. (137), e58068 (2018).</li><li>Scholz, M., Dinner, A. R., Levine, E., Biron, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stochastic+feeding+dynamics+arise+from+the+need+for+information+and+energy.">Stochastic feeding dynamics arise from the need for information and energy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (35), 9261-9266 (2017).</li><li>Wu, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pheromones+modulate+learning+by+regulating+the+balanced+signals+of+two+insulin-like+peptides.">Pheromones modulate learning by regulating the balanced signals of two insulin-like peptides.</a> Neuron. 104 (6), 1095-1109 (2019).</li><li>Ching, T. -. T., Hsu, A. -. 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R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cold+shock+induces+a+terminal+investment+reproductive+response+in+C.+elegans.">Cold shock induces a terminal investment reproductive response in C. elegans.</a> Scientific Reports. 12 (1), 1338 (2022).</li><li>Jiang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetic+program+mediates+cold-warming+response+and+promotes+stress-induced+phenoptosis+in+C.+elegans.">A genetic program mediates cold-warming response and promotes stress-induced phenoptosis in C. elegans.</a> eLife. 7, 35037 (2018).</li><li>Robinson, J. D., Powell, J. 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Aquí se presentan datos sobre las ventajas de la cuantificación de la carga bacteriana en C. elegans, junto con un protocolo de interrupción de 96 pocillos para permitir la adquisición rápida y consistente de grandes conjuntos de datos de este tipo. En comparación con los métodos existentes33, estos protocolos permiten una medición de mayor rendimiento de las comunidades microbianas intestinales en el gusano.
Este enfoque tiene el recubrimiento como un ...

