Name: intestinal epithelial regeneration in response to ionizing irradiation
Uploaded: 2022-07-27T14:05:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Intestinal Epithelial Regeneration in Response to Ionizing Irradiation at JoVE.com

يرغب المؤلفون في الاعتراف بمركز أبحاث الأنسجة في مركز ستوني بروك للسرطان للحصول على مساعدة الخبراء في إعداد عينات الأنسجة وقسم الموارد الحيوانية المختبرية في جامعة ستوني بروك للمساعدة في رعاية الحيوانات والتعامل معها. تم دعم هذا العمل بمنح من المعاهد الوطنية للصحة DK124342 الممنوحة ل Agnieszka B. Bialkowska و DK052230 للدكتور فنسنت دبليو يانغ.

تم إيواء جميع الفئران في قسم الموارد الحيوانية المختبرية (DLAR) في جامعة ستوني بروك. وافقت اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام الحيوان بجامعة ستوني بروك (IACUC) على جميع الدراسات والإجراءات التي تنطوي على مواضيع حيوانية. أجريت التجارب التي شملت مواضيع حيوانية بدقة وفقا لبروتوكول التعامل مع الحيو?...

يصف هذا البروتوكول نموذجا قويا وقابلا للتكرار للإصابة الإشعاعية. يسمح بالتحليل الدقيق للتغيرات في ظهارة الأمعاء على مدار 7 أيام بعد الإصابة. الأهم من ذلك ، أن النقاط الزمنية المختارة تعكس المراحل الحاسمة من الإصابة وتتميز بتغيرات مميزة في الأمعاء (الإصابة ، موت الخلايا المبرمج ، التجديد ?...

