Name: intestinal epithelial regeneration in response to ionizing irradiation
Uploaded: 2022-07-27T14:05:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Intestinal Epithelial Regeneration in Response to Ionizing Irradiation at JoVE.com

Forfatterne ønsker at anerkende Stony Brook Cancer Center Histology Research Core for eksperthjælp med forberedelse af vævsprøver og Division of Laboratory Animal Resources ved Stony Brook University for hjælp til dyrepleje og håndtering. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra National Institutes of Health DK124342 tildelt Agnieszka B. Bialkowska og DK052230 til Dr. Vincent W. Yang.

Alle mus blev anbragt i Division of Laboratory Animal Resources (DLAR) ved Stony Brook University. Stony Brook University Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) godkendte alle undersøgelser og procedurer, der involverede dyreforsøgspersoner. Forsøg med dyr blev udført i nøje overensstemmelse med den godkendte dyrehåndteringsprotokol (IACUC # 245094).
BEMÆRK: Musstammer B6;129-Bmi1 tm1(cre/ERT)Mrc/J (Bmi1-Cre ER) og B6.129X1-Gt(ROSA)26Sortm1(EYFP)Cos/J (<...

Denne protokol beskriver en robust og reproducerbar strålingsskademodel. Det giver mulighed for præcis analyse af ændringerne i tarmepitelet i løbet af 7 dage efter skaden. Det er vigtigt, at de valgte tidspunkter afspejler afgørende stadier af skade og er kendetegnet ved tydelige ændringer i tarmen (skade, apoptose, regenerering og normaliseringsfaser)60. Denne bestrålingsmodel er blevet fastlagt og omhyggeligt vurderet, hvilket viser en passende manifestation af efterligningsskade som den...