La heterogeneidad en las asociaciones huésped-microbio se observa de manera ubicua, y la variación entre individuos se reconoce cada vez más como un factor contribuyente en los procesos a nivel poblacional desde la competencia y la coexistencia1 hasta la transmisión de enfermedades 2,3,4. En C. elegans, se ha observado repetidamente "heterogeneidad oculta" dentro de las poblaciones isogénicas, con subpoblaciones de individuos que muestran fenotipos distintos en la respuesta al choque térmico 5,6, el envejecimiento y la esperanza de vida 7,8,9,10,11, y muchos otros aspectos de la fisiología y el desarrollo 12 . La mayoría de los análisis que intentan identificar la estructura de la subpoblación proporcionan evidencia de dos subpoblaciones en poblaciones experimentales de gusanos isogénicos y sincronizados 5,7,8, aunque otros datos sugieren la posibilidad de distribuciones de rasgos dentro de la población en lugar de grupos distintos 7,12,13 . De relevancia aquí, se observa una heterogeneidad sustancial en las poblaciones intestinales incluso dentro de las poblaciones isogénicas de gusanos colonizados a partir de una fuente compartida de microbios 13,14,15,16, y esta heterogeneidad puede ocultarse mediante las mediciones de digestión por lotes que se utilizan ampliamente 17,18,19,20 para la cuantificación bacteriana en el gusano.
Este trabajo presenta datos que sugieren la necesidad de una mayor dependencia de las mediciones de un solo gusano en la asociación huésped-microbio, así como protocolos para aumentar la precisión y el rendimiento en la interrupción de un solo gusano. Estos protocolos están diseñados para facilitar la interrupción mecánica de un gran número de C. elegans individuales para la cuantificación de la carga bacteriana viable, al tiempo que proporcionan una mejor repetibilidad y un menor esfuerzo por muestra que la interrupción basada en morteros de gusanos individuales. Se incluye un paso recomendado de purga intestinal, donde se permite que los gusanos se alimenten de E. coli muerta por calor antes de la preparación para la interrupción, para minimizar las contribuciones de bacterias recientemente ingeridas y otras bacterias transitorias (no adheridas). Estos protocolos incluyen un método de parálisis en frío para limpiar la cutícula con un tratamiento de lejía superficial de baja concentración; El blanqueamiento de superficies se puede utilizar como un paso preparatorio en la interrupción de un solo gusano o como un método para preparar gusanos vivos, externamente libres de gérmenes. Este método de blanqueamiento de la superficie es suficiente para eliminar una amplia gama de microbios externos, y el tratamiento en frío proporciona una alternativa a la parálisis convencional a base de levamisol; mientras que el levamisol será preferido para experimentos sensibles al frío, la parálisis por frío minimiza las contribuciones a los flujos de desechos peligrosos y permite una rápida reanudación de la actividad normal. Si bien el protocolo completo describe un experimento de laboratorio en el que los gusanos se colonizan con bacterias conocidas, los procedimientos para limpiar los gusanos y la interrupción de un solo gusano se pueden aplicar fácilmente a gusanos aislados de muestras silvestres o colonizados en experimentos de microcosmos. Los protocolos descritos aquí producen bacterias vivas extraídas del intestino del gusano, adecuadas para el recubrimiento y la cuantificación de unidades formadoras de colonias (UFC) en gusanos individuales; para el análisis de la comunidad intestinal basado en la secuenciación, se deben agregar a estos protocolos pasos posteriores de lisis celular y extracción de ácido nucleico.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>96-well flat-bottom polypropylene plates, 300 uL</td>
			<td>Evergreen Labware</td>
			<td>290-8350-03F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate sealing mat, silicon, square wells (AxyMat)</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>AM-2ML-SQ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plates, 2 mL, square wells</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>P-2ML-SQ-C-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well polypropylene plate lids</td>
			<td>Evergreen Labware</td>
			<td>290-8020-03L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>443570050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bead mill adapter set for 96-well plates</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>119900</td>
			<td>Adapter plates for use with two 96-well plates on the TissueLyser II</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bead mill tissue homogenizer (TissueLyser II)</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>85300</td>
			<td>Mechanical homogenizer for medium to high-throughput sample disruption</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioSorter</td>
			<td>Union Biometrica</td>
			<td>By quotation</td>
			<td>Large object sorter equipped with a 250 micron focus for C. elegans</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bleach, commercial, 8.25% sodium hypochlorite</td>
			<td>Clorox</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Breathe-Easy 96-well gas permeable sealing membrane</td>
			<td>Diversified Biotech</td>
			<td>BEM-1</td>
			<td>Multiwell plate gas permeable polyurethane membranes. Thin sealing film is permeable to O2, CO2, and water vapors and is UV transparent down to 300 nm. Sterile, 100/box.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride dihydrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC423525000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>AAA11470-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citric acid monohydrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC124910010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper (II) sulfate pentahydrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC197722500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 6765 LSE Mini Microcentrifuge</td>
			<td>Corning</td>
			<td>&#160;COR-6765</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disodium EDTA</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>409971000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL 1,4 Dithiothreitol, 99+%, for mol biology, DNAse, RNAse and Protease free, ACROS Organics</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>327190010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf 1.5 mL microcentrifuge tubes, natural</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf 5424R microcentrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5406000640</td>
			<td>24-place refrigerated benchtop microcentrifuge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf 5810R centrifuge with rotor S-4-104</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22627040</td>
			<td>3L benchtop centrifuge with adaptors for 15-50 mL tubes and plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf plate bucket (x2), for Rotor S-4-104</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22638930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 100%</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP2818500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass beads, 2.7 mm</td>
			<td>Life Science Products</td>
			<td>LS-79127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass beads, acid-washed, 425-600 &#181;m</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G877-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass plating beads</td>
			<td>VWR</td>
			<td>76005-124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH7204-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iron (II) sulfate heptahydrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>423731000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimble Kontes pellet pestle motor</td>
			<td>DWK Life Sciences</td>
			<td>749540-0000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimble Kontes polypropylene pellet pestles and microtubes, 0.5 mL</td>
			<td>DWK Life Sciences</td>
			<td>749520-0590</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica DMi8 motorized inverted microscope with motorized stage</td>
			<td>Leica</td>
			<td>11889113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica LAS X Premium software</td>
			<td>Leica</td>
			<td>11640687</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate heptahydrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC124900010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manganese(II) chloride tetrahydrate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>470301-706</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PARAFILM M flexible laboratory sealing film</td>
			<td>Amcor</td>
			<td>PM996</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptone</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1420-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes, round, 10 cm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25384-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes, round, 6 cm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25384-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes, square, 10 x 10 cm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10799-140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phospho-buffered saline (1X PBS)</td>
			<td>Gold Bio</td>
			<td>P-271-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene autoclave tray, shallow</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-361-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium hydroxide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC134062500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate dibasic</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP363-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP362-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R 4.1.3/RStudio 2022.02.0 build 443</td>
			<td>R Foundation</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scoop-type laboratory spatula, metal</td>
			<td>VWR</td>
			<td>470149-438</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon carbide 36 grit</td>
			<td>MJR Tumblers</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Black extra coarse silicon carbide grit. Available in 0.5-5 lb sizes from this vendor.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP166-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH7247-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic anhydrous</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP332-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodum chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP358-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC419760010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tri-potassium citrate monohydrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC611755000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP151-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zinc sulfate heptahydrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC205982500</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using single-worm data to quantify heterogeneity in caenorhabditis elegans-bacterial interactions

