Name: intestinal epithelial regeneration in response to ionizing irradiation
Uploaded: 2022-07-27T14:05:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Intestinal Epithelial Regeneration in Response to Ionizing Irradiation at JoVE.com

De auteurs willen de Stony Brook Cancer Center Histology Research Core erkennen voor deskundige hulp bij de voorbereiding van weefselmonsters en de afdeling Laboratory Animal Resources aan de Stony Brook University voor hulp bij de verzorging en behandeling van dieren. Dit werk werd ondersteund door subsidies van de National Institutes of Health DK124342 toegekend aan Agnieszka B. Bialkowska en DK052230 aan Dr. Vincent W. Yang.

Alle muizen werden ondergebracht in de Division of Laboratory Animal Resources (DLAR) aan de Stony Brook University. De Stony Brook University Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) keurde alle studies en procedures met dieren goed. Experimenten met proefdieren werden strikt uitgevoerd in overeenstemming met het goedgekeurde protocol voor het hanteren van dieren (IACUC #245094).
OPMERKING: Muisstammen B6;129-Bmi1 tm1(cre/ERT)Mrc/J (Bmi1-Cre ER) en B6.129X1-Gt(ROSA)26Sortm...

Dit protocol beschrijft een robuust en reproduceerbaar stralingsschademodel. Het maakt de nauwkeurige analyse mogelijk van de veranderingen in het darmepitheel in de loop van 7 dagen na het letsel. Belangrijk is dat de geselecteerde tijdstippen cruciale stadia van letsel weerspiegelen en worden gekenmerkt door duidelijke veranderingen in de darm (letsel, apoptose, regeneratie en normalisatiefasen)60. Dit bestralingsmodel is vastgesteld en zorgvuldig beoordeeld, wat een geschikte manifestatie van l...

