Name: intestinal epithelial regeneration in response to ionizing irradiation
Uploaded: 2022-07-27T14:05:00
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作者希望感谢石溪癌症中心组织学研究核心在组织标本制备方面的专家协助，以及石溪大学实验动物资源部在动物护理和处理方面的协助。这项工作得到了美国国立卫生研究院DK124342的资助，授予Agnieszka B. Bialkowska和DK052230授予Vincent W. Yang博士。

所有小鼠都被安置在石溪大学的实验动物资源部（DLAR）。石溪大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准了所有涉及动物受试者的研究和程序。涉及动物受试者的实验严格按照批准的动物处理方案（IACUC #245094）进行。
注意：商业上获得小鼠品系B6;129-Bmi1 tm1（cre/ERT）Mrc/J（Bmi1-Cre ER）和B6.129X1-Gt（ROSA）26Sortm1（EYFP）Cos/J（Rosa26eYFP）（?...

该协议描述了一个稳健且可重复的辐射损伤模型。它允许精确分析损伤后7天内肠上皮的变化。重要的是，所选的时间点反映了损伤的关键阶段，其特征是肠道的明显改变（损伤、细胞凋亡、再生和正常化阶段）60。已经建立并仔细评估了这种照射模型，证明了一种合适的损伤表现，以模仿接受放射治疗的患者所经历的损伤表现61。超过一半的结直肠癌和妇科癌?...

