Name: intestinal epithelial regeneration in response to ionizing irradiation
Uploaded: 2022-07-27T14:05:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Intestinal Epithelial Regeneration in Response to Ionizing Irradiation at JoVE.com

يرغب المؤلفون في الاعتراف بمركز أبحاث الأنسجة في مركز ستوني بروك للسرطان للحصول على مساعدة الخبراء في إعداد عينات الأنسجة وقسم الموارد الحيوانية المختبرية في جامعة ستوني بروك للمساعدة في رعاية الحيوانات والتعامل معها. تم دعم هذا العمل بمنح من المعاهد الوطنية للصحة DK124342 الممنوحة ل Agnieszka B. Bialkowska و DK052230 للدكتور فنسنت دبليو يانغ.

تم إيواء جميع الفئران في قسم الموارد الحيوانية المختبرية (DLAR) في جامعة ستوني بروك. وافقت اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام الحيوان بجامعة ستوني بروك (IACUC) على جميع الدراسات والإجراءات التي تنطوي على مواضيع حيوانية. أجريت التجارب التي شملت مواضيع حيوانية بدقة وفقا لبروتوكول التعامل مع الحيو?...

يصف هذا البروتوكول نموذجا قويا وقابلا للتكرار للإصابة الإشعاعية. يسمح بالتحليل الدقيق للتغيرات في ظهارة الأمعاء على مدار 7 أيام بعد الإصابة. الأهم من ذلك ، أن النقاط الزمنية المختارة تعكس المراحل الحاسمة من الإصابة وتتميز بتغيرات مميزة في الأمعاء (الإصابة ، موت الخلايا المبرمج ، التجديد ?...