Het menselijke darmepitheel zou ongeveer het oppervlak van een half badmintonveld bedekken als hetvolledig vlak 1 zou worden geplaatst. In plaats daarvan wordt deze enkele cellaag die mensen scheidt van de inhoud van hun darmen samengeperst in een reeks vingerachtige projecties, villi en inkepingen, crypten die het oppervlak van de darmen maximaliseren. De cellen van het epitheel differentiëren langs een crypte-villusas. De villus bestaat voornamelijk uit voedingsabsorberende enterocyten, slijmafscheidende bokaalcellen en de hormoonproducerende entero-endocriene cellen, terwijl de crypten voornamelijk bestaan uit defensine-producerende Paneth-cellen, actieve en reservestamcellen en voorlopercellen 2,3,4,5. Bovendien genereert de bidirectionele communicatie die deze cellen hebben met de stromale en immuuncellen van het onderliggende mesenchymale compartiment en de microbiota van het lumen een complex netwerk van interacties dat de darmhomeostase handhaaft en van cruciaal belang is voor herstel na letsel 6,7,8.
Het darmepitheel is het snelst zelfvernieuwende weefsel in het menselijk lichaam, met een omloopsnelheid van 2-6 dagen 9,10,11. Tijdens homeostase delen actieve stamcellen aan de basis van darmcrypten (crypt base columnar cells), gekenmerkt door de expressie van leucine-rijke repeat-bevattende G-eiwit gekoppelde receptor 5 (LGR5), zich snel en leveren voorlopercellen die differentiëren in alle andere intestinale epitheellijnen. Vanwege hun hoge mitotische snelheid zijn actieve stamcellen en hun directe voorlopers echter bijzonder gevoelig voor gammastralingsschade en ondergaan ze apoptose na bestraling 5,12,13,14. Na hun verlies ondergaan reservestamcellen en niet-stamcellen (subpopulatie van voorlopers en sommige terminaal gedifferentieerde cellen) in darmcrypten activering en vullen ze het basale cryptecompartiment aan, dat vervolgens celpopulaties van de villi kan reconstitueren en zo het darmepitheel kan regenereren15. Met behulp van afstammingstechnieken hebben meerdere onderzoeksgroepen aangetoond dat reserve (rustige) stamcellen in staat zijn om regeneratie te ondersteunen bij het verlies van actieve stamcellen 13,16,17,18,19,20,21,22. Deze cellen worden gekenmerkt door de aanwezigheid van polycomb complex protein 1 oncogen (Bmi1), muis telomerase reverse transcriptase gen (mTert), Hop homeobox (Hopx), en leucine-rijke repeat protein 1 gen (Lrig1). Bovendien is aangetoond dat niet-stamcellen in staat zijn om darmcrypten aan te vullen bij letsel 23,24,25,26,27,28,29,30,31. In het bijzonder is aangetoond dat voorlopers van secretoire cellen en enterocyten dedifferentiatie ondergaan bij letsel, terugkeren naar stamachtige cellen en de regeneratie van het darmepitheel ondersteunen. Recente studies hebben cellen geïdentificeerd die meerdere markers tot expressie brengen die de capaciteit bezitten om stamachtige kenmerken te verwerven bij letsel (zoals DLL +, ATOH1 +, PROX1 +, MIST1 +, DCLK1 +) 32,33,34,35,36. Verrassend genoeg toonden Yu et al. aan dat zelfs volwassen Paneth-cellen (LYZ +) kunnen bijdragen aan darmregeneratie37. Bovendien, naast het veroorzaken van apoptose van intestinale epitheelcellen en het verstoren van de epitheelbarrièrefunctie, resulteert bestraling in dysbiose van de darmflora, immuuncelactivering en het initiëren van een pro-inflammatoire reactie, en de activering van mesenchymale en stromale cellen38,39.
Gammastraling is een waardevol therapeutisch hulpmiddel bij de behandeling van kanker, vooral voor colorectale tumoren40. Bestraling beïnvloedt echter de intestinale homeostase aanzienlijk door schade aan de cellen te veroorzaken, wat leidt tot apoptose. Blootstelling aan straling veroorzaakt meerdere verstoringen die het herstel van een patiënt vertragen en wordt gekenmerkt door slijmvliesletsel en ontsteking in de acute fase en diarree, incontinentie, bloedingen en buikpijn op lange termijn. Dit arsenaal aan manifestaties wordt gastro-intestinale stralingstoxiciteit genoemd. Bovendien kan door straling geïnduceerde progressie van transmurale fibrose en/of vasculaire sclerose zich pas jaren na de behandeling manifesteren38,41. Gelijktijdig met het letsel zelf induceert straling een herstelreactie in darmcellen die signaalroutes activeert die verantwoordelijk zijn voor het initiëren en orkestreren van regeneratie42. Door straling geïnduceerde dunne darmziekte kan afkomstig zijn van bekken- of abdominale radiotherapie die wordt toegediend aan andere organen (zoals baarmoederhals, prostaat, pancreas, rectum)41,43,44,45,46. Intestinale bestralingsschade is dus een belangrijk klinisch probleem en een beter begrip van de resulterende pathofysiologie zal waarschijnlijk de ontwikkeling van interventies bevorderen om de gastro-intestinale complicaties geassocieerd met radiotherapie te verlichten. Er zijn andere technieken die het mogelijk maken om het regeneratieve doel van het darmepitheel te onderzoeken, afgezien van straling. Transgene en chemische muizenmodellen om ontstekingen en de regeneratie daarna te bestuderen zijnontwikkeld 47. Dextran natriumsulfaat (DSS) induceert ontsteking in de darm en leidt tot de ontwikkeling van kenmerken die vergelijkbaar zijn met die van inflammatoire darmziekte48. Een combinatie van DSS-behandeling met de pro-carcinogene verbinding azoxymethaan (AOM) kan leiden tot de ontwikkeling van colitis-geassocieerde kanker48,49. Ischemie reperfusie-geïnduceerde schade is een andere methode die wordt gebruikt om het regeneratieve potentieel van het darmepitheel te bestuderen. Deze techniek vereist ervaring en chirurgische kennis50. Bovendien veroorzaken de bovengenoemde technieken andere soorten letsel dan straling en kunnen ze leiden tot de betrokkenheid van verschillende regeneratiemechanismen. Bovendien zijn deze modellen tijdrovend, terwijl de stralingstechniek vrij kort is. Onlangs zijn in vitro methoden met behulp van enteroïden en colonoïden gegenereerd uit de darm en dikke darm gebruikt in combinatie met stralingsletsel om de mechanismen van darmregeneratie te bestuderen51,52. Deze technieken geven echter niet volledig de balans weer van het orgel dat ze modelleren53,54.
Het gepresenteerde protocol omvat de beschrijving van een muizenmodel van gammastralingsschade in combinatie met een genetisch model dat, na behandeling met tamoxifen, het traceren van afstammingslijnen afkomstig van de reservestamcelpopulatie (Bmi1-CreER; Rosa26eYFP). Dit model maakt gebruik van een 12 Gy totale lichaamsbestraling, die voldoende darmletsel veroorzaakt om reservestamcellen te activeren, terwijl het daaropvolgende onderzoek naar het regeneratieve vermogen van de darm binnen 7 dagen na letsel mogelijk is55.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mL syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309659</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16G Reusable Small Animal Feeding Needles: Straight</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20068-630</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>27G x 1/2&#34; needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>305109</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>28G x 1/2&#34; Monoject 1mL insulin syringe</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>1188128012</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-Ethynyl-2&#8242;-deoxyuridine (EdU)</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc284628A</td>
			<td>10 mg/mL in sterile DMSO:water (1:4 v/v), aliquot and store in -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Azer Scientific&#160;10% Neutral Buffered Formalin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-026-213</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B6.129X1-Gt(ROSA)26Sortm1(EYFP)Cos/J</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>Strain #:006148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B6;129-Bmi1tm1(cre/ERT)Mrc/J</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>Strain #:010531</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin Fraction V, heat shock</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>3116956001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken anti-GFP</td>
			<td>Aves</td>
			<td>GFP-1020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Click-IT plus EdU Alexa Fluor 555 imaging kit, Invitrogen</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C10638</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corn oil</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>C8267</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Decloaking Chamber</td>
			<td>Biocare Medical</td>
			<td>DC2012</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP231-100</td>
			<td>light sensitive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase-free proteinase K</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C10618H</td>
			<td>diluted 25x in DPBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-chicken AF647</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>703-605-155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>21-031-CV</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence Microscope Nikon Eclipse 90i Bright and fluoerescent light, with objectives: 10X, 20X</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount Aqueous Mounting Medium</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>F4680-25ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gamma Cell 40 Exactor</td>
			<td>Best Theratronics Ltd.</td>
			<td>-</td>
			<td>0.759 Gy min-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit AF488</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>111-545-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin Solution, Gill No. 3</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>GHS332</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HM 325 Rotary Microtome from Thermo Scientific</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>23-900-668</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33258, Pentahydrate (bis-Benzimide)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>H3569</td>
			<td>dilution 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen Peroxide Solution, ACS, 29-32%, Spectrum Chemical</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>18-603-252</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>In Situ Cell Death Detection Kit, Fluorescein (Roche)</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>11684795910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid Blocker Super PAP PEN, Mini</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>DAI-PAP-S-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lithium Carbonate (Powder/Certified ACS), Fisher Chemical</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>L119-500</td>
			<td>0.5g/1L dH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer-Lok Syringe sterile, single use, 10 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89215-218</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH1135-4LP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pharmco Products&#160;Ethyl alcohol, 200 PROOF</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC1675398</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pharmco-Aaper 281000ACSCSLT Acetic Acid ACS Grade</td>
			<td>Capitol Scientific</td>
			<td>AAP-281000ACSCSLT</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-Ki67</td>
			<td>BioCare Medical</td>
			<td>CRM325</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Richard-Allan Scientific Cytoseal XYL Mounting Medium</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-050-262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scientific Industries Incubator-Genie for baking slides at 65 degree</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-728-103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Citrate Dihydrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S279-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless Steel Dissecting Kit</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25640-002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost Plus micro slides [size: 25 x 75 x 1 mm]</td>
			<td>VWR</td>
			<td>&#160;48311-703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tamoxifen</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>T5648</td>
			<td>30 mg/mL in sterile corn oil, preferably fresh or short-sterm storage in -20&#176;C, light sensitive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek 24-Slide Holders with Detachable Handle</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4465</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek&#160;Accu-Edge&#160;Low Profile Blades</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4689</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek&#160;Manual Slide Staining Set</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4451</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek Staining Dish, Green with Lid</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4456</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek Staining Dish, White with Lid</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4457</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>P7949</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Unisette Processing Cassettes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>87002-292</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Micro Cover Glasses</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48393-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>X5P-1GAL</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