Det menneskelige tarmepitel ville dække omtrent overfladen af en halv badmintonbane, hvis den blev placeret helt fladt1. I stedet komprimeres dette enkelt cellelag, der adskiller mennesker fra indholdet af deres tarme, til en række fingerlignende fremspring, villi og fordybninger, krypter, der maksimerer tarmens overfladeareal. Cellerne i epitelet differentierer langs en krypt-villusakse. Villus består primært af næringsstofabsorberende enterocytter, slimudskillende bægerceller og de hormonproducerende enteroendokrine celler, mens krypterne primært består af defensinproducerende Paneth-celler, aktive og reservestamceller og stamceller 2,3,4,5. Desuden genererer den tovejskommunikation, disse celler har med stromale og immunceller i det underliggende mesenkymale rum og lumens mikrobiota, et komplekst netværk af interaktioner, der opretholder tarmhomeostase og er afgørende for genopretning efter skade 6,7,8.
Tarmepitelet er det hurtigst selvfornyende væv i menneskekroppen med en omsætningshastighed på 2-6 dage 9,10,11. Under homeostase deler aktive stamceller i bunden af tarmkrypter (kryptbasesøjleceller), der er kendetegnet ved ekspressionen af leucinrige gentagne holdige G-proteinkoblede receptor 5 (LGR5), hurtigt og tilvejebringer stamceller, der adskiller sig i alle andre intestinale epitellinjer. På grund af deres høje mitotiske hastighed er aktive stamceller og deres umiddelbare forfædre imidlertid særligt følsomme over for gammastrålingsskader og gennemgår apoptose efter bestråling 5,12,13,14. Efter deres tab gennemgår reservestamceller og ikke-stamceller (subpopulation af forfædre og nogle terminalt differentierede celler) i tarmkrypter aktivering og genopfylder basalkryptrummet, som derefter kan rekonstituere cellepopulationer af villi og dermed regenerere tarmepitelet15. Ved hjælp af afstamningssporingsteknikker har flere forskergrupper vist, at reservestamceller (hvilende) er i stand til at understøtte regenerering ved tab af aktive stamceller 13,16,17,18,19,20,21,22. Disse celler er karakteriseret ved tilstedeværelsen af polycomb kompleks protein 1 onkogen (Bmi1), mus telomerase revers transkriptase gen (mTert), Hop homeobox (Hopx) og leucin-rige gentage protein 1 gen (Lrig1). Derudover har det vist sig, at ikke-stamceller er i stand til at genopbygge tarmkrypter ved skade 23,24,25,26,27,28,29,30,31. Det har især vist sig, at forfædre til sekretoriske celler og enterocytter gennemgår dedifferentiering ved skade, vender tilbage til stamlignende celler og understøtter regenerering af tarmepitelet. Nylige undersøgelser har identificeret celler, der udtrykker flere markører, der har kapacitet til at erhverve stammelignende egenskaber ved skade (såsom DLL+, ATOH1+, PROX1+, MIST1+, DCLK1+)32,33,34,35,36. Overraskende viste Yu et al., at selv modne Paneth-celler (LYZ +) kan bidrage til intestinal regenerering37. Ud over at forårsage apoptose af intestinale epitelceller og forstyrre epitelbarrierefunktionen resulterer bestråling desuden i dysbiose af tarmfloraen, immuncelleaktivering og initiering af et proinflammatorisk respons samt aktivering af mesenkymale og stromale celler38,39.
Gammastråling er et værdifuldt terapeutisk værktøj i kræftbehandling, især for kolorektal tumorer40. Bestråling påvirker imidlertid signifikant intestinal homeostase ved at fremkalde skade på cellerne, hvilket fører til apoptose. Strålingseksponering forårsager flere forstyrrelser, der bremser patientens opsving og er præget af slimhindeskade og betændelse i den akutte fase og diarré, inkontinens, blødning og mavesmerter på lang sigt. Denne panoply af manifestationer kaldes gastrointestinal strålingstoksicitet. Derudover kan strålingsinduceret progression af transmural fibrose og/eller vaskulær sklerose først manifestere sig år efter behandlingen38,41. Samtidig med selve skaden inducerer stråling et reparationsrespons i tarmceller, der aktiverer signalveje, der er ansvarlige for at initiere og orkestrere regenerering42. Strålingsinduceret tyndtarmssygdom kan stamme fra bækken- eller abdominal strålebehandling, der leveres til andre organer (såsom livmoderhalsen, prostata, bugspytkirtel, endetarm)41,43,44,45,46. Tarmbestrålingsskader er således et væsentligt klinisk problem, og en bedre forståelse af den resulterende patofysiologi vil sandsynligvis fremme udviklingen af interventioner til lindring af gastrointestinale komplikationer forbundet med strålebehandling. Der er andre teknikker, der gør det muligt at undersøge det regenerative formål med tarmepitelet bortset fra stråling. Transgene og kemiske murinmodeller til undersøgelse af inflammation og regenerering derefter er blevet udviklet47. Dextran natriumsulfat (DSS) inducerer betændelse i tarmen og fører til udvikling af egenskaber svarende til inflammatoriske tarmsygdomme48. En kombination af DSS-behandling med den pro-kræftfremkaldende forbindelse azoxymethan (AOM) kan resultere i udvikling af colitis-associeret cancer48,49. Iskæmi reperfusionsinduceret skade er en anden metode, der anvendes til at studere det regenerative potentiale i tarmepitelet. Denne teknik kræver erfaring og kirurgisk viden50. Desuden forårsager ovennævnte teknikker andre typer skader end stråling og kan føre til involvering af forskellige regenereringsmekanismer. Derudover er disse modeller tidskrævende, mens strålingsteknikken er ret kort. For nylig er in vitro-metoder, der anvender enteroider og colonoider genereret fra tarm og tyktarm, blevet anvendt i kombination med strålingsskade til at studere mekanismerne for intestinal regenerering51,52. Disse teknikker rekapitulerer imidlertid ikke fuldt ud det organ, de modellerer53,54.
Den fremlagte protokol indeholder beskrivelsen af en murinmodel af gammastrålingsskade i kombination med en genetisk model, der efter tamoxifenbehandling muliggør sporing af slægter, der stammer fra reservestamcellepopulationen (Bmi1-CreER; Rosa26eYFP). Denne model anvender en 12 Gy totalkropsbestråling, som inducerer signifikant nok tarmskade til at aktivere reservestamceller, mens den stadig giver mulighed for efterfølgende undersøgelse af tarmregenerativ kapacitet inden for 7 dage efter skade55.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mL syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309659</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16G Reusable Small Animal Feeding Needles: Straight</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20068-630</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>27G x 1/2&#34; needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>305109</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>28G x 1/2&#34; Monoject 1mL insulin syringe</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>1188128012</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-Ethynyl-2&#8242;-deoxyuridine (EdU)</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc284628A</td>
			<td>10 mg/mL in sterile DMSO:water (1:4 v/v), aliquot and store in -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Azer Scientific&#160;10% Neutral Buffered Formalin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-026-213</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B6.129X1-Gt(ROSA)26Sortm1(EYFP)Cos/J</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>Strain #:006148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B6;129-Bmi1tm1(cre/ERT)Mrc/J</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>Strain #:010531</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin Fraction V, heat shock</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>3116956001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken anti-GFP</td>
			<td>Aves</td>
			<td>GFP-1020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Click-IT plus EdU Alexa Fluor 555 imaging kit, Invitrogen</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C10638</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corn oil</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>C8267</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Decloaking Chamber</td>
			<td>Biocare Medical</td>
			<td>DC2012</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP231-100</td>
			<td>light sensitive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase-free proteinase K</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C10618H</td>
			<td>diluted 25x in DPBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-chicken AF647</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>703-605-155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>21-031-CV</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence Microscope Nikon Eclipse 90i Bright and fluoerescent light, with objectives: 10X, 20X</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount Aqueous Mounting Medium</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>F4680-25ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gamma Cell 40 Exactor</td>
			<td>Best Theratronics Ltd.</td>
			<td>-</td>
			<td>0.759 Gy min-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit AF488</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>111-545-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin Solution, Gill No. 3</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>GHS332</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HM 325 Rotary Microtome from Thermo Scientific</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>23-900-668</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33258, Pentahydrate (bis-Benzimide)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>H3569</td>
			<td>dilution 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen Peroxide Solution, ACS, 29-32%, Spectrum Chemical</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>18-603-252</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>In Situ Cell Death Detection Kit, Fluorescein (Roche)</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>11684795910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid Blocker Super PAP PEN, Mini</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>DAI-PAP-S-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lithium Carbonate (Powder/Certified ACS), Fisher Chemical</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>L119-500</td>
			<td>0.5g/1L dH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer-Lok Syringe sterile, single use, 10 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89215-218</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH1135-4LP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pharmco Products&#160;Ethyl alcohol, 200 PROOF</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC1675398</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pharmco-Aaper 281000ACSCSLT Acetic Acid ACS Grade</td>
			<td>Capitol Scientific</td>
			<td>AAP-281000ACSCSLT</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-Ki67</td>
			<td>BioCare Medical</td>
			<td>CRM325</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Richard-Allan Scientific Cytoseal XYL Mounting Medium</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-050-262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scientific Industries Incubator-Genie for baking slides at 65 degree</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-728-103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Citrate Dihydrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S279-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless Steel Dissecting Kit</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25640-002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost Plus micro slides [size: 25 x 75 x 1 mm]</td>
			<td>VWR</td>
			<td>&#160;48311-703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tamoxifen</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>T5648</td>
			<td>30 mg/mL in sterile corn oil, preferably fresh or short-sterm storage in -20&#176;C, light sensitive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek 24-Slide Holders with Detachable Handle</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4465</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek&#160;Accu-Edge&#160;Low Profile Blades</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4689</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek&#160;Manual Slide Staining Set</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4451</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek Staining Dish, Green with Lid</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4456</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek Staining Dish, White with Lid</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4457</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>P7949</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Unisette Processing Cassettes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>87002-292</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Micro Cover Glasses</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48393-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>X5P-1GAL</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