El nematodo Caenorhabditis elegans es un sistema modelo para las interacciones huésped-microbioma y huésped-microbioma. Muchos estudios hasta la fecha utilizan resúmenes por lotes en lugar de muestras individuales de gusanos para cuantificar la carga bacteriana en este organismo. Aquí se argumenta que la gran variabilidad interindividual observada en la colonización bacteriana del intestino de C. elegans es informativa, y que los métodos de digestión por lotes descartan información que es importante para una comparación precisa entre las condiciones. Como la descripción de la variación inherente a estas muestras requiere un gran número de individuos, se establece un conveniente protocolo de placa de 96 pocillos para la interrupción y el recubrimiento de colonias de gusanos individuales.

Esterilización con lejía de gusanos vivos Los gusanos blanqueados superficialmente están efectivamente libres de bacterias externas hasta que la motilidad regresa y se reanuda la excreción. En las condiciones utilizadas aquí, se observa una rápida extinción de bacterias en el tampón (Figura 1A-C, Figura suplementaria 2, Video 1) sin perturbar las bacterias asociadas al intestino en gusanos paralizados por el frío (<strong class="...

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Using Single-Worm Data to Quantify Heterogeneity in Caenorhabditis elegans-Bacterial Interactions

Este protocolo describe una interrupción de 96 pocillos de Caenorhabditis elegans colonizada bacterianamente después de la parálisis por frío y el blanqueamiento de la superficie para eliminar las bacterias externas. La suspensión resultante está chapada en placas de agar para permitir una cuantificación precisa y de rendimiento medio de la carga bacteriana en un gran número de gusanos individuales.

Uso de datos de un solo gusano para cuantificar la heterogeneidad en las interacciones caenorhabditis elegans-bacterianas

The nematode Caenorhabditis elegans is a model system for host-microbe and host-microbiome interactions. Many studies to date use batch digests rather ...