intestinal epithelial regeneration in response to ionizing irradiation

Het darmepitheel bestaat uit een enkele laag cellen, maar bevat meerdere soorten terminaal gedifferentieerde cellen, die worden gegenereerd door de actieve proliferatie van darmstamcellen op de bodem van darmcrypten. Tijdens gebeurtenissen van acuut darmletsel ondergaan deze actieve darmstamcellen echter celdood. Gammabestraling is een veel gebruikte colorectale kankerbehandeling, die, hoewel therapeutisch effectief, de bijwerking heeft van het uitputten van de actieve stamcelpool. Inderdaad, patiënten ervaren vaak gastro-intestinaal stralingssyndroom tijdens het ondergaan van radiotherapie, deels als gevolg van actieve stamceluitputting. Het verlies van actieve intestinale stamcellen in darmcrypten activeert een pool van typisch rustige reserve darmstamcellen en induceert dedifferentiatie van secretoire en enterocytvoorlopercellen. Zonder deze cellen zou het darmepitheel niet in staat zijn om te herstellen van radiotherapie en andere dergelijke belangrijke weefselbeledigingen. Nieuwe ontwikkelingen in lineage-tracing-technologieën maken het mogelijk om de activering, differentiatie en migratie van cellen tijdens regeneratie te volgen en zijn met succes gebruikt om dit in de darm te bestuderen. Deze studie heeft tot doel een methode weer te geven voor de analyse van cellen in het darmepitheel van de muis na stralingsletsel.

Het gebruik van 12 Gy total-body bestraling (TBI) in combinatie met murine genetische afstamming tracing maakt een grondige analyse van de gevolgen van stralingsletsel in de darm mogelijk. Om te beginnen, Bmi1-CreER; Rosa26eYFP-muizen kregen een enkele tamoxifeninjectie, die een verbeterde gele fluorescerende eiwit (EYFP) expressie induceert binnen een Bmi1 + reservestamcelpopulatie. Twee dagen na de tamoxifeninjectie ondergingen de muizen bestraling of schijnbestraling. Drie uur...

Watch this Scientific Journal Video about Intestinal Epithelial Regeneration in Response to Ionizing Irradiation at JoVE.com

Intestinal Epithelial Regeneration in Response to Ionizing Irradiation

Het maagdarmkanaal is een van de meest gevoelige organen voor letsel bij radiotherapeutische kankerbehandelingen. Het is tegelijkertijd een orgaansysteem met een van de hoogste regeneratieve capaciteiten na dergelijke beledigingen. Het gepresenteerde protocol beschrijft een efficiënte methode om het regeneratieve vermogen van het darmepitheel te bestuderen.

Intestinale epitheelregeneratie als reactie op ioniserende bestraling

The intestinal epithelium consists of a single layer of cells yet contains multiple types of terminally differentiated cells, which are generated by the ...