intestinal epithelial regeneration in response to ionizing irradiation

Tarmepitelet består af et enkelt lag af celler, men indeholder flere typer terminalt differentierede celler, som genereres ved aktiv spredning af intestinale stamceller placeret i bunden af tarmkrypter. Under tilfælde af akut tarmskade gennemgår disse aktive tarmstamceller imidlertid celledød. Gammabestråling er en meget anvendt kolorektal cancerbehandling, som, selvom den er terapeutisk effektiv, har den bivirkning, at den nedbryder den aktive stamcellepulje. Faktisk oplever patienter ofte gastrointestinalt strålingssyndrom, mens de gennemgår strålebehandling, delvis på grund af aktiv stamcelleudtømning. Tabet af aktive tarmstamceller i tarmkrypter aktiverer en pulje af typisk hvilende reserve intestinale stamceller og inducerer dedifferentiering af sekretoriske og enterocytprecursorceller. Hvis ikke for disse celler, ville tarmepitelet mangle evnen til at komme sig efter strålebehandling og andre sådanne store vævsfornærmelser. Nye fremskridt inden for afstamningssporingsteknologier muliggør sporing af aktivering, differentiering og migration af celler under regenerering og er med succes blevet anvendt til at studere dette i tarmen. Denne undersøgelse har til formål at skildre en metode til analyse af celler i musens tarmepitel efter strålingsskade.

Anvendelsen af 12 Gy totalkropsbestråling (TBI) i kombination med sporing af murin genetisk afstamning muliggør en grundig analyse af konsekvenserne af strålingsskader i tarmen. For at starte, Bmi1-CreER; Rosa26eYFP-mus modtog en enkelt tamoxifeninjektion, som inducerer forbedret gult fluorescerende protein (EYFP) ekspression inden for en Bmi1+ reservestamcellepopulation. To dage efter tamoxifeninjektionen gennemgik musene bestråling eller skinbestråling. Tre timer før euta...