ستغطي ظهارة الأمعاء البشرية سطح نصف ملعب كرة الريشة تقريبا إذا تم وضعها بشكل مسطح تماما1. بدلا من ذلك ، يتم ضغط طبقة الخلية المفردة هذه التي تفصل البشر عن محتويات أمعائهم في سلسلة من الإسقاطات الشبيهة بالأصابع ، والزغابات ، والمسافات البادئة ، وهي خبايا تزيد من مساحة سطح الأمعاء. تتمايز خلايا الظهارة على طول محور الزغابات المشفرة. تتكون الزغابات بشكل أساسي من الخلايا المعوية الممتصة للمغذيات ، والخلايا الكأسية المفرزة للمخاط ، وخلايا الغدد الصماء المعوية المنتجة للهرمونات ، بينما تتكون الخبايا بشكل أساسي من خلايا بانيث المنتجة للدفاع ، والخلايا الجذعية النشطة والاحتياطية ، والخلايا السلفية2،3،4،5. علاوة على ذلك ، فإن الاتصال ثنائي الاتجاه الذي تمتلكه هذه الخلايا مع الخلايا اللحمية والخلايا المناعية للمقصورة الوسيطة الأساسية والميكروبات في التجويف يولد شبكة معقدة من التفاعلات التي تحافظ على توازن الأمعاء وهي ضرورية للتعافي بعد الإصابة6،7،8.
ظهارة الأمعاء هي أسرع الأنسجة ذاتية التجدد في جسم الإنسان ، بمعدل دوران 2-6 أيام9،10،11. أثناء الاتزان الداخلي ، تنقسم الخلايا الجذعية النشطة في قاعدة الخبايا المعوية (الخلايا العمودية ذات القاعدة القبية) ، والتي تتميز بالتعبير عن مستقبلات البروتين G المقترنة 5 (LGR5) الغنية بالليوسين المحتوية على التكرار ، بسرعة وتوفر الخلايا السلفية التي تتمايز إلى جميع السلالات الظهارية المعوية الأخرى. ومع ذلك ، نظرا لارتفاع معدل الانقسام ، فإن الخلايا الجذعية النشطة وأسلافها المباشرين حساسون بشكل خاص لإصابة أشعة جاما ويخضعون لموت الخلايا المبرمج بعد التشعيع5،12،13،14. عند فقدانها ، تخضع الخلايا الجذعية الاحتياطية والخلايا غير الجذعية (السكان الفرعي للأسلاف وبعض الخلايا المتمايزة نهائيا) داخل الخبايا المعوية للتنشيط وتجديد حجرة القبو القاعدية ، والتي يمكنها بعد ذلك إعادة تكوين مجموعات خلايا الزغابات ، وبالتالي تجديد ظهارة الأمعاء15. باستخدام تقنيات تتبع النسب ، أثبتت مجموعات بحثية متعددة أن الخلايا الجذعية الاحتياطية (الهادئة) قادرة على دعم التجدد عند فقدان الخلايا الجذعية النشطة13،16،17،18،19،20،21،22. تتميز هذه الخلايا بوجود جين البروتين المركب متعدد المشبك 1 (Bmi1) ، وجين النسخ العكسي تيلوميراز الفأر (mTert) ، و Hop homeobox (Hopx) ، وجين البروتين المتكرر الغني بالليوسين 1 (Lrig1). بالإضافة إلى ذلك ، فقد ثبت أن الخلايا غير الجذعية قادرة على تجديد الخبايا المعوية عند الإصابة 23،24،25،26،27،28،29،30،31. على وجه الخصوص ، فقد ثبت أن أسلاف الخلايا الإفرازية والخلايا المعوية تخضع لفك التمايز عند الإصابة ، والعودة إلى الخلايا الشبيهة بالجذعية ، ودعم تجديد ظهارة الأمعاء. حددت الدراسات الحديثة الخلايا التي تعبر عن علامات متعددة تمتلك القدرة على اكتساب خصائص تشبه الساق عند الإصابة (مثل DLL + و ATOH1 + و PROX1 + و MIST1 + و DCLK1 +) 32،33،34،35،36. والمثير للدهشة أن Yu et al. أظهر أنه حتى خلايا Paneth الناضجة (LYZ +) يمكن أن تساهم في تجديد الأمعاء37. علاوة على ذلك ، بالإضافة إلى التسبب في موت الخلايا المبرمج للخلايا الظهارية المعوية وتعطيل وظيفة الحاجز الظهاري ، يؤدي التشعيع إلى dysbiosis من النباتات المعوية ، وتنشيط الخلايا المناعية وبدء استجابة مؤيدة للالتهابات ، وتفعيل الخلايا الوسيطة واللحمية38,39.
يعد إشعاع جاما أداة علاجية قيمة في علاج السرطان ، خاصة بالنسبة لأورام القولون والمستقيم40. ومع ذلك ، يؤثر التشعيع بشكل كبير على التوازن المعوي عن طريق إحداث تلف في الخلايا ، مما يؤدي إلى موت الخلايا المبرمج. يسبب التعرض للإشعاع اضطرابات متعددة تبطئ تعافي المريض وتتميز بإصابة الغشاء المخاطي والالتهاب في المرحلة الحادة والإسهال وسلس البول والنزيف وآلام البطن على المدى الطويل. يشار إلى هذه المجموعة من المظاهر باسم سمية الإشعاع المعدي المعوي. بالإضافة إلى ذلك ، قد يظهر تطور التليف عبر الفم و / أو التصلب الوعائي الناجم عن الإشعاع بعد سنوات فقط من العلاج38,41. بالتزامن مع الإصابة نفسها ، يحفز الإشعاع استجابة إصلاح في الخلايا المعوية التي تنشط مسارات الإشارات المسؤولة عن بدء التجديد وتنظيمه42. يمكن أن ينشأ مرض الأمعاء الدقيقة الناجم عن الإشعاع من العلاج الإشعاعي للحوض أو البطن المقدم إلى أعضاء أخرى (مثل عنق الرحم والبروستاتا والبنكرياس والمستقيم)41،43،44،45،46. وبالتالي ، فإن إصابة التشعيع المعوي هي مشكلة سريرية كبيرة ، ومن المرجح أن يؤدي الفهم الأفضل للفيزيولوجيا المرضية الناتجة إلى تعزيز تطوير التدخلات للتخفيف من مضاعفات الجهاز الهضمي المرتبطة بالعلاج الإشعاعي. هناك تقنيات أخرى تسمح بالتحقيق في الغرض التجديدي لظهارة الأمعاء بصرف النظر عن الإشعاع. تم تطوير نماذج الفئران المعدلة وراثيا والكيميائية لدراسة الالتهاب والتجديد بعدذلك 47. كبريتات الصوديوم ديكستران (DSS) يحفز التهاب في الأمعاء ويؤدي إلى تطوير خصائص مماثلة لتلك الخاصة بمرض التهاب الأمعاء48. يمكن أن يؤدي الجمع بين علاج DSS والمركب المؤيد للسرطان azoxymethane (AOM) إلى تطور السرطان المرتبط بالتهاب القولون48,49. الإصابة الناجمة عن نقص التروية هي طريقة أخرى تستخدم لدراسة الإمكانات التجديدية للظهارة المعوية. هذه التقنية تتطلب الخبرة والمعرفة الجراحية50. علاوة على ذلك ، تسبب التقنيات المذكورة أعلاه أنواعا مختلفة من الإصابات عن الإشعاع وقد تؤدي إلى إشراك آليات مختلفة للتجديد. بالإضافة إلى ذلك ، فإن هذه النماذج تستغرق وقتا طويلا ، في حين أن تقنية الإشعاع قصيرة إلى حد ما. في الآونة الأخيرة ، تم استخدام طرق في المختبر باستخدام enteroids والقولون المتولدة من الأمعاء والقولون في تركيبة مع إصابة الإشعاع لدراسة آليات تجديد الأمعاء51,52. ومع ذلك ، فإن هذه التقنيات لا تلخص بشكل كامل العضو الذي نمذجته53,54.
ويتضمن البروتوكول المقدم وصفا لنموذج الفئران لإصابة أشعة غاما بالاقتران مع نموذج جيني يسمح بعد معالجة عقار تاموكسيفين بتتبع السلالات الناشئة عن تجمعات الخلايا الجذعية الاحتياطية (Bmi1-CreER; Rosa26eYFP). يستخدم هذا النموذج تشعيع الجسم الكلي 12 جراي ، مما يؤدي إلى إصابة معوية كبيرة بما يكفي لتنشيط الخلايا الجذعية الاحتياطية مع السماح بالتحقيق اللاحق في القدرة على التجدد المعوي في غضون 7 أيام من الإصابة55.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mL syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309659</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16G Reusable Small Animal Feeding Needles: Straight</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20068-630</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>27G x 1/2&#34; needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>305109</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>28G x 1/2&#34; Monoject 1mL insulin syringe</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>1188128012</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-Ethynyl-2&#8242;-deoxyuridine (EdU)</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc284628A</td>