Gammabestraling is een veel gebruikte behandeling voor darmkanker. En hoewel het therapeutisch effectief is, heeft het negatieve effecten op het maagdarmkanaal. Het gepresenteerde protocol beschrijft een efficiënte methode om de activering, differentiatie en migratie van cellen tijdens regeneratie na stralingsletsel te bestuderen.Dit protocol beschrijft een robuust en reproduceerbaar stralingsschademodel. Belangrijk is dat dit model het mogelijk maakt om het lot van darmcellen na letsel te volgen en zo een beter begrip biedt van de regeneratieve capaciteit van specifieke celsubpopulatie. Deze techniek kan verschillende afstammingsmodellen gebruiken om het realtime gedrag en de interactie van verschillende subpopulaties van cellen na verwonding te bestuderen.Kleine wijzigingen in dit protocol moeten het mogelijk maken om de relaties tussen microbiota en verschillende epitheel-, stromale en immuuncelpopulaties bij stralingsschade te onderzoeken. Om te beginnen, resuspendeerde tamoxifen poeder in steriele maïsolie in een concentratie van 30 microgram per microliter. Soniceer gedurende drie minuten in 30 seconden aan-uitcycli met 60% amplitude.Meng door rotatie in het donker gedurende een uur op kamertemperatuur. Bereid vervolgens EdU voor door steriele DMSO toe te voegen aan EdU-poeder. Voeg 1/5 van het totale volume toe en voeg langzaam het resterende volume steriel ultrapuur water toe.Wanneer volledig opgelost, aliquot en bewaren bij 20 graden Celsius. Bereid reagentia voor weefselverzameling en fixatie, zoals 70% ethanol in water, DPBS gekoeld tot vier graden Celsius, Bouin's fixatieve buffer en 10% gebufferde formaline. Bereid vervolgens de benodigde apparatuur voor, zoals een muizendissectiekit, petrischalen, een 16-gauge maagnaald bevestigd aan een spuit van 10 milliliter en histologische cassettes.Twee dagen voor blootstelling aan gammastraling bereiden de proefdieren voor op tamoxifeninjectie. Weeg elk dier en bereken de vereiste dosering. Desinfecteer de buikstreek met 70% ethanol.Dien vervolgens intraperitoneaal een enkele dosis tamoxifen toe met behulp van een naald van 27 gauge die is bevestigd aan een spuit van één milliliter om cre-gemedieerde recombinatie te induceren. Observeer dieren gedurende de komende 48 uur om mogelijke tamoxifentoxiciteit uit te sluiten. Breng de dieren na 48 uur over naar de doorstralingsruimte.Desinfecteer de monsterkamer in de gammabestralingsinstallatie met 70% ethanoloplossing. Plaats de absorberende mat en de dieren in de monsterkamer. Plaats het deksel en sluit de kamer.Programmeer de gammabestraling om dieren bloot te stellen aan 12 grijze totale lichaamsbestralingen. Draai vervolgens de toets naar de startpositie en druk op start om de belichting te starten. Verlaat de kamer voor actieve belichtingstijd.Nadat de vooraf ingestelde tijd is verstreken, stopt het apparaat automatisch en begint het te piepen. Schakel het apparaat uit door de sleutel in de stopstand te draaien. Open de monsterkamer en verwijder het deksel.Breng de dieren over in de kooi en desinfecteer de monsterkamer met 70% ethanol. Breng de dieren terug naar de conventionele huisvestingsruimte en observeer hun toestand na de behandeling. Controleer elke dag het gewicht van de dieren.Drie uur voor de geplande euthanasie, desinfecteer de buikstreek en injecteer de muizen intraperitoneaal met 100 microliter EdU-stamoplossing met behulp van een 28-gauge insulinespuit. Na het euthanaseren van het dier, verzamelt u de proximale darmen op verschillende tijdstippen na de bestraling. Ontleed het proximale deel van de dunne darm en verwijder aangehechte weefsels.Spoel het weefsel met koude DPBS met behulp van een 16-gauge rechte voedingsnaald bevestigd aan een 10-milliliter spuit en fixeer het weefsel met de fixatieve buffer van Bouin. Snijd de darmen in de lengterichting open en rol de proximale darmen met behulp van de Swiss-roll-techniek. Plaats de weefsels in een histologische cassette in een container met 10% gebufferde formaline en incubeer het gedurende 24 tot 48 uur bij kamertemperatuur.Breng na incubatie de histologische cassettes over naar 70% ethanol en sluit het weefsel in paraffine in. Plaats de histologische cassettes na inbedding minstens een uur op ijs. Snijd vervolgens horizontale secties van vijf micron dik met behulp van een microtoom.Breng de weefselsecties over in een waterbad dat is opgewarmd tot 45 graden Celsius en plaats de secties op geladen dia's. Laat de dia's een nacht op kamertemperatuur op een rek liggen om te drogen. Hematoxyline- en eosinebeelden van dunne darmmonsters toonden een homeostatisch darmepitheel op nul uur, gevolgd door het verlies van cellen in cryptecompartimenten tijdens de apoptotische fase.Dit werd gevolgd door de regeneratieve fase waarin zeer proliferatieve cellen de crypten bevolkten, wat leidde tot de normalisatiefase op dag zeven. Afstammingstracering door EYFP toonde aan dat tijdens homeostase de cellen afkomstig van Bmi1-positieve reservestamcellen beperkt waren tot de plus vier tot plus zes posities in crypten. EdU- en Ki-67-kleuring toonde normale intestinale homeostase bij schijnbestraalde muizen, die zich uitstrekten van actieve stamcellen tot de transitversterkende zone.Tijdens de apoptotische fase nam het aantal EYFP-positieve cellen af, vergezeld van een verlies van proliferatieve cellen veroorzaakt door stralingsschade. In de regeneratieve fase werd activering van reservestamcellen en snelle proliferatie van Bmi1-positieve cellen waargenomen. Verdere proliferatie en migratie herstelden de integriteit van het darmepitheel.TUNEL-kleuring toonde aan dat apoptotische cellen afwezig zijn tijdens homeostase. Een toename van TUNEL-kleuring werd laat in de apoptotische fase waargenomen. Tijdens de regeneratieve fase nam de TUNEL-kleuring gestaag af in de regenererende crypten en was bijna afwezig toen de crypten normaliseerden.Deze techniek kan worden gecombineerd met RNA-sequencing, single-cell RNA-sequencing, fluorescentie-geactiveerde celsortering of proteomische analyse om meer diepgaande kennis te vergaren over de rol van specifieke cellijnen tijdens darmregeneratie na letsel. De onderzoekers kunnen de interacties tussen microbiota en epitheliale, stromale en immuuncelpopulaties in darmregeneratie onderzoeken om het begrip van het regeneratieve vermogen van het darmepitheel uit te breiden.