Este protocolo demuestra la interrupción mecánica de los elegans marinos. En un formato de 96 pocillos que permite la cuantificación de rendimiento medio de la carga bacteriana en gusanos individuales. Esta técnica aumenta la velocidad y la uniformidad de la interrupción mecánica en comparación con los métodos basados en Pasel, lo que permite a los investigadores producir fácilmente conjuntos de datos más grandes de mediciones de gusanos individuales de alta calidad.Esta técnica involucra muchas partes móviles y es fácil perder su lugar. Asegúrese de tener todos los materiales, tubos etiquetados, tampones y placas configurados antes de comenzar. Demostrando el procedimiento estará Megan Taylor, una especialista en investigación líder de mi laboratorio.Comience por volver a suspender la muestra de gusano en un mililitro de M nueve TX cero uno en un tubo de microcentrífuga. Recoger los gusanos adultos por centrifugación y desechar el sobrenadante. Utilizando los mismos parámetros de centrifugación.Enjuague los gusanos dos veces con un mililitro de M9TX01 y una vez con un mililitro de tampón de gusano M9, para minimizar las bacterias externas. Luego, vuelva a suspender cada muestra en un mililitro de medio S más dos x calor matado OP50 en un tubo de cultivo. Incubar los tubos a 25 grados centígrados durante 20 a 30 minutos para eliminar las bacterias no adheridas del intestino.Después de la incubación, enjuague los gusanos purgados dos veces con un mililitro de M9TX01 frío y deseche el súper nadante. Coloque los tubos en hielo durante 10 minutos para paralizar los gusanos. Luego agregue un mililitro de tampón de gusanos M nueve helado con lejía sin perfume a cada tubo.Incubar los tubos en hielo durante un mínimo de 10 minutos para matar las bacterias externas. Deseche el tampón de lejía y devuelva los tubos al hielo para evitar que los gusanos bombeen. A continuación, agregue un mililitro de M9TX01 frío a cada tubo y centrifugar durante cinco segundos.En una mini centrífuga. Devuelva los tubos al hielo y retire el sobrenadante. Repita este paso una vez.Para la permeabilización química de la cutícula del gusano. Transfiera los tubos que contienen los gusanos en 20 microlitros de tampón a una rejilla de tubos a temperatura ambiente. Luego agregue 100 microlitros de solución SDS / DTT a cada muestra caliente.Incubar los tubos durante un máximo de ocho minutos en el banco para descomponer parcialmente la cutícula de los gusanos adultos. En este punto, los gusanos morirán y se asentarán en el fondo del tubo. Después de la incubación, deseche con cuidado el sobrenadante SDS/DTT.Luego, agregue un mililitro de M9TX01 a cada tubo y centrifugar brevemente para granular los gusanos. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender los gusanos en un mililitro M nueve sin tampón de gusanos con 0,1% Triton x-100. Para prepararse para la interrupción mecánica de los gusanos, obtenga una placa estéril de pozo de 96 pozos de dos mililitros de profundidad y una cubierta de placa de silicona.Use una espátula de cuchara estéril para agregar una pequeña cantidad de carburo de silicona de rejilla 36 estéril a cada pocillo de modo que la rejilla apenas cubra el fondo del pozo. Agregue 180 microlitros de amortiguador de lombriz M nueve a cada pocillo. Etiquete las columnas y filas y luego cubra la placa holgadamente con la cubierta de la placa de silicona.A continuación, transfiera los gusanos permeabilizados a una pequeña placa de Petri con M9TX01 llena hasta una profundidad de un centímetro. Usando un microscopio de disección, pipetea gusanos individuales en volúmenes de 20 microlitros y transfiérelos a pocillos individuales de la placa de 96 pocillos para expulsar cualquier gusano pegado a la pipeta, aspire 20 microlitros de M9TX01 de un área clara de la placa de Petri y suéltelo de nuevo en el plato. Una vez que se transfieran todos los gusanos, cubra la placa de 96 pocillos con una lámina de película de techo flexible con el lado del papel hacia abajo sobre los pocillos de muestra.Coloque la alfombra de techo de silicona ligeramente encima de la película de techo flexible sin presionar la cubierta hacia abajo en los pozos. Coloque la placa a cuatro grados centígrados durante 30 a 60 minutos para evitar el sobrecalentamiento durante la interrupción. Después de enfriar la placa, presione la estera de silicona del techo firmemente en los pozos para sellarlos.Luego asegure las placas en el disruptor tisular. Agite los platos durante un minuto a 30 hercios. Luego gire las placas 180 grados y repita agitar durante un minuto.Golpee las placas firmemente en el banco dos o tres veces para desalojar cualquier grano de la película flexible del techo. Centrifugar el conjunto de placas 2, 400 veces G durante dos minutos para recoger las muestras en el fondo de los pozos. Luego retire la tapa de silicona y retire la película del techo.Para preparar una dilución en serie diez veces mayor de los digeridos de gusanos, llene 180 microlitros de un PBS X en las filas B a D de una placa de 96 pocillos. Usando un pipeter de varios pocillos ajustado a 200 microlitros, mezcle lentamente la digestión del gusano con pipeteo. Transfiera la cantidad máxima del líquido a la fila A de la placa de 96 pocillos que contiene PBS.Con una pipeta multicanal, retire 20 microlitros de la fila superior y dispense en la fila B.Seguido de la mezcla. Repita este paso para la fila B a C y luego la fila C a D para obtener una dilución de 1000 veces para la cuantificación bacteriana de gusanos monocolonizados. Placa de 10 a 20 microlitros de cada dilución en placas de agar sólido.Para la colonización multiespecie, placa 100 microlitros de cada dilución en placas de agar de 10 centímetros. Usando este protocolo, se observó una desinfección externa efectiva después del blanqueamiento superficial de gusanos paralizados por frío, como se ve por la disminución de bacterias externas en el amortiguador. Sin afectar a las bacterias asociadas al intestino.La interrupción manual de los gusanos dio lugar a una mayor heterogeneidad. La arena de carburo de silicona era ideal para la disrupción con o sin Tri Andex. En el método de 96 pozos, las cuentas de vidrio grandes no eran adecuadas para la técnica de 96 pozos.Las pequeñas perlas de vidrio produjeron resultados consistentes pero obstruyeron la tubería en la punta. Los gusanos colonizados en el mismo grupo de bacterias mostraron una alta variación en la carga intestinal cuando se observaron para bacterias individuales y comunidades bacterianas de múltiples especies. Los gusanos colonizados con bacterias que expresan GFP, mostraron heterogeneidad en las mediciones individuales de gusanos.Para esta cepa bacteriana GFP que expresa la colonización de Bristol Len de tipo salvaje con dos gusanos. Para DAF, dos mutantes de IGF mostraron que el mutante DAF 16 admite poblaciones más grandes de bacterias, mientras que DAF dos es resistente a la colonización. Esta heterogeneidad fue característica y consistente en diferentes ejecuciones del mismo experimento.Se encontró que el remuestreo de datos para simular resúmenes por lotes alteraba la distribución en comparación con los datos de gusanos individuales. El lote extrapolado de UFC por gusano se centró en la media aritmética de los datos individuales que conducen a la pérdida de variación biológica. En lugar de proceder a digerir lejía de superficie viva y enjuagar, los gusanos se pueden usar para experimentos adicionales.El movimiento se reanudará rápidamente una vez que los gusanos se eliminen del frío.