ستغطي ظهارة الأمعاء البشرية سطح نصف ملعب كرة الريشة تقريبا إذا تم وضعها بشكل مسطح تماما1. بدلا من ذلك ، يتم ضغط طبقة الخلية المفردة هذه التي تفصل البشر عن محتويات أمعائهم في سلسلة من الإسقاطات الشبيهة بالأصابع ، والزغابات ، والمسافات البادئة ، وهي خبايا تزيد من مساحة سطح الأمعاء. تتمايز خلايا الظهارة على طول محور الزغابات المشفرة. تتكون الزغابات بشكل أساسي من الخلايا المعوية الممتصة للمغذيات ، والخلايا الكأسية المفرزة للمخاط ، وخلايا الغدد الصماء المعوية المنتجة للهرمونات ، بينما تتكون الخبايا بشكل أساسي من خلايا بانيث المنتجة للدفاع ، والخلايا الجذعية النشطة والاحتياطية ، والخلايا السلفية2،3،4،5. علاوة على ذلك ، فإن الاتصال ثنائي الاتجاه الذي تمتلكه هذه الخلايا مع الخلايا اللحمية والخلايا المناعية للمقصورة الوسيطة الأساسية والميكروبات في التجويف يولد شبكة معقدة من التفاعلات التي تحافظ على توازن الأمعاء وهي ضرورية للتعافي بعد الإصابة6،7،8.
ظهارة الأمعاء هي أسرع الأنسجة ذاتية التجدد في جسم الإنسان ، بمعدل دوران 2-6 أيام9،10،11. أثناء الاتزان الداخلي ، تنقسم الخلايا الجذعية النشطة في قاعدة الخبايا المعوية (الخلايا العمودية ذات القاعدة القبية) ، والتي تتميز بالتعبير عن مستقبلات البروتين G المقترنة 5 (LGR5) الغنية بالليوسين المحتوية على التكرار ، بسرعة وتوفر الخلايا السلفية التي تتمايز إلى جميع السلالات الظهارية المعوية الأخرى. ومع ذلك ، نظرا لارتفاع معدل الانقسام ، فإن الخلايا الجذعية النشطة وأسلافها المباشرين حساسون بشكل خاص لإصابة أشعة جاما ويخضعون لموت الخلايا المبرمج بعد التشعيع5،12،13،14. عند فقدانها ، تخضع الخلايا الجذعية الاحتياطية والخلايا غير الجذعية (السكان الفرعي للأسلاف وبعض الخلايا المتمايزة نهائيا) داخل الخبايا المعوية للتنشيط وتجديد حجرة القبو القاعدية ، والتي يمكنها بعد ذلك إعادة تكوين مجموعات خلايا الزغابات ، وبالتالي تجديد ظهارة الأمعاء15. باستخدام تقنيات تتبع النسب ، أثبتت مجموعات بحثية متعددة أن الخلايا الجذعية الاحتياطية (الهادئة) قادرة على دعم التجدد عند فقدان الخلايا الجذعية النشطة13،16،17،18،19،20،21،22. تتميز هذه الخلايا بوجود جين البروتين المركب متعدد المشبك 1 (Bmi1) ، وجين النسخ العكسي تيلوميراز الفأر (mTert) ، و Hop homeobox (Hopx) ، وجين البروتين المتكرر الغني بالليوسين 1 (Lrig1). بالإضافة إلى ذلك ، فقد ثبت أن الخلايا غير الجذعية قادرة على تجديد الخبايا المعوية عند الإصابة 23،24،25،26،27،28،29،30،31. على وجه الخصوص ، فقد ثبت أن أسلاف الخلايا الإفرازية والخلايا المعوية تخضع لفك التمايز عند الإصابة ، والعودة إلى الخلايا الشبيهة بالجذعية ، ودعم تجديد ظهارة الأمعاء. حددت الدراسات الحديثة الخلايا التي تعبر عن علامات متعددة تمتلك القدرة على اكتساب خصائص تشبه الساق عند الإصابة (مثل DLL + و ATOH1 + و PROX1 + و MIST1 + و DCLK1 +) 32،33،34،35،36. والمثير للدهشة أن Yu et al. أظهر أنه حتى خلايا Paneth الناضجة (LYZ +) يمكن أن تساهم في تجديد الأمعاء37. علاوة على ذلك ، بالإضافة إلى التسبب في موت الخلايا المبرمج للخلايا الظهارية المعوية وتعطيل وظيفة الحاجز الظهاري ، يؤدي التشعيع إلى dysbiosis من النباتات المعوية ، وتنشيط الخلايا المناعية وبدء استجابة مؤيدة للالتهابات ، وتفعيل الخلايا الوسيطة واللحمية38,39.
يعد إشعاع جاما أداة علاجية قيمة في علاج السرطان ، خاصة بالنسبة لأورام القولون والمستقيم40. ومع ذلك ، يؤثر التشعيع بشكل كبير على التوازن المعوي عن طريق إحداث تلف في الخلايا ، مما يؤدي إلى موت الخلايا المبرمج. يسبب التعرض للإشعاع اضطرابات متعددة تبطئ تعافي المريض وتتميز بإصابة الغشاء المخاطي والالتهاب في المرحلة الحادة والإسهال وسلس البول والنزيف وآلام البطن على المدى الطويل. يشار إلى هذه المجموعة من المظاهر باسم سمية الإشعاع المعدي المعوي. بالإضافة إلى ذلك ، قد يظهر تطور التليف عبر الفم و / أو التصلب الوعائي الناجم عن الإشعاع بعد سنوات فقط من العلاج38,41. بالتزامن مع الإصابة نفسها ، يحفز الإشعاع استجابة إصلاح في الخلايا المعوية التي تنشط مسارات الإشارات المسؤولة عن بدء التجديد وتنظيمه42. يمكن أن ينشأ مرض الأمعاء الدقيقة الناجم عن الإشعاع من العلاج الإشعاعي للحوض أو البطن المقدم إلى أعضاء أخرى (مثل عنق الرحم والبروستاتا والبنكرياس والمستقيم)41،43،44،45،46. وبالتالي ، فإن إصابة التشعيع المعوي هي مشكلة سريرية كبيرة ، ومن المرجح أن يؤدي الفهم الأفضل للفيزيولوجيا المرضية الناتجة إلى تعزيز تطوير التدخلات للتخفيف من مضاعفات الجهاز الهضمي المرتبطة بالعلاج الإشعاعي. هناك تقنيات أخرى تسمح بالتحقيق في الغرض التجديدي لظهارة الأمعاء بصرف النظر عن الإشعاع. تم تطوير نماذج الفئران المعدلة وراثيا والكيميائية لدراسة الالتهاب والتجديد بعدذلك 47. كبريتات الصوديوم ديكستران (DSS) يحفز التهاب في الأمعاء ويؤدي إلى تطوير خصائص مماثلة لتلك الخاصة بمرض التهاب الأمعاء48. يمكن أن يؤدي الجمع بين علاج DSS والمركب المؤيد للسرطان azoxymethane (AOM) إلى تطور السرطان المرتبط بالتهاب القولون48,49. الإصابة الناجمة عن نقص التروية هي طريقة أخرى تستخدم لدراسة الإمكانات التجديدية للظهارة المعوية. هذه التقنية تتطلب الخبرة والمعرفة الجراحية50. علاوة على ذلك ، تسبب التقنيات المذكورة أعلاه أنواعا مختلفة من الإصابات عن الإشعاع وقد تؤدي إلى إشراك آليات مختلفة للتجديد. بالإضافة إلى ذلك ، فإن هذه النماذج تستغرق وقتا طويلا ، في حين أن تقنية الإشعاع قصيرة إلى حد ما. في الآونة الأخيرة ، تم استخدام طرق في المختبر باستخدام enteroids والقولون المتولدة من الأمعاء والقولون في تركيبة مع إصابة الإشعاع لدراسة آليات تجديد الأمعاء51,52. ومع ذلك ، فإن هذه التقنيات لا تلخص بشكل كامل العضو الذي نمذجته53,54.
ويتضمن البروتوكول المقدم وصفا لنموذج الفئران لإصابة أشعة غاما بالاقتران مع نموذج جيني يسمح بعد معالجة عقار تاموكسيفين بتتبع السلالات الناشئة عن تجمعات الخلايا الجذعية الاحتياطية (Bmi1-CreER; Rosa26eYFP). يستخدم هذا النموذج تشعيع الجسم الكلي 12 جراي ، مما يؤدي إلى إصابة معوية كبيرة بما يكفي لتنشيط الخلايا الجذعية الاحتياطية مع السماح بالتحقيق اللاحق في القدرة على التجدد المعوي في غضون 7 أيام من الإصابة55.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mL syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309659</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16G Reusable Small Animal Feeding Needles: Straight</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20068-630</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>27G x 1/2&#34; needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>305109</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>28G x 1/2&#34; Monoject 1mL insulin syringe</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>1188128012</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-Ethynyl-2&#8242;-deoxyuridine (EdU)</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc284628A</td>
			<td>10 mg/mL in sterile DMSO:water (1:4 v/v), aliquot and store in -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Azer Scientific&#160;10% Neutral Buffered Formalin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-026-213</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B6.129X1-Gt(ROSA)26Sortm1(EYFP)Cos/J</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>Strain #:006148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B6;129-Bmi1tm1(cre/ERT)Mrc/J</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>Strain #:010531</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin Fraction V, heat shock</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>3116956001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken anti-GFP</td>
			<td>Aves</td>
			<td>GFP-1020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Click-IT plus EdU Alexa Fluor 555 imaging kit, Invitrogen</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C10638</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corn oil</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>C8267</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Decloaking Chamber</td>
			<td>Biocare Medical</td>
			<td>DC2012</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP231-100</td>
			<td>light sensitive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase-free proteinase K</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C10618H</td>
			<td>diluted 25x in DPBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-chicken AF647</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>703-605-155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>21-031-CV</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence Microscope Nikon Eclipse 90i Bright and fluoerescent light, with objectives: 10X, 20X</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount Aqueous Mounting Medium</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>F4680-25ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gamma Cell 40 Exactor</td>
			<td>Best Theratronics Ltd.</td>
			<td>-</td>
			<td>0.759 Gy min-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit AF488</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>111-545-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin Solution, Gill No. 3</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>GHS332</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HM 325 Rotary Microtome from Thermo Scientific</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>23-900-668</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33258, Pentahydrate (bis-Benzimide)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>H3569</td>
			<td>dilution 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen Peroxide Solution, ACS, 29-32%, Spectrum Chemical</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>18-603-252</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>In Situ Cell Death Detection Kit, Fluorescein (Roche)</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>11684795910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid Blocker Super PAP PEN, Mini</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>DAI-PAP-S-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lithium Carbonate (Powder/Certified ACS), Fisher Chemical</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>L119-500</td>
			<td>0.5g/1L dH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer-Lok Syringe sterile, single use, 10 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89215-218</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH1135-4LP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pharmco Products&#160;Ethyl alcohol, 200 PROOF</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC1675398</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pharmco-Aaper 281000ACSCSLT Acetic Acid ACS Grade</td>
			<td>Capitol Scientific</td>
			<td>AAP-281000ACSCSLT</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-Ki67</td>
			<td>BioCare Medical</td>
			<td>CRM325</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Richard-Allan Scientific Cytoseal XYL Mounting Medium</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-050-262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scientific Industries Incubator-Genie for baking slides at 65 degree</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-728-103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Citrate Dihydrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S279-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless Steel Dissecting Kit</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25640-002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost Plus micro slides [size: 25 x 75 x 1 mm]</td>
			<td>VWR</td>
			<td>&#160;48311-703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tamoxifen</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>T5648</td>
			<td>30 mg/mL in sterile corn oil, preferably fresh or short-sterm storage in -20&#176;C, light sensitive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek 24-Slide Holders with Detachable Handle</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4465</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek&#160;Accu-Edge&#160;Low Profile Blades</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4689</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek&#160;Manual Slide Staining Set</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4451</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek Staining Dish, Green with Lid</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4456</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek Staining Dish, White with Lid</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4457</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>P7949</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Unisette Processing Cassettes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>87002-292</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Micro Cover Glasses</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48393-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>X5P-1GAL</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