如果完全平放，人类的肠上皮将覆盖大约半个羽毛球场的表面1.相反，这种将人类与肠道内容物分开的单细胞层被压缩成一系列手指状的突起、绒毛和凹痕，这些隐窝使肠道的表面积最大化。上皮细胞沿隐窝绒毛轴分化。绒毛主要由吸收营养的小肠细胞、分泌粘液的高脚杯细胞和产生激素的小肠内分泌细胞组成，而隐窝主要由产生防御素的潘氏细胞、活性和储备干细胞以及祖细胞2，3，4，5组成。此外，这些细胞与底层间充质区室的基质和免疫细胞以及腔内微生物群的双向通信产生了维持肠道稳态的复杂相互作用网络，并且对损伤后的恢复至关重要6，7，8。
肠上皮是人体内自我更新最迅速的组织，周转率为2-6天9，10，11。在体内平衡期间，位于肠隐窝基部的活性干细胞（隐窝基柱状细胞）以表达富含亮氨酸的重复含 G 蛋白偶联受体 5 （LGR5） 为标志，快速分裂并提供分化为所有其他肠上皮谱系的祖细胞。然而，由于其高有丝分裂率，活性干细胞及其直系祖细胞对伽马辐射损伤特别敏感，并在照射后发生细胞凋亡5，12，13，14。在它们丢失时，肠隐窝内的储备干细胞和非干细胞（祖细胞亚群和一些终末分化细胞）经历激活并补充基底隐窝隔室，然后可以重建绒毛的细胞群，从而再生肠上皮15。使用谱系追踪技术，多个研究小组已经证明，储备（静止）干细胞能够在活性干细胞丢失时支持再生13，16，17，18，19，20，21，22。这些细胞的特征在于存在多梳复合蛋白 1 癌基因 （Bmi1）、小鼠端粒酶逆转录酶基因 （mTert）、啤酒花同源盒 （Hopx） 和富含亮氨酸的重复蛋白 1 基因 （Lrig1）。此外，已经表明非干细胞能够在受伤时补充肠道隐窝23，24，25，26，27，28，29，30，31。特别是，已经表明分泌细胞和肠细胞的祖细胞在损伤时经历去分化，恢复为干细胞样细胞，并支持肠上皮的再生。最近的研究已经确定了表达多种标记物的细胞，这些标记物具有在损伤时获得干样特征的能力（例如DLL +，ATOH1 +，PROX1 +，MIST1 +，DCLK1 +）32，33，34，35，36。令人惊讶的是，Yu等人表明，即使是成熟的潘氏细胞（LYZ+）也可以促进肠道再生37。此外，除了引起肠上皮细胞凋亡和破坏上皮屏障功能外，照射还会导致肠道菌群失调，免疫细胞活化和促炎反应的启动，以及间充质和基质细胞的活化38，39。
伽马辐射是癌症治疗中有价值的治疗工具，特别是对于结直肠肿瘤40。然而，照射通过诱导细胞损伤来显着影响肠道稳态，从而导致细胞凋亡。辐射暴露会导致多种扰动，从而减慢患者的康复速度，并以急性期粘膜损伤和炎症以及长期腹泻、尿失禁、出血和腹痛为特征。这一系列表现被称为胃肠道辐射毒性。此外，辐射诱导的透壁纤维化和/或血管硬化的进展可能仅在治疗后数年出现38，41。在损伤本身的同时，辐射在肠道细胞中诱导修复反应，激活负责启动和协调再生的信号通路42。放射诱发的小肠疾病可起源于向其他器官（如子宫颈、前列腺、胰腺、直肠）提供的盆腔或腹部放疗41，43，44，45，46。因此，肠道照射损伤是一个重要的临床问题，更好地了解由此产生的病理生理学可能会推动干预措施的发展，以减轻与放疗相关的胃肠道并发症。除了辐射之外，还有其他技术可以研究肠上皮的再生目的。已经开发了用于研究炎症和此后再生的转基因和化学小鼠模型47。葡聚糖硫酸钠（DSS）诱导肠道炎症，并导致与炎症性肠病相似的特征的发展48。DSS治疗与促癌化合物嘧啶甲烷（AOM）的组合可导致结肠炎相关癌症的发展48，49。缺血再灌注诱导损伤是另一种用于研究肠上皮再生电位的方法。这种技术需要经验和外科知识50.此外，上述技术引起的伤害类型与辐射不同，并可能导致不同再生机制的参与。此外，这些模型非常耗时，而辐射技术相当简短。最近，利用肠和结肠产生的肠和结肠样的体外方法已被与辐射损伤结合使用，以研究肠道再生的机制51，52。然而，这些技术并不能完全概括它们建模的器官53，54。
提出的方案包括对γ辐射损伤小鼠模型的描述，以及结合遗传模型，在他莫昔芬治疗后，允许追踪源自储备干细胞群的谱系（Bmi1-CreER;罗莎26eYFP）。该模型利用 12 Gy 全身照射，诱导足够显着的肠道损伤以激活储备干细胞，同时仍允许在受伤后 7 天内对肠道再生能力进行后续研究55。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mL syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309659</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16G Reusable Small Animal Feeding Needles: Straight</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20068-630</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>27G x 1/2&#34; needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>305109</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>28G x 1/2&#34; Monoject 1mL insulin syringe</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>1188128012</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-Ethynyl-2&#8242;-deoxyuridine (EdU)</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc284628A</td>
			<td>10 mg/mL in sterile DMSO:water (1:4 v/v), aliquot and store in -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Azer Scientific&#160;10% Neutral Buffered Formalin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-026-213</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B6.129X1-Gt(ROSA)26Sortm1(EYFP)Cos/J</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>Strain #:006148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B6;129-Bmi1tm1(cre/ERT)Mrc/J</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>Strain #:010531</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin Fraction V, heat shock</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>3116956001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken anti-GFP</td>
			<td>Aves</td>
			<td>GFP-1020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Click-IT plus EdU Alexa Fluor 555 imaging kit, Invitrogen</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C10638</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corn oil</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>C8267</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Decloaking Chamber</td>
			<td>Biocare Medical</td>
			<td>DC2012</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP231-100</td>
			<td>light sensitive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase-free proteinase K</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C10618H</td>
			<td>diluted 25x in DPBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-chicken AF647</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>703-605-155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>21-031-CV</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence Microscope Nikon Eclipse 90i Bright and fluoerescent light, with objectives: 10X, 20X</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount Aqueous Mounting Medium</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>F4680-25ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gamma Cell 40 Exactor</td>
			<td>Best Theratronics Ltd.</td>
			<td>-</td>
			<td>0.759 Gy min-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit AF488</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>111-545-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin Solution, Gill No. 3</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>GHS332</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HM 325 Rotary Microtome from Thermo Scientific</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>23-900-668</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33258, Pentahydrate (bis-Benzimide)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>H3569</td>
			<td>dilution 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen Peroxide Solution, ACS, 29-32%, Spectrum Chemical</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>18-603-252</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>In Situ Cell Death Detection Kit, Fluorescein (Roche)</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>11684795910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid Blocker Super PAP PEN, Mini</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>DAI-PAP-S-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lithium Carbonate (Powder/Certified ACS), Fisher Chemical</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>L119-500</td>
			<td>0.5g/1L dH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer-Lok Syringe sterile, single use, 10 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89215-218</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH1135-4LP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pharmco Products&#160;Ethyl alcohol, 200 PROOF</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC1675398</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pharmco-Aaper 281000ACSCSLT Acetic Acid ACS Grade</td>
			<td>Capitol Scientific</td>
			<td>AAP-281000ACSCSLT</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-Ki67</td>
			<td>BioCare Medical</td>
			<td>CRM325</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Richard-Allan Scientific Cytoseal XYL Mounting Medium</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-050-262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scientific Industries Incubator-Genie for baking slides at 65 degree</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-728-103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Citrate Dihydrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S279-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless Steel Dissecting Kit</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25640-002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost Plus micro slides [size: 25 x 75 x 1 mm]</td>
			<td>VWR</td>
			<td>&#160;48311-703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tamoxifen</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>T5648</td>
			<td>30 mg/mL in sterile corn oil, preferably fresh or short-sterm storage in -20&#176;C, light sensitive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek 24-Slide Holders with Detachable Handle</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4465</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek&#160;Accu-Edge&#160;Low Profile Blades</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4689</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek&#160;Manual Slide Staining Set</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4451</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek Staining Dish, Green with Lid</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4456</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek Staining Dish, White with Lid</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4457</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>P7949</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Unisette Processing Cassettes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>87002-292</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Micro Cover Glasses</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48393-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>X5P-1GAL</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