			<td>10 mg/mL in sterile DMSO:water (1:4 v/v), aliquot and store in -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Azer Scientific&#160;10% Neutral Buffered Formalin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-026-213</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B6.129X1-Gt(ROSA)26Sortm1(EYFP)Cos/J</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>Strain #:006148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B6;129-Bmi1tm1(cre/ERT)Mrc/J</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>Strain #:010531</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin Fraction V, heat shock</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>3116956001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken anti-GFP</td>
			<td>Aves</td>
			<td>GFP-1020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Click-IT plus EdU Alexa Fluor 555 imaging kit, Invitrogen</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C10638</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corn oil</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>C8267</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Decloaking Chamber</td>
			<td>Biocare Medical</td>
			<td>DC2012</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP231-100</td>
			<td>light sensitive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase-free proteinase K</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C10618H</td>
			<td>diluted 25x in DPBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-chicken AF647</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>703-605-155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>21-031-CV</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence Microscope Nikon Eclipse 90i Bright and fluoerescent light, with objectives: 10X, 20X</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount Aqueous Mounting Medium</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>F4680-25ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gamma Cell 40 Exactor</td>
			<td>Best Theratronics Ltd.</td>
			<td>-</td>
			<td>0.759 Gy min-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit AF488</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>111-545-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin Solution, Gill No. 3</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>GHS332</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HM 325 Rotary Microtome from Thermo Scientific</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>23-900-668</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33258, Pentahydrate (bis-Benzimide)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>H3569</td>
			<td>dilution 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen Peroxide Solution, ACS, 29-32%, Spectrum Chemical</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>18-603-252</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>In Situ Cell Death Detection Kit, Fluorescein (Roche)</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>11684795910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid Blocker Super PAP PEN, Mini</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>DAI-PAP-S-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lithium Carbonate (Powder/Certified ACS), Fisher Chemical</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>L119-500</td>
			<td>0.5g/1L dH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer-Lok Syringe sterile, single use, 10 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89215-218</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH1135-4LP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pharmco Products&#160;Ethyl alcohol, 200 PROOF</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC1675398</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pharmco-Aaper 281000ACSCSLT Acetic Acid ACS Grade</td>
			<td>Capitol Scientific</td>
			<td>AAP-281000ACSCSLT</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-Ki67</td>
			<td>BioCare Medical</td>
			<td>CRM325</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Richard-Allan Scientific Cytoseal XYL Mounting Medium</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-050-262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scientific Industries Incubator-Genie for baking slides at 65 degree</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-728-103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Citrate Dihydrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S279-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless Steel Dissecting Kit</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25640-002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost Plus micro slides [size: 25 x 75 x 1 mm]</td>
			<td>VWR</td>
			<td>&#160;48311-703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tamoxifen</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>T5648</td>
			<td>30 mg/mL in sterile corn oil, preferably fresh or short-sterm storage in -20&#176;C, light sensitive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek 24-Slide Holders with Detachable Handle</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4465</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek&#160;Accu-Edge&#160;Low Profile Blades</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4689</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek&#160;Manual Slide Staining Set</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4451</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek Staining Dish, Green with Lid</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4456</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek Staining Dish, White with Lid</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4457</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>P7949</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Unisette Processing Cassettes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>87002-292</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Micro Cover Glasses</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48393-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>X5P-1GAL</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