intestinal epithelial regeneration in response to ionizing irradiation

تتكون ظهارة الأمعاء من طبقة واحدة من الخلايا ولكنها تحتوي على أنواع متعددة من الخلايا المتمايزة نهائيا ، والتي يتم إنشاؤها عن طريق الانتشار النشط للخلايا الجذعية المعوية الموجودة في الجزء السفلي من الخبايا المعوية. ومع ذلك ، خلال أحداث الإصابة المعوية الحادة ، تخضع هذه الخلايا الجذعية المعوية النشطة لموت الخلايا. تشعيع جاما هو علاج لسرطان القولون والمستقيم يستخدم على نطاق واسع ، والذي ، على الرغم من فعاليته العلاجية ، له تأثير جانبي يتمثل في استنفاد تجمع الخلايا الجذعية النشط. في الواقع ، يعاني المرضى في كثير من الأحيان من متلازمة الإشعاع المعدي المعوي أثناء خضوعهم للعلاج الإشعاعي ، ويرجع ذلك جزئيا إلى نضوب الخلايا الجذعية النشطة. يؤدي فقدان الخلايا الجذعية المعوية النشطة في الخبايا المعوية إلى تنشيط مجموعة من الخلايا الجذعية المعوية الاحتياطية الهادئة عادة ويؤدي إلى إلغاء تمايز الخلايا الأولية الإفرازية والخلايا المعوية. إن لم يكن لهذه الخلايا ، فإن ظهارة الأمعاء ستفتقر إلى القدرة على التعافي من العلاج الإشعاعي وغيرها من الإهانات الأنسجة الرئيسية. تسمح التطورات الجديدة في تقنيات تتبع النسب بتتبع تنشيط الخلايا وتمايزها وهجرتها أثناء التجديد وقد تم استخدامها بنجاح لدراسة ذلك في القناة الهضمية. تهدف هذه الدراسة إلى تصوير طريقة لتحليل الخلايا داخل ظهارة الأمعاء للفأر بعد الإصابة الإشعاعية.

يسمح استخدام تشعيع الجسم الكلي 12 جراي (TBI) بالاشتراك مع تتبع النسب الوراثية للفئران بإجراء تحليل شامل لعواقب الإصابة الإشعاعية في الأمعاء. للبدء ، Bmi1-CreER ؛ تلقت فئران Rosa26eYFP حقنة واحدة من عقار تاموكسيفين ، مما يؤدي إلى تعزيز تعبير البروتين الفلوري الأصفر (EYFP) داخل مجموعة الخ?...

Watch this Scientific Journal Video about Intestinal Epithelial Regeneration in Response to Ionizing Irradiation at JoVE.com

Intestinal Epithelial Regeneration in Response to Ionizing Irradiation

الجهاز الهضمي هو واحد من أكثر الأعضاء حساسية للإصابة عند علاجات السرطان الإشعاعية. إنه في نفس الوقت نظام عضوي يتمتع بواحدة من أعلى قدرات التجدد بعد مثل هذه الإهانات. يصف البروتوكول المقدم طريقة فعالة لدراسة القدرة التجديدية للظهارة المعوية.