intestinal epithelial regeneration in response to ionizing irradiation

肠上皮由单层细胞组成，但包含多种类型的终末分化细胞，这些细胞是由位于肠隐窝底部的肠道干细胞的活跃增殖产生的。然而，在急性肠损伤事件期间，这些活跃的肠道干细胞会经历细胞死亡。伽马射线照射是一种广泛使用的结直肠癌治疗方法，虽然治疗有效，但具有耗尽活性干细胞库的副作用。事实上，患者在接受放疗时经常出现胃肠道辐射综合征，部分原因是活跃的干细胞耗竭。肠隐窝中活性肠道干细胞的丢失激活了通常静止储备的肠道干细胞库，并诱导分泌细胞和肠细胞前体细胞的去分化。如果没有这些细胞，肠上皮将缺乏从放疗和其他此类主要组织损伤中恢复的能力。谱系追踪技术的新进展允许跟踪再生过程中细胞的活化、分化和迁移，并已成功用于肠道研究。本研究旨在描述一种分析辐射损伤后小鼠肠上皮内细胞的方法。

将 12 Gy 全身照射 （TBI） 与小鼠遗传谱系追踪相结合，可以对肠道辐射损伤的后果进行彻底分析。首先， Bmi1-CreER;Rosa26eYFP小鼠接受单次他莫昔芬注射，该注射液在Bmi1 + 储备干细胞群中诱导增强的黄色荧光蛋白（EYFP）表达。注射他莫昔芬两天后，小鼠接受照射或假照射。安乐死前三小时，小鼠被注射EdU。安乐死后，收集小肠标本在照射后0 h、3 h、6 h、24 h、48 h、72 h?...

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Intestinal Epithelial Regeneration in Response to Ionizing Irradiation

胃肠道是放射治疗癌症治疗后对损伤最敏感的器官之一。它同时也是一个器官系统，在这种侮辱之后具有最高的再生能力。所提出的协议描述了一种研究肠上皮再生能力的有效方法。

响应电离照射的肠上皮再生

The intestinal epithelium consists of a single layer of cells yet contains multiple types of terminally differentiated cells, which are generated by the ...