Watch this Scientific Journal Video about Intestinal Epithelial Regeneration in Response to Ionizing Irradiation at JoVE.com

Intestinal Epithelial Regeneration in Response to Ionizing Irradiation

Mave-tarmkanalen er et af de mest følsomme organer for skade ved stråleterapeutiske kræftbehandlinger. Det er samtidig et organsystem med en af de højeste regenerative kapaciteter efter sådanne fornærmelser. Den præsenterede protokol beskriver en effektiv metode til at studere tarmepithelets regenerative kapacitet.

Intestinal epitelregenerering som reaktion på ioniserende bestråling

The intestinal epithelium consists of a single layer of cells yet contains multiple types of terminally differentiated cells, which are generated by the ...

Gammabestråling er en meget anvendt behandling for kolorektal cancer. Og selvom det er terapeutisk effektivt, har det negative virkninger på mave-tarmkanalen. Den præsenterede protokol beskriver en effektiv metode til at studere aktivering, differentiering og migration af celler under regenerering efter strålingsskade.Denne protokol beskriver en robust og reproducerbar strålingsskademodel. Det er vigtigt, at denne model gør det muligt at spore tarmcelleskæbne efter skade og dermed giver bedre forståelse af regenerativ kapacitet hos specifik cellesubpopulation. Denne teknik kan anvende forskellige afstamningssporingsdyremodeller til at studere realtidsadfærd og interaktionen mellem forskellige underpopulationer af celler efter skade.Mindre ændringer af denne protokol bør gøre det muligt at undersøge forholdet mellem mikrobiota og forskellige epitel-, stromale og immuncellepopulationer ved strålingsskade. Til at begynde med resuspenderes tamoxifenpulver i steril majsolie i en koncentration på 30 mikrogram pr. Mikroliter. Sonikere i tre minutter i 30 sekunder on-off cyklusser med 60% amplitude.Bland ved rotation i mørke i en time ved stuetemperatur. Forbered derefter EdU ved at tilsætte steril DMSO til EdU-pulver. Tilsæt 1/5 af det samlede volumen, og tilsæt langsomt det resterende volumen sterilt ultrarent vand.Når den er helt opløst, alikvote og opbevares ved 20 grader Celsius. Forbered reagenser til vævsopsamling og fiksering, såsom 70% ethanol i vand, DPBS kølet til fire grader Celsius, Bouins fikseringsbuffer og 10% bufret formalin. Forbered derefter det nødvendige udstyr, såsom et musedissektionssæt, petriskåle, en 16-gauge sondenål fastgjort til en 10 ml sprøjte og histologiske kassetter.To dage før gammabestråling skal forsøgsdyrene forberedes til tamoxifeninjektion. Væg hvert dyr, og beregn den krævede dosis. Desinficer abdominalområdet med 70% ethanol.Administrer derefter en enkelt dosis tamoxifen intraperitonealt ved hjælp af en 27-gauge nål fastgjort til en milliliter sprøjte for at inducere Cre-medieret rekombination. Overhold dyr i de næste 48 timer for at udelukke potentiel tamoxifentoksicitet. Efter 48 timer overføres dyrene til bestrålingsrummet.Prøvekammeret desinficeres i gammabestrålingsanlægget med 70 % ethanolopløsning. Den absorberende måtte og dyrene anbringes inde i prøvekammeret. Placer låget, og luk kammeret.Programmér gammabestråleren til at udsætte dyr for 12 grå kropsbestråling. Drej derefter nøglen til startpositionen, og tryk på start for at starte eksponeringen. Forlad rummet for aktiv eksponeringstid.Når den forudindstillede tid er gået, stopper maskinen automatisk og begynder at bippe. Sluk for maskinen ved at dreje nøglen i stopposition. Åbn prøvekammeret, og tag låget af.Overfør dyrene til buret, og desinficer prøvekammeret med 70% ethanol. Overfør dyrene tilbage til det konventionelle opstaldningsrum, og overhold deres tilstand efter behandlingen. Overvåg dyrenes vægt hver dag.Tre timer før den planlagte eutanasi desinficeres abdominalområdet og injicerer musene intraperitonealt med 100 mikroliter EdU-stamopløsning ved hjælp af en 28-gauge insulinsprøjte. Efter euthanisering af dyret skal du samle de proksimale tarme på forskellige tidspunkter efter bestråling. Disseker den proksimale del af tyndtarmen, og fjern vedhæftede væv.Skyl vævet med kold DPBS ved hjælp af en 16-gauge lige fodringsnål fastgjort til en 10 ml sprøjte, og fastgør vævet med Bouins fikseringsbuffer. Skær tarmene åbne i længderetningen, og rul de proksimale tarme ved hjælp af schweizerrulleteknikken. Anbring vævene i en histologisk kassette i en beholder med 10% bufret formalin, og inkuber det i 24 til 48 timer ved stuetemperatur.Efter inkubation overføres de histologiske kassetter til 70% ethanol, og vævet indlejres i paraffin. Efter indlejring anbringes de histologiske kassetter på is i mindst en time. Skær derefter fem mikron tykke vandrette sektioner ved hjælp af et mikrotom.Overfør vævssektionerne til et vandbad opvarmet til 45 grader Celsius, og placer sektionerne på ladede dias. Lad diasene stå på et stativ natten over ved stuetemperatur for at tørre. Hæmatoxylin- og eosinbilleder af tyndtarmsprøver viste et homeostatisk tarmepitel ved nul time efterfulgt af tab af celler i kryptrum under den apoptotiske fase.Dette blev efterfulgt af den regenerative fase, hvor stærkt proliferative celler befolkede krypterne, hvilket førte til normaliseringsfasen på dag syv. Sporing af afstamning foretaget af EYFP viste, at cellerne, der stammer fra Bmi1-positive reservestamceller, under homeostase var begrænset til plus fire til plus seks positioner i krypter. EdU- og Ki-67-farvning viste normal intestinal homeostase hos falske bestrålede mus, der strækker sig fra aktive stamceller gennem transit-amplificerende zone.Under den apoptotiske fase faldt antallet af EYFP-positive celler ledsaget af et tab af proliferative celler forårsaget af strålingsskader. I den regenerative fase blev aktivering af reservestamceller og hurtig proliferation af Bmi1-positive celler observeret. Yderligere spredning og migration genoprettede tarmepitelintegritet.TUNEL-farvning viste, at apoptotiske celler er fraværende under homeostase. En stigning i TUNEL-farvning blev observeret sent i den apoptotiske fase. I den regenerative fase faldt TUNEL-farvningen støt inden for de regenererende krypter og var næsten fraværende, da krypterne normaliserede sig.Denne teknik kan kombineres med RNA-sekventering, enkeltcelle RNA-sekventering, fluorescensaktiveret cellesortering eller proteomisk analyse for at få mere dybdegående viden om rollen som specifikke cellelinjer under tarmregenerering efter skade. Forskerne kan undersøge samspillet mellem mikrobiota og epitel-, stromale og immuncellepopulationer i tarmregenerering for at udvide forståelsen af tarmepithelets regenerative evne.