التجديد الظهاري المعوي استجابة للإشعاع المؤين

The intestinal epithelium consists of a single layer of cells yet contains multiple types of terminally differentiated cells, which are generated by the ...

تشعيع جاما هو علاج يستخدم على نطاق واسع لسرطان القولون والمستقيم. وعلى الرغم من أنه فعال علاجيا ، إلا أن له آثارا سلبية على الجهاز الهضمي. يصف البروتوكول المقدم طريقة فعالة لدراسة تنشيط الخلايا وتمايزها وهجرتها أثناء التجدد بعد الإصابة الإشعاعية.يصف هذا البروتوكول نموذجا قويا وقابلا للتكرار للإصابة الإشعاعية. الأهم من ذلك ، يسمح هذا النموذج بتتبع مصير الخلايا المعوية بعد الإصابة ، وبالتالي يوفر فهما أفضل للقدرة التجديدية لمجموعة فرعية معينة من الخلايا. يمكن أن تستخدم هذه التقنية نماذج حيوانية متميزة لتتبع النسب لدراسة السلوك في الوقت الفعلي وتفاعل المجموعات السكانية الفرعية المختلفة للخلايا بعد الإصابة.يجب أن تسمح التعديلات الطفيفة على هذا البروتوكول بالتحقيق في العلاقات بين الجراثيم ومجموعات الخلايا الظهارية واللحمية والخلايا المناعية المختلفة عند الإصابة الإشعاعية. للبدء ، أعد تعليق مسحوق تاموكسيفين في زيت الذرة المعقم بتركيز 30 ميكروغرام لكل ميكرولتر. Sonicate لمدة ثلاث دقائق في 30 ثانية دورات تشغيل وإيقاف بسعة 60٪.تخلط بالتناوب في الظلام لمدة ساعة في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك ، قم بإعداد EdU عن طريق إضافة DMSO المعقم إلى مسحوق EdU. أضف 1/5 من الحجم الكلي ، وأضف ببطء الحجم المتبقي من الماء المعقم عالي النقاء.عندما يذوب تماما ، القسمة وتخزينها في 20 درجة مئوية. تحضير الكواشف لجمع الأنسجة وتثبيتها ، مثل 70٪ إيثانول في الماء ، و DPBS مبرد إلى أربع درجات مئوية ، ومخزن Bouin المثبت ، و 10٪ فورمالين مخزن. بعد ذلك ، قم بإعداد المعدات اللازمة ، مثل مجموعة تشريح الفئران ، وأطباق بتري ، وإبرة تزويج قياس 16 متصلة بحقنة سعة 10 ملليلتر وأشرطة نسيجية.قبل يومين من التعرض لأشعة غاما ، قم بإعداد التجارب لحقن عقار تاموكسيفين. وزن كل ، وحساب الجرعة المطلوبة. تطهير منطقة البطن مع 70 ٪ من الإيثانول.بعد ذلك ، يتم تطبيق جرعة واحدة من عقار تاموكسيفين داخل الصفاق باستخدام إبرة قياس 27 متصلة بحقنة سعة ملليلتر واحد للحث على إعادة التركيب بوساطة Cre. راقب الحيوانات لمدة 48 ساعة القادمة لاستبعاد سمية عقار تاموكسيفين المحتملة. بعد 48 ساعة ، انقل الحيوانات إلى غرفة التشعيع.تطهير غرفة العينة في مشع جاما بمحلول الإيثانول بنسبة 70٪. ضع حصيرة الامتصاص والحيوانات داخل غرفة العينة. ضع الغطاء وأغلق الغرفة.قم ببرمجة جهاز تشعيع جاما لتعريض الحيوانات ل 12 تشعيعا رماديا إجماليا للجسم. بعد ذلك ، أدر المفتاح إلى موضع البدء ، واضغط على Start لبدء التعرض. اترك الغرفة لوقت التعرض النشط.بعد انقضاء الوقت المحدد مسبقا ، سيتوقف الجهاز تلقائيا وسيبدأ في إصدار صفير. قم بإيقاف تشغيل الجهاز عن طريق تحويل المفتاح إلى وضع الإيقاف. افتح حجرة العينة وانزع الغطاء.نقل الحيوانات إلى القفص ، وتطهير غرفة العينة مع 70 ٪ من الإيثانول. نقل الحيوانات مرة أخرى إلى غرفة السكن التقليدية ، ومراقبة حالتها بعد العلاج. مراقبة وزن الحيوانات كل يوم.قبل ثلاث ساعات من القتل الرحيم المخطط له ، قم بتطهير منطقة البطن ، وحقن الفئران داخل الصفاق ب 100 ميكرولتر من محلول مخزون EdU باستخدام حقنة أنسولين قياس 28. بعد القتل الرحيم للحيوان ، اجمع الأمعاء القريبة في نقاط زمنية مختلفة بعد التشعيع. تشريح الجزء القريب من الأمعاء الدقيقة ، وإزالة الأنسجة المرفقة.اغسل الأنسجة باستخدام DPBS البارد باستخدام إبرة تغذية مستقيمة قياس 16 متصلة بحقنة سعة 10 ملليلتر ، وقم بتثبيت المنديل باستخدام المخزن المؤقت المثبت ل Bouin. قطع الأمعاء مفتوحة طوليا ، ولف الأمعاء القريبة باستخدام تقنية Swiss-roll. ضع الأنسجة في كاسيت نسيجي في وعاء يحتوي على 10٪ من الفورمالين المخزن ، واحتضانه لمدة 24 إلى 48 ساعة في درجة حرارة الغرفة.بعد الحضانة ، انقل الكاسيتات النسيجية إلى 70٪ إيثانول ، وقم بتضمين الأنسجة في البارافين. بعد التضمين ، ضع الكاسيتات النسيجية على الجليد لمدة ساعة على الأقل. ثم ، قم بقطع مقاطع أفقية بسمك خمسة ميكرون باستخدام ميكروتوم.انقل أقسام الأنسجة إلى حمام مائي دافئ حتى 45 درجة مئوية ، وضع الأقسام على شرائح مشحونة. اترك الشرائح على رف طوال الليل في درجة حرارة الغرفة حتى تجف. أظهرت صور الهيماتوكسيلين ويوزين لعينات الأمعاء الدقيقة ظهارة معوية متجانسة عند ساعة الصفر ، تليها فقدان الخلايا داخل مقصورات القبو خلال مرحلة موت الخلايا المبرمج.تبع ذلك مرحلة التجدد التي ملأت فيها الخلايا التكاثرية للغاية الخبايا ، مما أدى إلى مرحلة التطبيع بحلول اليوم السابع. أظهر تتبع النسب بواسطة EYFP أنه أثناء التوازن ، اقتصرت الخلايا الناشئة من الخلايا الجذعية الاحتياطية الإيجابية Bmi1 على مواقع زائد أربعة إلى زائد ستة داخل الخبايا. أظهر تلطيخ EdU و Ki-67 توازنا معويا طبيعيا في الفئران المشععة الوهمية ، ويمتد من الخلايا الجذعية النشطة عبر منطقة تضخيم العبور.خلال مرحلة موت الخلايا المبرمج ، انخفض عدد الخلايا الإيجابية ل EYFP ، مصحوبا بفقدان الخلايا التكاثرية الناجمة عن التلف الإشعاعي. في مرحلة التجدد ، لوحظ تنشيط الخلايا الجذعية الاحتياطية والانتشار السريع للخلايا الإيجابية Bmi1. مزيد من الانتشار والهجرة استعادة سلامة ظهارة الأمعاء.أظهر تلطيخ TUNEL أن الخلايا المبرمج غائبة أثناء التوازن. لوحظت زيادة في تلطيخ TUNEL في وقت متأخر من مرحلة موت الخلايا المبرمج. خلال مرحلة التجدد ، انخفض تلطيخ TUNEL بشكل مطرد داخل الخبايا المتجددة وكان غائبا تقريبا عندما تم تطبيع الخبايا.يمكن دمج هذه التقنية مع تسلسل الحمض النووي الريبي ، أو تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية ، أو فرز الخلايا المنشط بالتألق ، أو التحليل البروتيني لاستخلاص المزيد من المعرفة المتعمقة حول دور سلالات خلايا معينة أثناء تجديد الأمعاء بعد الإصابة. يمكن للباحثين التحقيق في التفاعلات بين الجراثيم ومجموعات الخلايا الظهارية واللحمية والمناعية في تجديد الأمعاء لتوسيع فهم القدرة التجديدية لظهارة الأمعاء.