伽马射线照射是一种广泛使用的结直肠癌治疗方法。虽然它在治疗上有效，但它对胃肠道有负面影响。所提出的协议描述了一种有效的方法来研究辐射损伤后再生过程中细胞的活化，分化和迁移。该协议描述了一个稳健且可重复的辐射损伤模型。重要的是，该模型允许跟踪损伤后的肠道细胞命运，从而更好地了解特定细胞亚群的再生能力。该技术可以采用不同的谱系追踪动物模型来研究损伤后细胞各种亚群的实时行为和相互作用。对该方案的微小修改应允许研究辐射损伤时微生物群与不同上皮、基质和免疫细胞群之间的关系。首先，将他莫昔芬粉末重悬于无菌玉米油中，浓度为每微升30微克。在 30 秒的开关周期内以 60% 的振幅进行超声处理三分钟。在室温下在黑暗中旋转混合一小时。然后，通过将无菌DMSO添加到EdU粉末中来制备EdU。加入总体积的1/5，慢慢加入剩余体积的无菌超纯水。完全溶解后，等分并储存在20摄氏度。准备用于组织收集和固定的试剂，例如 70% 乙醇水溶液、冷却至 4 摄氏度的 DPBS、Bouin 固定缓冲液和 10% 缓冲福尔马林。接下来，准备必要的设备，例如小鼠解剖试剂盒，培养皿，连接到10毫升注射器的16号管饲针和组织学盒。在伽马辐照暴露前两天，准备实验动物注射他莫昔芬。称量每只动物，并计算所需剂量。用70%乙醇消毒腹部区域。然后，使用连接到 1 毫升注射器的 27 号针头腹膜内注射单剂量他莫昔芬，以诱导 Cre 介导的重组。在接下来的48小时内观察动物以排除潜在的他莫昔芬毒性。48小时后，将动物转移到照射室。用70%乙醇溶液对伽马辐照器中的样品室进行消毒。将吸收垫和动物放在样品室内。盖上盖子，然后关闭腔室。对伽马辐照器进行编程，使动物暴露于 12 个灰色全身照射下。然后，将钥匙转到起始位置，然后按开始开始曝光。离开房间进行主动曝光时间。经过预设时间后，机器将自动停止并开始发出哔哔声。通过将钥匙转到停止位置来关闭机器。打开样品室，取下盖子。将动物转移到笼子里，并用70%乙醇对样品室进行消毒。将动物转移回传统的住房房间，并在治疗后观察它们的状况。每天监测动物的体重。在计划的安乐死前三小时，对腹部区域进行消毒，并使用28号胰岛素注射器腹膜内注射100微升EdU储备溶液。对动物实施安乐死后，在照射后的不同时间点收集近端肠。解剖小肠的近端，并去除附着的组织。使用连接到 10 毫升注射器的 16 号直进纸针用冷 DPBS 冲洗组织，并用 Bouin 的固定缓冲液固定组织。纵向切开肠子，然后使用瑞士卷技术滚动近端肠。将组织置于组织学盒中，置于装有10%缓冲福尔马林的容器中，并在室温下孵育24至48小时。孵育后，将组织学盒转移到70%乙醇中，并将组织嵌入石蜡中。包埋后，将组织学盒放在冰上至少一小时。然后，使用切片机切割五微米厚的水平切片。将组织切片转移到加热至45摄氏度的水浴中，并将切片放在带电载玻片上。将载玻片放在架子上在室温下过夜晾干。小肠标本的苏木精和伊红图像显示0小时时肠上皮稳态，随后在凋亡期隐窝隔室内细胞丢失。随后是再生阶段，其中高度增殖的细胞填充了隐窝，导致第七天进入正常化阶段。EYFP的谱系追踪表明，在体内平衡期间，来自Bmi1阳性储备干细胞的细胞被限制在隐窝内的正四到六位。EdU和Ki-67染色显示假照射小鼠的肠道稳态正常，从活性干细胞延伸到转运扩增区。在凋亡期，EYFP阳性细胞的数量减少，伴随着辐射损伤引起的增殖细胞的丧失。在再生阶段，观察到储备干细胞的活化和Bmi1阳性细胞的快速增殖。进一步增殖和迁移恢复了肠上皮的完整性。TUNEL 染色显示，在稳态期间不存在凋亡细胞。在凋亡期后期观察到TUNEL染色增加。在再生阶段，再生隐窝内的TUNEL染色稳步下降，并且在隐窝归一化时几乎不存在。该技术可以与RNA测序，单细胞RNA测序，荧光激活细胞分选或蛋白质组学分析相结合，以收集有关特定细胞谱系在损伤后肠道再生中的作用的更深入的知识。研究人员可以研究肠道再生中微生物群与上皮、基质和免疫细胞群之间的相互作用，以扩大对肠上皮再生能力的理解。

Research

JoVE Journal

Biology

Cortical Neurogenesis: Transitioning from Advances in the Laboratory to Cell-Based Therapies

皮层神经再生：从实验室中的研究进展过渡到细胞疗法

科研

生物学

Quantification of &gamma;H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

Quantification of ÃƒÅ½Ã‚Â³H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

电离辐射的反应定量的γH2AX灶

DNA double-strand breaks (DSBs), which are induced by either endogenous metabolic processes or by exogenous sources, are one of the most critical DNA ...

Evaluation of the Spatial Distribution of &gamma;H2AX following Ionizing Radiation

Evaluation of the Spatial Distribution of ÃƒÅ½Ã‚Â³H2AX following Ionizing Radiation

评价以下电离辐射的空间分布的γH2AX

An early molecular response to DNA double-strand breaks (DSBs) is phosphorylation of the Ser-139 residue within the terminal SQEY motif of the histone ...

A System for Culturing Iris Pigment Epithelial Cells to Study Lens Regeneration in Newt

一个系统为培养虹膜色素上皮细胞，研究蝾螈镜头再生

Salamanders like newt and axolotl possess the ability to regenerate many of its lost body parts such as limbs, the tail with spinal cord, eye, brain, ...

Laser Ablation of the Zebrafish Pronephros to Study Renal Epithelial Regeneration

激光烧蚀斑马鱼Pronephros研究肾小管上皮再生

Acute kidney injury (AKI) is characterized by high mortality rates from deterioration of renal function over a period of hours or days that culminates in ...

Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP)

Chromatin Isolation by RNA Purification ChIRP

RNA纯化的染色质隔离（CHIRP）

Long noncoding RNAs are key regulators of chromatin states for important biological processes such as dosage compensation, imprinting, and developmental ...

Rapid Genetic Analysis of Epithelial-Mesenchymal Signaling During Hair Regeneration

在毛发再生的上皮 - 间充质信号的快速遗传分析

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an ...

Measuring Glutathione-induced Feeding Response in Hydra

测量水润谷胱甘肽诱导饲养响应

Hydra is among the most primitive organisms possessing a nervous system and chemosensation for detecting reduced glutathione (GSH) for capturing the prey. ...