intestinal epithelial regeneration in response to ionizing irradiation

تتكون ظهارة الأمعاء من طبقة واحدة من الخلايا ولكنها تحتوي على أنواع متعددة من الخلايا المتمايزة نهائيا ، والتي يتم إنشاؤها عن طريق الانتشار النشط للخلايا الجذعية المعوية الموجودة في الجزء السفلي من الخبايا المعوية. ومع ذلك ، خلال أحداث الإصابة المعوية الحادة ، تخضع هذه الخلايا الجذعية المعوية النشطة لموت الخلايا. تشعيع جاما هو علاج لسرطان القولون والمستقيم يستخدم على نطاق واسع ، والذي ، على الرغم من فعاليته العلاجية ، له تأثير جانبي يتمثل في استنفاد تجمع الخلايا الجذعية النشط. في الواقع ، يعاني المرضى في كثير من الأحيان من متلازمة الإشعاع المعدي المعوي أثناء خضوعهم للعلاج الإشعاعي ، ويرجع ذلك جزئيا إلى نضوب الخلايا الجذعية النشطة. يؤدي فقدان الخلايا الجذعية المعوية النشطة في الخبايا المعوية إلى تنشيط مجموعة من الخلايا الجذعية المعوية الاحتياطية الهادئة عادة ويؤدي إلى إلغاء تمايز الخلايا الأولية الإفرازية والخلايا المعوية. إن لم يكن لهذه الخلايا ، فإن ظهارة الأمعاء ستفتقر إلى القدرة على التعافي من العلاج الإشعاعي وغيرها من الإهانات الأنسجة الرئيسية. تسمح التطورات الجديدة في تقنيات تتبع النسب بتتبع تنشيط الخلايا وتمايزها وهجرتها أثناء التجديد وقد تم استخدامها بنجاح لدراسة ذلك في القناة الهضمية. تهدف هذه الدراسة إلى تصوير طريقة لتحليل الخلايا داخل ظهارة الأمعاء للفأر بعد الإصابة الإشعاعية.