intestinal-epithelial-regeneration-in-response-to-ionizing-irradiation

Research

JoVE Journal

Biology

Cortical Neurogenesis: Transitioning from Advances in the Laboratory to Cell-Based Therapies

قشري الخلايا العصبية : الانتقال من التقدم في مختبر لخلية القاعدة العلاجات

Quantification of &gamma;H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

DNA double-strand breaks (DSBs), which are induced by either endogenous metabolic processes or by exogenous sources, are one of the most critical DNA lesions with respect to survival and preservation of genomic integrity. An early response to the induction of DSBs is phosphorylation of the H2A histone variant, H2AX, at the serine-139 residue, in the highly conserved C-terminal SQEY motif, forming &gamma;H2AX1. Following induction of DSBs, H2AX is rapidly phosphorylated by the phosphatidyl-inosito 3-kinase (PIKK) family of proteins, ataxia telangiectasia mutated (ATM), DNA-protein kinase catalytic subunit and ATM and RAD3-related (ATR)2. Typically, only a few base-pairs (bp) are implicated in a DSB, however, there is significant signal amplification, given the importance of chromatin modifications in DNA damage signalling and repair. Phosphorylation of H2AX mediated predominantly by ATM spreads to adjacent areas of chromatin, affecting approximately 0.03% of total cellular H2AX per DSB2,3. This corresponds to phosphorylation of approximately 2000 H2AX molecules spanning ~2 Mbp regions of chromatin surrounding the site of the DSB and results in the formation of discrete &gamma;H2AX foci which can be easily visualized and quantitated by immunofluorescence microscopy2. The loss of &gamma;H2AX at DSB reflects repair, however, there is some controversy as to what defines complete repair of DSBs; it has been proposed that rejoining of both strands of DNA is adequate however, it has also been suggested that re-instatement of the original chromatin state of compaction is necessary4-8. The disappearence of &gamma;H2AX involves at least in part, dephosphorylation by phosphatases, phosphatase 2A and phosphatase 4C5,6. Further, removal of &gamma;H2AX by redistribution involving histone exchange with H2A.Z has been implicated7,8. Importantly, the quantitative analysis of &gamma;H2AX foci has led to a wide range of applications in medical and nuclear research. Here, we demonstrate the most commonly used immunofluorescence method for evaluation of initial DNA damage by detection and quantitation of &gamma;H2AX foci in &gamma;-irradiated adherent human keratinocytes9.