intestinal-epithelial-regeneration-in-response-to-ionizing-irradiation

Research

JoVE Journal

Biology

Cortical Neurogenesis: Transitioning from Advances in the Laboratory to Cell-Based Therapies

Corticale Neurogenese: Overstappen van Vooruitgang in het Laboratorium voor Cell-gebaseerde therapieën

Quantification of &gamma;H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

DNA double-strand breaks (DSBs), which are induced by either endogenous metabolic processes or by exogenous sources, are one of the most critical DNA lesions with respect to survival and preservation of genomic integrity. An early response to the induction of DSBs is phosphorylation of the H2A histone variant, H2AX, at the serine-139 residue, in the highly conserved C-terminal SQEY motif, forming &gamma;H2AX1. Following induction of DSBs, H2AX is rapidly phosphorylated by the phosphatidyl-inosito 3-kinase (PIKK) family of proteins, ataxia telangiectasia mutated (ATM), DNA-protein kinase catalytic subunit and ATM and RAD3-related (ATR)2. Typically, only a few base-pairs (bp) are implicated in a DSB, however, there is significant signal amplification, given the importance of chromatin modifications in DNA damage signalling and repair. Phosphorylation of H2AX mediated predominantly by ATM spreads to adjacent areas of chromatin, affecting approximately 0.03% of total cellular H2AX per DSB2,3. This corresponds to phosphorylation of approximately 2000 H2AX molecules spanning ~2 Mbp regions of chromatin surrounding the site of the DSB and results in the formation of discrete &gamma;H2AX foci which can be easily visualized and quantitated by immunofluorescence microscopy2. The loss of &gamma;H2AX at DSB reflects repair, however, there is some controversy as to what defines complete repair of DSBs; it has been proposed that rejoining of both strands of DNA is adequate however, it has also been suggested that re-instatement of the original chromatin state of compaction is necessary4-8. The disappearence of &gamma;H2AX involves at least in part, dephosphorylation by phosphatases, phosphatase 2A and phosphatase 4C5,6. Further, removal of &gamma;H2AX by redistribution involving histone exchange with H2A.Z has been implicated7,8. Importantly, the quantitative analysis of &gamma;H2AX foci has led to a wide range of applications in medical and nuclear research. Here, we demonstrate the most commonly used immunofluorescence method for evaluation of initial DNA damage by detection and quantitation of &gamma;H2AX foci in &gamma;-irradiated adherent human keratinocytes9.

Quantification of &amp;#947;H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

Quantification of DNA double-strand streaks using &gamma;H2AX formation as a molecular marker has become an invaluable tool in radiation biology. Here we demonstrate the use of an immunofluorescence assay for quantification of &gamma;H2AX foci after exposure of cells to radiation.

Kwantificering van γH2AX Foci in reactie op ioniserende straling

DNA double-strand breaks (DSBs), which are induced by either endogenous metabolic processes or by exogenous sources, are one of the most critical DNA ...