يسمح استخدام تشعيع الجسم الكلي 12 جراي (TBI) بالاشتراك مع تتبع النسب الوراثية للفئران بإجراء تحليل شامل لعواقب الإصابة الإشعاعية في الأمعاء. للبدء ، Bmi1-CreER ؛ تلقت فئران Rosa26eYFP حقنة واحدة من عقار تاموكسيفين ، مما يؤدي إلى تعزيز تعبير البروتين الفلوري الأصفر (EYFP) داخل مجموعة الخ?...

Watch this Scientific Journal Video about Intestinal Epithelial Regeneration in Response to Ionizing Irradiation at JoVE.com

Intestinal Epithelial Regeneration in Response to Ionizing Irradiation

الجهاز الهضمي هو واحد من أكثر الأعضاء حساسية للإصابة عند علاجات السرطان الإشعاعية. إنه في نفس الوقت نظام عضوي يتمتع بواحدة من أعلى قدرات التجدد بعد مثل هذه الإهانات. يصف البروتوكول المقدم طريقة فعالة لدراسة القدرة التجديدية للظهارة المعوية.

التجديد الظهاري المعوي استجابة للإشعاع المؤين

The intestinal epithelium consists of a single layer of cells yet contains multiple types of terminally differentiated cells, which are generated by the ...