Quantification of &amp;#947;H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

Quantification of DNA double-strand streaks using &gamma;H2AX formation as a molecular marker has become an invaluable tool in radiation biology. Here we demonstrate the use of an immunofluorescence assay for quantification of &gamma;H2AX foci after exposure of cells to radiation.

الكمي بؤر γH2AX في الاستجابة للإشعاع المؤين

DNA double-strand breaks (DSBs), which are induced by either endogenous metabolic processes or by exogenous sources, are one of the most critical DNA ...

Evaluation of the Spatial Distribution of &gamma;H2AX following Ionizing Radiation

An early molecular response to DNA double-strand breaks (DSBs) is phosphorylation of the Ser-139 residue within the terminal SQEY motif of the histone H2AX1,2. This phosphorylation of H2AX is mediated by the phosphatidyl-inosito 3-kinase (PI3K) family of proteins, ataxia telangiectasia mutated (ATM), DNA-protein kinase catalytic subunit and ATM and RAD3-related (ATR)3. The phosphorylated form of H2AX, referred to as &gamma;H2AX, spreads to adjacent regions of chromatin from the site of the DSB, forming discrete foci, which are easily visualized by immunofluorecence microscopy3. Analysis and quantitation of &gamma;H2AX foci has been widely used to evaluate DSB formation and repair, particularly in response to ionizing radiation and for evaluating the efficacy of various radiation modifying compounds and cytotoxic compounds4.
Given the exquisite specificity and sensitivity of this de novo marker of DSBs, it has provided new insights into the processes of DNA damage and repair in the context of chromatin. For example, in radiation biology the central paradigm is that the nuclear DNA is the critical target with respect to radiation sensitivity. Indeed, the general consensus in the field has largely been to view chromatin as a homogeneous template for DNA damage and repair. However, with the use of &gamma;H2AX as molecular marker of DSBs, a disparity in &gamma;-irradiation-induced &gamma;H2AX foci formation in euchromatin and heterochromatin has been observed5-7. Recently, we used a panel of antibodies to either mono-, di- or tri- methylated histone H3 at lysine 9 (H3K9me1, H3K9me2, H3K9me3) which are epigenetic imprints of constitutive heterochromatin and transcriptional silencing and lysine 4 (H3K4me1, H3K4me2, H3K4me3), which are tightly correlated actively transcribing euchromatic regions, to investigate the spatial distribution of &gamma;H2AX following ionizing radiation8. In accordance with the prevailing ideas regarding chromatin biology, our findings indicated a close correlation between &gamma;H2AX formation and active transcription9. Here we demonstrate our immunofluorescence method for detection and quantitation of &gamma;H2AX foci in non-adherent cells, with a particular focus on co-localization with other epigenetic markers, image analysis and 3D-modeling.

Evaluation of the Spatial Distribution of &amp;#947;H2AX following Ionizing Radiation

Microscopic analysis of &gamma;H2AX foci, which form following the phosphorylation of H2AX at Ser-139 in response to DNA double-strand breaks, has become an invaluable tool in radiation biology. Here we used an antibody to mono-methylated histone H3 at lysine 4 as an epigenetic marker of actively transcribing euchromatin, to evaluate the spatial distribution of radiation-induced &gamma;H2AX formation within the nucleus.

تقييم التوزيع المكاني للγH2AX التالية الإشعاعات المؤينة

An early molecular response to DNA double-strand breaks (DSBs) is phosphorylation of the Ser-139 residue within the terminal SQEY motif of the histone ...

A System for Culturing Iris Pigment Epithelial Cells to Study Lens Regeneration in Newt

Salamanders like newt and axolotl possess the ability to regenerate many of its lost body parts such as limbs, the tail with spinal cord, eye, brain, heart, the jaw 1. Specifically, newts are unique for its lens regeneration capability. Upon lens removal, IPE cells of the dorsal iris transdifferentiate to lens cells and eventually form a new lens in about a month 2,3. This property of regeneration is never exhibited by the ventral iris cells. The regeneration potential of the iris cells can be studied by making transplants of the in vitro cultured IPE cells. For the culture, the dorsal and ventral iris cells are first isolated from the eye and cultured separately for a time period of 2 weeks (Figure 1). These cultured cells are reaggregated and implanted back to the newt eye. Past studies have shown that the dorsal reaggregate maintains its lens forming capacity whereas the ventral aggregate does not form a lens, recapitulating, thus the in vivo process (Figure 2) 4,5. This system of determining regeneration potential of dorsal and ventral iris cells is very useful in studying the role of genes and proteins involved in lens regeneration.

In newt, the lens regenerates always from the dorsal iris by transdifferentiation of the iris pigmented epithelial cells (IPEs). Here we describe a procedure to culture dorsal and ventral newt IPE cells and their implantation to the newt eye. The implanted cells are then studied by tissue sectioning and immunohistochemistry.

نظام لخلايا الظهارية التثقيف صبغات قزحية عدسة لدراسة التجديد في نيوت

Salamanders like newt and axolotl possess the ability to regenerate many of its lost body parts such as limbs, the tail with spinal cord, eye, brain, ...