Research

JoVE Journal

Biology

Using Single-Worm Data to Quantify Heterogeneity in Caenorhabditis elegans-Bacterial Interactions

Analysis of Schwann-astrocyte Interactions Using In Vitro Assays

Analysis of Schwann-astrocyte Interactions Using In Vitro Assays

El análisis de Schwann-astrocito interacciones utilizando In Vitro Ensayos

Schwann cells are one of the commonly used cells in repair strategies following spinal cord injuries. Schwann cells are capable of supporting axonal ...

Investigación

Biología

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Time-lapse microscopía de embriogénesis temprana en Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes.  The transparency of the 
embryos, the genetic ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

Using Coculture to Detect Chemically Mediated Interspecies Interactions

Usando Coculture detectar químicamente mediadas por interacciones interespecíficas

In nature, bacteria rarely exist in isolation; they are instead surrounded by a diverse array of other microorganisms that alter the local environment by ...

A Screenable In Vivo Assay for Mitochondrial Modulators Using Transgenic Bioluminescent Caenorhabditis elegans

A Screenable In Vivo Assay for Mitochondrial Modulators Using Transgenic Bioluminescent Caenorhabditis elegans

Un rastreable<em&gt; En Vivo</em&gt; Ensayo para mitocondrial Moduladores Usando transgénico bioluminiscente<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

The multicellular model organism Caenorhabditis elegans is a small nematode of approximately 1 mm in size in adulthood that is genetically and ...

Techniques to Induce and Quantify Cellular Senescence

Técnicas para inducir la senescencia celular y cuantificar

In response to cellular stress or damage, proliferating cells can induce a specific program that initiates a state of long-term cell-cycle arrest, termed ...

Methods to Study Changes in Inherent Protein Aggregation with Age in Caenorhabditis elegans

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In the last decades, the prevalence of neurodegenerative disorders, such as Alzheimer's disease (AD) and Parkinson's disease (PD), has grown. These ...

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The nasal potential difference test has been used for almost three decades to assist in the diagnosis of cystic fibrosis (CF). It has proven to be helpful ...

Using Caenorhabditis elegans to Screen for Tissue-Specific Chaperone Interactions

Using Caenorhabditis elegans to Screen for Tissue-Specific Chaperone Interactions

Uso de Caenorhabditis elegans para detectar interacciones de chaperonas específicas del tejido

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