Evaluation of the Spatial Distribution of &gamma;H2AX following Ionizing Radiation

An early molecular response to DNA double-strand breaks (DSBs) is phosphorylation of the Ser-139 residue within the terminal SQEY motif of the histone H2AX1,2. This phosphorylation of H2AX is mediated by the phosphatidyl-inosito 3-kinase (PI3K) family of proteins, ataxia telangiectasia mutated (ATM), DNA-protein kinase catalytic subunit and ATM and RAD3-related (ATR)3. The phosphorylated form of H2AX, referred to as &gamma;H2AX, spreads to adjacent regions of chromatin from the site of the DSB, forming discrete foci, which are easily visualized by immunofluorecence microscopy3. Analysis and quantitation of &gamma;H2AX foci has been widely used to evaluate DSB formation and repair, particularly in response to ionizing radiation and for evaluating the efficacy of various radiation modifying compounds and cytotoxic compounds4.
Given the exquisite specificity and sensitivity of this de novo marker of DSBs, it has provided new insights into the processes of DNA damage and repair in the context of chromatin. For example, in radiation biology the central paradigm is that the nuclear DNA is the critical target with respect to radiation sensitivity. Indeed, the general consensus in the field has largely been to view chromatin as a homogeneous template for DNA damage and repair. However, with the use of &gamma;H2AX as molecular marker of DSBs, a disparity in &gamma;-irradiation-induced &gamma;H2AX foci formation in euchromatin and heterochromatin has been observed5-7. Recently, we used a panel of antibodies to either mono-, di- or tri- methylated histone H3 at lysine 9 (H3K9me1, H3K9me2, H3K9me3) which are epigenetic imprints of constitutive heterochromatin and transcriptional silencing and lysine 4 (H3K4me1, H3K4me2, H3K4me3), which are tightly correlated actively transcribing euchromatic regions, to investigate the spatial distribution of &gamma;H2AX following ionizing radiation8. In accordance with the prevailing ideas regarding chromatin biology, our findings indicated a close correlation between &gamma;H2AX formation and active transcription9. Here we demonstrate our immunofluorescence method for detection and quantitation of &gamma;H2AX foci in non-adherent cells, with a particular focus on co-localization with other epigenetic markers, image analysis and 3D-modeling.

Evaluation of the Spatial Distribution of &amp;#947;H2AX following Ionizing Radiation

Microscopic analysis of &gamma;H2AX foci, which form following the phosphorylation of H2AX at Ser-139 in response to DNA double-strand breaks, has become an invaluable tool in radiation biology. Here we used an antibody to mono-methylated histone H3 at lysine 4 as an epigenetic marker of actively transcribing euchromatin, to evaluate the spatial distribution of radiation-induced &gamma;H2AX formation within the nucleus.

Evaluatie van de ruimtelijke verdeling van γH2AX volgende ioniserende straling

An early molecular response to DNA double-strand breaks (DSBs) is phosphorylation of the Ser-139 residue within the terminal SQEY motif of the histone ...

A System for Culturing Iris Pigment Epithelial Cells to Study Lens Regeneration in Newt

Salamanders like newt and axolotl possess the ability to regenerate many of its lost body parts such as limbs, the tail with spinal cord, eye, brain, heart, the jaw 1. Specifically, newts are unique for its lens regeneration capability. Upon lens removal, IPE cells of the dorsal iris transdifferentiate to lens cells and eventually form a new lens in about a month 2,3. This property of regeneration is never exhibited by the ventral iris cells. The regeneration potential of the iris cells can be studied by making transplants of the in vitro cultured IPE cells. For the culture, the dorsal and ventral iris cells are first isolated from the eye and cultured separately for a time period of 2 weeks (Figure 1). These cultured cells are reaggregated and implanted back to the newt eye. Past studies have shown that the dorsal reaggregate maintains its lens forming capacity whereas the ventral aggregate does not form a lens, recapitulating, thus the in vivo process (Figure 2) 4,5. This system of determining regeneration potential of dorsal and ventral iris cells is very useful in studying the role of genes and proteins involved in lens regeneration.

In newt, the lens regenerates always from the dorsal iris by transdifferentiation of the iris pigmented epithelial cells (IPEs). Here we describe a procedure to culture dorsal and ventral newt IPE cells and their implantation to the newt eye. The implanted cells are then studied by tissue sectioning and immunohistochemistry.

Een systeem voor het kweken van Iris pigment epitheelcellen aan Lens Regeneratie Study in Newt

Salamanders like newt and axolotl possess the ability to regenerate many of its lost body parts such as limbs, the tail with spinal cord, eye, brain, ...

Laser Ablation of the Zebrafish Pronephros to Study Renal Epithelial Regeneration