Laser Ablation of the Zebrafish Pronephros to Study Renal Epithelial Regeneration

Acute kidney injury (AKI) is characterized by high mortality rates from deterioration of renal function over a period of hours or days that culminates in renal failure1. AKI can be caused by a number of factors including ischemia, drug-based toxicity, or obstructive injury1. This results in an inability to maintain fluid and electrolyte homeostasis. While AKI has been observed for decades, effective clinical therapies have yet to be developed. Intriguingly, some patients with AKI recover renal functions over time, a mysterious phenomenon that has been only rudimentally characterized1,2. Research using mammalian models of AKI has shown that ischemic or nephrotoxin-injured kidneys experience epithelial cell death in nephron tubules1,2, the functional units of the kidney that are made up of a series of specialized regions (segments) of epithelial cell types3. Within nephrons, epithelial cell death is highest in proximal tubule cells. There is evidence that suggests cell destruction is followed by dedifferentiation, proliferation, and migration of surrounding epithelial cells, which can regenerate the nephron entirely1,2. However, there are many unanswered questions about the mechanisms of renal epithelial regeneration, ranging from the signals that modulate these events to reasons for the wide variation of abilities among humans to regenerate injured kidneys.
The larval zebrafish provides an excellent model to study kidney epithelial regeneration as its pronephric kidney is comprised of nephrons that are conserved with higher vertebrates including mammals4,5. The nephrons of zebrafish larvae can be visualized with fluorescence techniques because of the relative transparency of the young zebrafish6. This provides a unique opportunity to image cell and molecular changes in real-time, in contrast to mammalian models where nephrons are inaccessible because the kidneys are structurally complex systems internalized within the animal. Recent studies have employed the aminoglycoside gentamicin as a toxic causative agent for study of AKI and subsequent renal failure: gentamicin and other antibiotics have been shown to cause AKI in humans, and researchers have formulated methods to use this agent to trigger kidney damage in zebrafish7,8. However, the effects of aminoglycoside toxicity in zebrafish larvae are catastrophic and lethal, which presents a difficulty when studying epithelial regeneration and function over time. Our method presents the use of targeted cell ablation as a novel tool for the study of epithelial injury in zebrafish. Laser ablation gives researchers the ability to induce cell death in a limited population of cells. Varying areas of cells can be targeted based on morphological location, function, or even expression of a particular cellular phenotype. Thus, laser ablation will increase the specificity of what researchers can study, and can be a powerful new approach to shed light on the mechanisms of renal epithelial regeneration. This protocol can be broadly applied to target cell populations in other organs in the zebrafish embryo to study injury and regeneration in any number of contexts of interest.

Acute kidney injury (AKI) in humans is a common clinical problem caused by damage to the epithelial cells that comprise kidney nephrons, and AKI is associated with high mortality rates of 50-70%1. Following epithelial cell destruction, nephrons have a limited ability to regenerate, though the mechanisms and limitations that guide this phenomenon remain poorly understood. In this video article, we describe our technique for targeted laser ablation of kidney nephron cells in the zebrafish embryo kidney, or pronephros. Our new method can be used to complement nephrotoxicity-induced models of AKI and gain a high-resolution understanding of the cell and molecular alterations that are associated with epithelial regeneration in the kidney nephron.

تذرية الليزر للاسماك الزرد سليفة الكلوة لدراسة التجديد طلائي الكلوي

Acute kidney injury (AKI) is characterized by high mortality rates from deterioration of renal function over a period of hours or days that culminates in ...

Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP)

Long noncoding RNAs are key regulators of chromatin states for important biological processes such as dosage compensation, imprinting, and developmental gene expression 1,2,3,4,5,6,7. The recent discovery of thousands of lncRNAs in association with specific chromatin modification complexes, such as Polycomb Repressive Complex 2 (PRC2) that mediates histone H3 lysine 27 trimethylation (H3K27me3), suggests broad roles for numerous lncRNAs in managing chromatin states in a gene-specific fashion 8,9. While some lncRNAs are thought to work in cis on neighboring genes, other lncRNAs work in trans to regulate distantly located genes. For instance, Drosophila lncRNAs roX1 and roX2 bind numerous regions on the X chromosome of male cells, and are critical for dosage compensation 10,11. However, the exact locations of their binding sites are not known at high resolution. Similarly, human lncRNA HOTAIR can affect PRC2 occupancy on hundreds of genes genome-wide 3,12,13, but how specificity is achieved is unclear. LncRNAs can also serve as modular scaffolds to recruit the assembly of multiple protein complexes. The classic trans-acting RNA scaffold is the TERC RNA that serves as the template and scaffold for the telomerase complex 14; HOTAIR can also serve as a scaffold for PRC2 and a H3K4 demethylase complex 13.
Prior studies mapping RNA occupancy at chromatin have revealed substantial insights 15,16, but only at a single gene locus at a time. The occupancy sites of most lncRNAs are not known, and the roles of lncRNAs in chromatin regulation have been mostly inferred from the indirect effects of lncRNA perturbation. Just as chromatin immunoprecipitation followed by microarray or deep sequencing (ChIP-chip or ChIP-seq, respectively) has greatly improved our understanding of protein-DNA interactions on a genomic scale, here we illustrate a recently published strategy to map long RNA occupancy genome-wide at high resolution 17. This method, Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP) (Figure 1), is based on affinity capture of target lncRNA:chromatin complex by tiling antisense-oligos, which then generates a map of genomic binding sites at a resolution of several hundred bases with high sensitivity and low background. ChIRP is applicable to many lncRNAs because the design of affinity-probes is straightforward given the RNA sequence and requires no knowledge of the RNA's structure or functional domains.

Chromatin Isolation by RNA Purification ChIRP

ChIRP is a novel and rapid technique to map genomic binding sites of long noncoding RNAs (lncRNAs). The method takes advantage of the specificity of anti-sense tiling oligonucleotides to allow the enumeration of lncRNA-bound genomic sites.

لونين عزل من قبل تنقية الحمض النووي الريبي (السقسقة)

Long noncoding RNAs are key regulators of chromatin states for important biological processes such as dosage compensation, imprinting, and developmental ...