Research

JoVE Journal

Biology

Cortical Neurogenesis: Transitioning from Advances in the Laboratory to Cell-Based Therapies

Quantification of &gamma;H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

Quantification of ÃƒÅ½Ã‚Â³H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

DNA double-strand breaks (DSBs), which are induced by either endogenous metabolic processes or by exogenous sources, are one of the most critical DNA ...

Evaluation of the Spatial Distribution of &gamma;H2AX following Ionizing Radiation

Evaluation of the Spatial Distribution of ÃƒÅ½Ã‚Â³H2AX following Ionizing Radiation

An early molecular response to DNA double-strand breaks (DSBs) is phosphorylation of the Ser-139 residue within the terminal SQEY motif of the histone ...

A System for Culturing Iris Pigment Epithelial Cells to Study Lens Regeneration in Newt

Salamanders like newt and axolotl possess the ability to regenerate many of its lost body parts such as limbs, the tail with spinal cord, eye, brain, ...

Laser Ablation of the Zebrafish Pronephros to Study Renal Epithelial Regeneration

Acute kidney injury (AKI) is characterized by high mortality rates from deterioration of renal function over a period of hours or days that culminates in ...

Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP)

Chromatin Isolation by RNA Purification ChIRP

Chromatin Isolering af RNA Oprensning (chirp)

Long noncoding RNAs are key regulators of chromatin states for important biological processes such as dosage compensation, imprinting, and developmental ...

Rapid Genetic Analysis of Epithelial-Mesenchymal Signaling During Hair Regeneration

Hurtig genetisk analyse af Epithelial-mesenkyme Signaling Under Hair Regeneration

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an ...

Measuring Glutathione-induced Feeding Response in Hydra

Måling Glutathion-induceret Fodring respons i Hydra

Hydra is among the most primitive organisms possessing a nervous system and chemosensation for detecting reduced glutathione (GSH) for capturing the prey. ...