Acute kidney injury (AKI) is characterized by high mortality rates from deterioration of renal function over a period of hours or days that culminates in renal failure1. AKI can be caused by a number of factors including ischemia, drug-based toxicity, or obstructive injury1. This results in an inability to maintain fluid and electrolyte homeostasis. While AKI has been observed for decades, effective clinical therapies have yet to be developed. Intriguingly, some patients with AKI recover renal functions over time, a mysterious phenomenon that has been only rudimentally characterized1,2. Research using mammalian models of AKI has shown that ischemic or nephrotoxin-injured kidneys experience epithelial cell death in nephron tubules1,2, the functional units of the kidney that are made up of a series of specialized regions (segments) of epithelial cell types3. Within nephrons, epithelial cell death is highest in proximal tubule cells. There is evidence that suggests cell destruction is followed by dedifferentiation, proliferation, and migration of surrounding epithelial cells, which can regenerate the nephron entirely1,2. However, there are many unanswered questions about the mechanisms of renal epithelial regeneration, ranging from the signals that modulate these events to reasons for the wide variation of abilities among humans to regenerate injured kidneys.
The larval zebrafish provides an excellent model to study kidney epithelial regeneration as its pronephric kidney is comprised of nephrons that are conserved with higher vertebrates including mammals4,5. The nephrons of zebrafish larvae can be visualized with fluorescence techniques because of the relative transparency of the young zebrafish6. This provides a unique opportunity to image cell and molecular changes in real-time, in contrast to mammalian models where nephrons are inaccessible because the kidneys are structurally complex systems internalized within the animal. Recent studies have employed the aminoglycoside gentamicin as a toxic causative agent for study of AKI and subsequent renal failure: gentamicin and other antibiotics have been shown to cause AKI in humans, and researchers have formulated methods to use this agent to trigger kidney damage in zebrafish7,8. However, the effects of aminoglycoside toxicity in zebrafish larvae are catastrophic and lethal, which presents a difficulty when studying epithelial regeneration and function over time. Our method presents the use of targeted cell ablation as a novel tool for the study of epithelial injury in zebrafish. Laser ablation gives researchers the ability to induce cell death in a limited population of cells. Varying areas of cells can be targeted based on morphological location, function, or even expression of a particular cellular phenotype. Thus, laser ablation will increase the specificity of what researchers can study, and can be a powerful new approach to shed light on the mechanisms of renal epithelial regeneration. This protocol can be broadly applied to target cell populations in other organs in the zebrafish embryo to study injury and regeneration in any number of contexts of interest.

Acute kidney injury (AKI) in humans is a common clinical problem caused by damage to the epithelial cells that comprise kidney nephrons, and AKI is associated with high mortality rates of 50-70%1. Following epithelial cell destruction, nephrons have a limited ability to regenerate, though the mechanisms and limitations that guide this phenomenon remain poorly understood. In this video article, we describe our technique for targeted laser ablation of kidney nephron cells in the zebrafish embryo kidney, or pronephros. Our new method can be used to complement nephrotoxicity-induced models of AKI and gain a high-resolution understanding of the cell and molecular alterations that are associated with epithelial regeneration in the kidney nephron.

Laser Ablatie van de zebravis Pronephros renale epitheliale regeneratie Study

Acute kidney injury (AKI) is characterized by high mortality rates from deterioration of renal function over a period of hours or days that culminates in ...

Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP)

Long noncoding RNAs are key regulators of chromatin states for important biological processes such as dosage compensation, imprinting, and developmental gene expression 1,2,3,4,5,6,7. The recent discovery of thousands of lncRNAs in association with specific chromatin modification complexes, such as Polycomb Repressive Complex 2 (PRC2) that mediates histone H3 lysine 27 trimethylation (H3K27me3), suggests broad roles for numerous lncRNAs in managing chromatin states in a gene-specific fashion 8,9. While some lncRNAs are thought to work in cis on neighboring genes, other lncRNAs work in trans to regulate distantly located genes. For instance, Drosophila lncRNAs roX1 and roX2 bind numerous regions on the X chromosome of male cells, and are critical for dosage compensation 10,11. However, the exact locations of their binding sites are not known at high resolution. Similarly, human lncRNA HOTAIR can affect PRC2 occupancy on hundreds of genes genome-wide 3,12,13, but how specificity is achieved is unclear. LncRNAs can also serve as modular scaffolds to recruit the assembly of multiple protein complexes. The classic trans-acting RNA scaffold is the TERC RNA that serves as the template and scaffold for the telomerase complex 14; HOTAIR can also serve as a scaffold for PRC2 and a H3K4 demethylase complex 13.
Prior studies mapping RNA occupancy at chromatin have revealed substantial insights 15,16, but only at a single gene locus at a time. The occupancy sites of most lncRNAs are not known, and the roles of lncRNAs in chromatin regulation have been mostly inferred from the indirect effects of lncRNA perturbation. Just as chromatin immunoprecipitation followed by microarray or deep sequencing (ChIP-chip or ChIP-seq, respectively) has greatly improved our understanding of protein-DNA interactions on a genomic scale, here we illustrate a recently published strategy to map long RNA occupancy genome-wide at high resolution 17. This method, Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP) (Figure 1), is based on affinity capture of target lncRNA:chromatin complex by tiling antisense-oligos, which then generates a map of genomic binding sites at a resolution of several hundred bases with high sensitivity and low background. ChIRP is applicable to many lncRNAs because the design of affinity-probes is straightforward given the RNA sequence and requires no knowledge of the RNA's structure or functional domains.

Chromatin Isolation by RNA Purification ChIRP

ChIRP is a novel and rapid technique to map genomic binding sites of long noncoding RNAs (lncRNAs). The method takes advantage of the specificity of anti-sense tiling oligonucleotides to allow the enumeration of lncRNA-bound genomic sites.

Chromatine Isolatie door RNA-zuivering (Chirp)

Long noncoding RNAs are key regulators of chromatin states for important biological processes such as dosage compensation, imprinting, and developmental ...