تشعيع جاما هو علاج يستخدم على نطاق واسع لسرطان القولون والمستقيم. وعلى الرغم من أنه فعال علاجيا ، إلا أن له آثارا سلبية على الجهاز الهضمي. يصف البروتوكول المقدم طريقة فعالة لدراسة تنشيط الخلايا وتمايزها وهجرتها أثناء التجدد بعد الإصابة الإشعاعية.يصف هذا البروتوكول نموذجا قويا وقابلا للتكرار للإصابة الإشعاعية. الأهم من ذلك ، يسمح هذا النموذج بتتبع مصير الخلايا المعوية بعد الإصابة ، وبالتالي يوفر فهما أفضل للقدرة التجديدية لمجموعة فرعية معينة من الخلايا. يمكن أن تستخدم هذه التقنية نماذج حيوانية متميزة لتتبع النسب لدراسة السلوك في الوقت الفعلي وتفاعل المجموعات السكانية الفرعية المختلفة للخلايا بعد الإصابة.يجب أن تسمح التعديلات الطفيفة على هذا البروتوكول بالتحقيق في العلاقات بين الجراثيم ومجموعات الخلايا الظهارية واللحمية والخلايا المناعية المختلفة عند الإصابة الإشعاعية. للبدء ، أعد تعليق مسحوق تاموكسيفين في زيت الذرة المعقم بتركيز 30 ميكروغرام لكل ميكرولتر. Sonicate لمدة ثلاث دقائق في 30 ثانية دورات تشغيل وإيقاف بسعة 60٪.تخلط بالتناوب في الظلام لمدة ساعة في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك ، قم بإعداد EdU عن طريق إضافة DMSO المعقم إلى مسحوق EdU. أضف 1/5 من الحجم الكلي ، وأضف ببطء الحجم المتبقي من الماء المعقم عالي النقاء.عندما يذوب تماما ، القسمة وتخزينها في 20 درجة مئوية. تحضير الكواشف لجمع الأنسجة وتثبيتها ، مثل 70٪ إيثانول في الماء ، و DPBS مبرد إلى أربع درجات مئوية ، ومخزن Bouin المثبت ، و 10٪ فورمالين مخزن. بعد ذلك ، قم بإعداد المعدات اللازمة ، مثل مجموعة تشريح الفئران ، وأطباق بتري ، وإبرة تزويج قياس 16 متصلة بحقنة سعة 10 ملليلتر وأشرطة نسيجية.قبل يومين من التعرض لأشعة غاما ، قم بإعداد التجارب لحقن عقار تاموكسيفين. وزن كل ، وحساب الجرعة المطلوبة. تطهير منطقة البطن مع 70 ٪ من الإيثانول.بعد ذلك ، يتم تطبيق جرعة واحدة من عقار تاموكسيفين داخل الصفاق باستخدام إبرة قياس 27 متصلة بحقنة سعة ملليلتر واحد للحث على إعادة التركيب بوساطة Cre. راقب الحيوانات لمدة 48 ساعة القادمة لاستبعاد سمية عقار تاموكسيفين المحتملة. بعد 48 ساعة ، انقل الحيوانات إلى غرفة التشعيع.تطهير غرفة العينة في مشع جاما بمحلول الإيثانول بنسبة 70٪. ضع حصيرة الامتصاص والحيوانات داخل غرفة العينة. ضع الغطاء وأغلق الغرفة.قم ببرمجة جهاز تشعيع جاما لتعريض الحيوانات ل 12 تشعيعا رماديا إجماليا للجسم. بعد ذلك ، أدر المفتاح إلى موضع البدء ، واضغط على Start لبدء التعرض. اترك الغرفة لوقت التعرض النشط.بعد انقضاء الوقت المحدد مسبقا ، سيتوقف الجهاز تلقائيا وسيبدأ في إصدار صفير. قم بإيقاف تشغيل الجهاز عن طريق تحويل المفتاح إلى وضع الإيقاف. افتح حجرة العينة وانزع الغطاء.نقل الحيوانات إلى القفص ، وتطهير غرفة العينة مع 70 ٪ من الإيثانول. نقل الحيوانات مرة أخرى إلى غرفة السكن التقليدية ، ومراقبة حالتها بعد العلاج. مراقبة وزن الحيوانات كل يوم.قبل ثلاث ساعات من القتل الرحيم المخطط له ، قم بتطهير منطقة البطن ، وحقن الفئران داخل الصفاق ب 100 ميكرولتر من محلول مخزون EdU باستخدام حقنة أنسولين قياس 28. بعد القتل الرحيم للحيوان ، اجمع الأمعاء القريبة في نقاط زمنية مختلفة بعد التشعيع. تشريح الجزء القريب من الأمعاء الدقيقة ، وإزالة الأنسجة المرفقة.اغسل الأنسجة باستخدام DPBS البارد باستخدام إبرة تغذية مستقيمة قياس 16 متصلة بحقنة سعة 10 ملليلتر ، وقم بتثبيت المنديل باستخدام المخزن المؤقت المثبت ل Bouin. قطع الأمعاء مفتوحة طوليا ، ولف الأمعاء القريبة باستخدام تقنية Swiss-roll. ضع الأنسجة في كاسيت نسيجي في وعاء يحتوي على 10٪ من الفورمالين المخزن ، واحتضانه لمدة 24 إلى 48 ساعة في درجة حرارة الغرفة.بعد الحضانة ، انقل الكاسيتات النسيجية إلى 70٪ إيثانول ، وقم بتضمين الأنسجة في البارافين. بعد التضمين ، ضع الكاسيتات النسيجية على الجليد لمدة ساعة على الأقل. ثم ، قم بقطع مقاطع أفقية بسمك خمسة ميكرون باستخدام ميكروتوم.انقل أقسام الأنسجة إلى حمام مائي دافئ حتى 45 درجة مئوية ، وضع الأقسام على شرائح مشحونة. اترك الشرائح على رف طوال الليل في درجة حرارة الغرفة حتى تجف. أظهرت صور الهيماتوكسيلين ويوزين لعينات الأمعاء الدقيقة ظهارة معوية متجانسة عند ساعة الصفر ، تليها فقدان الخلايا داخل مقصورات القبو خلال مرحلة موت الخلايا المبرمج.تبع ذلك مرحلة التجدد التي ملأت فيها الخلايا التكاثرية للغاية الخبايا ، مما أدى إلى مرحلة التطبيع بحلول اليوم السابع. أظهر تتبع النسب بواسطة EYFP أنه أثناء التوازن ، اقتصرت الخلايا الناشئة من الخلايا الجذعية الاحتياطية الإيجابية Bmi1 على مواقع زائد أربعة إلى زائد ستة داخل الخبايا. أظهر تلطيخ EdU و Ki-67 توازنا معويا طبيعيا في الفئران المشععة الوهمية ، ويمتد من الخلايا الجذعية النشطة عبر منطقة تضخيم العبور.خلال مرحلة موت الخلايا المبرمج ، انخفض عدد الخلايا الإيجابية ل EYFP ، مصحوبا بفقدان الخلايا التكاثرية الناجمة عن التلف الإشعاعي. في مرحلة التجدد ، لوحظ تنشيط الخلايا الجذعية الاحتياطية والانتشار السريع للخلايا الإيجابية Bmi1. مزيد من الانتشار والهجرة استعادة سلامة ظهارة الأمعاء.أظهر تلطيخ TUNEL أن الخلايا المبرمج غائبة أثناء التوازن. لوحظت زيادة في تلطيخ TUNEL في وقت متأخر من مرحلة موت الخلايا المبرمج. خلال مرحلة التجدد ، انخفض تلطيخ TUNEL بشكل مطرد داخل الخبايا المتجددة وكان غائبا تقريبا عندما تم تطبيع الخبايا.يمكن دمج هذه التقنية مع تسلسل الحمض النووي الريبي ، أو تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية ، أو فرز الخلايا المنشط بالتألق ، أو التحليل البروتيني لاستخلاص المزيد من المعرفة المتعمقة حول دور سلالات خلايا معينة أثناء تجديد الأمعاء بعد الإصابة. يمكن للباحثين التحقيق في التفاعلات بين الجراثيم ومجموعات الخلايا الظهارية واللحمية والمناعية في تجديد الأمعاء لتوسيع فهم القدرة التجديدية لظهارة الأمعاء.