Rapid Genetic Analysis of Epithelial-Mesenchymal Signaling During Hair Regeneration

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an attractive model system to study organ development and tissue-specific signaling. Although hair follicle development is genetically tractable, fast and reproducible analysis of factors essential for this process remains a challenge. Here we describe a procedure to generate targeted overexpression or shRNA-mediated knockdown of factors using lentivirus in a tissue-specific manner. Using a modified version of a hair regeneration model 5, 6, 11, we can achieve robust gain- or loss-of-function analysis in primary mouse keratinocytes or dermal cells to facilitate study of epithelial-mesenchymal signaling pathways that lead to hair follicle morphogenesis. We describe how to isolate fresh primary mouse keratinocytes and dermal cells, which contain dermal papilla cells and their precursors, deliver lentivirus containing either shRNA or cDNA to one of the cell populations, and combine the cells to generate fully formed hair follicles on the backs of nude mice. This approach allows analysis of tissue-specific factors required to generate hair follicles within three weeks and provides a fast and convenient companion to existing genetic models.

Tissue-specific analysis of a hair follicle regeneration model using lentivirus to mediate gain- or loss-of-function.

تحليل سريع لالوراثية طلائي-الوسيطة اشارة خلال تجديد الشعر

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an ...

Measuring Glutathione-induced Feeding Response in Hydra

Hydra is among the most primitive organisms possessing a nervous system and chemosensation for detecting reduced glutathione (GSH) for capturing the prey. The movement of prey organisms causes mechanosensory discharge of the stinging cells called nematocysts from hydra, which are inserted into the prey. The feeding response in hydra, which includes curling of the tentacles to bring the prey towards the mouth, opening of the mouth and consequent engulfing of the prey, is triggered by GSH present in the fluid released from the injured prey. To be able to identify the molecular mechanism of the feeding response in hydra which is unknown to date, it is necessary to establish an assay to measure the feeding response. Here, we describe a simple method for the quantitation of the feeding response in which the distance between the apical end of the tentacle and mouth of hydra is measured and the ratio of such distance before and after the addition of GSH is determined. The ratio, called the relative tentacle spread, was found to give a measure of the feeding response. This assay was validated using a starvation model in which starved hydra show an enhanced feeding response in comparison with daily fed hydra.

Here we describe a simple assay for the quantification of the feeding response in hydra induced by the reduced form of glutathione. This assay relies on measuring the distance between the apical end of the tentacle and mouth of hydra.

قياس الاستجابة التغذية الناجم عن الجلوتاثيون في حيدرة

Hydra is among the most primitive organisms possessing a nervous system and chemosensation for detecting reduced glutathione (GSH) for capturing the prey. ...

In Vitro and In Vivo Approaches to Determine Intestinal Epithelial Cell Permeability

The intestinal barrier defends against pathogenic microorganism and microbial toxin. Its function is regulated by tight junction permeability and epithelial cell integrity, and disruption of the intestinal barrier function contributes to progression of gastrointestinal and systemic disease. Two simple methods are described here to measure the permeability of intestinal epithelium. In vitro, Caco-2BBe cells are plated in tissue culture wells as a monolayer and transepithelial electrical resistance (TER) can be measured by an epithelial (volt/ohm) meter. This method is convincing because of its user-friendly operation and repeatability. In vivo, mice are gavaged with 4 kDa fluorescein isothiocyanate (FITC)-dextran, and the FITC-dextran concentrations are measured in collected serum samples from mice to determine the epithelial permeability. Oral gavage provides an accurate dose, and therefore is the preferred method to measure the intestinal permeability in vivo. Taken together, these two methods can measure the permeability of the intestinal epithelium in vitro and in vivo, and hence be used to study the connection between diseases and barrier function.

In Vitro and In Vivo Approaches to Determine Intestinal Epithelial Cell Permeability

Two methods are presented here to determine intestinal barrier function. An epithelial meter (volt/ohm) is used for measurements of transepithelial electrical resistance of cultured epithelia directly in tissue culture wells. In mice, the FITC-dextran gavage method is used to determine the intestinal permeability in vivo.

في المختبر و في فيفو النهج لتحديد نفاذية الخلايا الظهارية المعوية

The intestinal barrier defends against pathogenic microorganism and microbial toxin. Its function is regulated by tight junction permeability and ...

Dosimetry for Cell Irradiation using Orthovoltage (40-300 kV) X-Ray Facilities

The importance of dosimetry protocols and standards for radiobiological studies is self-evident. Several protocols have been proposed for dose determination using low energy X-ray facilities, but depending on the irradiation configurations, samples, materials or beam quality, it is sometimes difficult to know which protocol is the most appropriate to employ. We, therefore, propose a dosimetry protocol for cell irradiations using low energy X-ray facility. The aim of this method is to perform the dose estimation at the level of the cell monolayer to make it as close as possible to real cell irradiation conditions. The different steps of the protocol are as follows: determination of the irradiation parameters (high voltage, intensity, cell container etc.), determination of the beam quality index (high voltage-half value layer couple), dose rate measurement with ionization chamber calibrated in air kerma conditions, quantification of the attenuation and scattering of the cell culture medium with EBT3 radiochromic films, and determination of the dose rate at the cellular level. This methodology must be performed for each new cell irradiation configuration as the modification of only one parameter can strongly impact the real dose deposition at the level of the cell monolayer, particularly involving low energy X-rays.

Dosimetry for Cell Irradiation using Orthovoltage 40-300 kV X-Ray Facilities

This document describes a new dosimetry protocol for cell irradiations using low energy X-ray equipment. Measurements are performed in conditions simulating real cell irradiation conditions as much as possible.