Rapid Genetic Analysis of Epithelial-Mesenchymal Signaling During Hair Regeneration

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an attractive model system to study organ development and tissue-specific signaling. Although hair follicle development is genetically tractable, fast and reproducible analysis of factors essential for this process remains a challenge. Here we describe a procedure to generate targeted overexpression or shRNA-mediated knockdown of factors using lentivirus in a tissue-specific manner. Using a modified version of a hair regeneration model 5, 6, 11, we can achieve robust gain- or loss-of-function analysis in primary mouse keratinocytes or dermal cells to facilitate study of epithelial-mesenchymal signaling pathways that lead to hair follicle morphogenesis. We describe how to isolate fresh primary mouse keratinocytes and dermal cells, which contain dermal papilla cells and their precursors, deliver lentivirus containing either shRNA or cDNA to one of the cell populations, and combine the cells to generate fully formed hair follicles on the backs of nude mice. This approach allows analysis of tissue-specific factors required to generate hair follicles within three weeks and provides a fast and convenient companion to existing genetic models.

Tissue-specific analysis of a hair follicle regeneration model using lentivirus to mediate gain- or loss-of-function.

Snelle Genetische analyse van epitheliale-mesenchymale signalering tijdens haar regeneratie

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an ...

Measuring Glutathione-induced Feeding Response in Hydra

Hydra is among the most primitive organisms possessing a nervous system and chemosensation for detecting reduced glutathione (GSH) for capturing the prey. The movement of prey organisms causes mechanosensory discharge of the stinging cells called nematocysts from hydra, which are inserted into the prey. The feeding response in hydra, which includes curling of the tentacles to bring the prey towards the mouth, opening of the mouth and consequent engulfing of the prey, is triggered by GSH present in the fluid released from the injured prey. To be able to identify the molecular mechanism of the feeding response in hydra which is unknown to date, it is necessary to establish an assay to measure the feeding response. Here, we describe a simple method for the quantitation of the feeding response in which the distance between the apical end of the tentacle and mouth of hydra is measured and the ratio of such distance before and after the addition of GSH is determined. The ratio, called the relative tentacle spread, was found to give a measure of the feeding response. This assay was validated using a starvation model in which starved hydra show an enhanced feeding response in comparison with daily fed hydra.

Here we describe a simple assay for the quantification of the feeding response in hydra induced by the reduced form of glutathione. This assay relies on measuring the distance between the apical end of the tentacle and mouth of hydra.

Meten-Glutathion geïnduceerde Feeding Response in Hydra

Hydra is among the most primitive organisms possessing a nervous system and chemosensation for detecting reduced glutathione (GSH) for capturing the prey. ...

In Vitro and In Vivo Approaches to Determine Intestinal Epithelial Cell Permeability

The intestinal barrier defends against pathogenic microorganism and microbial toxin. Its function is regulated by tight junction permeability and epithelial cell integrity, and disruption of the intestinal barrier function contributes to progression of gastrointestinal and systemic disease. Two simple methods are described here to measure the permeability of intestinal epithelium. In vitro, Caco-2BBe cells are plated in tissue culture wells as a monolayer and transepithelial electrical resistance (TER) can be measured by an epithelial (volt/ohm) meter. This method is convincing because of its user-friendly operation and repeatability. In vivo, mice are gavaged with 4 kDa fluorescein isothiocyanate (FITC)-dextran, and the FITC-dextran concentrations are measured in collected serum samples from mice to determine the epithelial permeability. Oral gavage provides an accurate dose, and therefore is the preferred method to measure the intestinal permeability in vivo. Taken together, these two methods can measure the permeability of the intestinal epithelium in vitro and in vivo, and hence be used to study the connection between diseases and barrier function.

In Vitro and In Vivo Approaches to Determine Intestinal Epithelial Cell Permeability

Two methods are presented here to determine intestinal barrier function. An epithelial meter (volt/ohm) is used for measurements of transepithelial electrical resistance of cultured epithelia directly in tissue culture wells. In mice, the FITC-dextran gavage method is used to determine the intestinal permeability in vivo.

In Vitro en In Vivo benaderingen te bepalen van intestinale epitheliale cel permeabiliteit

The intestinal barrier defends against pathogenic microorganism and microbial toxin. Its function is regulated by tight junction permeability and ...

Dosimetry for Cell Irradiation using Orthovoltage (40-300 kV) X-Ray Facilities

The importance of dosimetry protocols and standards for radiobiological studies is self-evident. Several protocols have been proposed for dose determination using low energy X-ray facilities, but depending on the irradiation configurations, samples, materials or beam quality, it is sometimes difficult to know which protocol is the most appropriate to employ. We, therefore, propose a dosimetry protocol for cell irradiations using low energy X-ray facility. The aim of this method is to perform the dose estimation at the level of the cell monolayer to make it as close as possible to real cell irradiation conditions. The different steps of the protocol are as follows: determination of the irradiation parameters (high voltage, intensity, cell container etc.), determination of the beam quality index (high voltage-half value layer couple), dose rate measurement with ionization chamber calibrated in air kerma conditions, quantification of the attenuation and scattering of the cell culture medium with EBT3 radiochromic films, and determination of the dose rate at the cellular level. This methodology must be performed for each new cell irradiation configuration as the modification of only one parameter can strongly impact the real dose deposition at the level of the cell monolayer, particularly involving low energy X-rays.

Dosimetry for Cell Irradiation using Orthovoltage 40-300 kV X-Ray Facilities

This document describes a new dosimetry protocol for cell irradiations using low energy X-ray equipment. Measurements are performed in conditions simulating real cell irradiation conditions as much as possible.