Research

JoVE Journal

Biology

Cortical Neurogenesis: Transitioning from Advances in the Laboratory to Cell-Based Therapies

قشري الخلايا العصبية : الانتقال من التقدم في مختبر لخلية القاعدة العلاجات

Quantification of &gamma;H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

Quantification of ÃƒÅ½Ã‚Â³H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

الكمي بؤر γH2AX في الاستجابة للإشعاع المؤين

DNA double-strand breaks (DSBs), which are induced by either endogenous metabolic processes or by exogenous sources, are one of the most critical DNA ...

Evaluation of the Spatial Distribution of &gamma;H2AX following Ionizing Radiation

Evaluation of the Spatial Distribution of ÃƒÅ½Ã‚Â³H2AX following Ionizing Radiation

تقييم التوزيع المكاني للγH2AX التالية الإشعاعات المؤينة

An early molecular response to DNA double-strand breaks (DSBs) is phosphorylation of the Ser-139 residue within the terminal SQEY motif of the histone ...

A System for Culturing Iris Pigment Epithelial Cells to Study Lens Regeneration in Newt

نظام لخلايا الظهارية التثقيف صبغات قزحية عدسة لدراسة التجديد في نيوت

Salamanders like newt and axolotl possess the ability to regenerate many of its lost body parts such as limbs, the tail with spinal cord, eye, brain, ...

Laser Ablation of the Zebrafish Pronephros to Study Renal Epithelial Regeneration

تذرية الليزر للاسماك الزرد سليفة الكلوة لدراسة التجديد طلائي الكلوي

Acute kidney injury (AKI) is characterized by high mortality rates from deterioration of renal function over a period of hours or days that culminates in ...

Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP)

Chromatin Isolation by RNA Purification ChIRP

لونين عزل من قبل تنقية الحمض النووي الريبي (السقسقة)

Long noncoding RNAs are key regulators of chromatin states for important biological processes such as dosage compensation, imprinting, and developmental ...

Rapid Genetic Analysis of Epithelial-Mesenchymal Signaling During Hair Regeneration

تحليل سريع لالوراثية طلائي-الوسيطة اشارة خلال تجديد الشعر

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an ...

Measuring Glutathione-induced Feeding Response in Hydra

قياس الاستجابة التغذية الناجم عن الجلوتاثيون في حيدرة

Hydra is among the most primitive organisms possessing a nervous system and chemosensation for detecting reduced glutathione (GSH) for capturing the prey. ...