Name: intestinal epithelial regeneration in response to ionizing irradiation
Uploaded: 2022-07-27T14:05:00
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Les auteurs tiennent à remercier le Stony Brook Cancer Center Histology Research Core pour son expertise dans la préparation des échantillons de tissus et la Division of Laboratory Animal Resources de l’Université Stony Brook pour son aide en matière de soins et de manipulation des animaux. Ce travail a été soutenu par des subventions des National Institutes of Health DK124342 accordées à Agnieszka B. Bialkowska et DK052230 au Dr Vincent W. Yang.

Toutes les souris ont été hébergées dans la Division of Laboratory Animal Resources (DLAR) de l’Université Stony Brook. Le Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux (IACUC) de l’Université Stony Brook a approuvé toutes les études et procédures impliquant des sujets animaux. Les expériences impliquant des sujets animaux ont été menées en stricte conformité avec le protocole approuvé de manipulation des animaux (IACUC #245094).
NOTE: Les souches de souris B...

Ce protocole décrit un modèle robuste et reproductible de lésions radioactives. Il permet l’analyse précise des changements dans l’épithélium intestinal au cours des 7 jours suivant la blessure. Il est important de noter que les points temporels sélectionnés reflètent les étapes cruciales de la lésion et sont caractérisés par des altérations distinctes de l’intestin (phases de lésion, d’apoptose, de régénération et de normalisation)60. Ce modèle d’irradiation a été ?...

L’épithélium intestinal humain couvrirait approximativement la surface d’un demi-terrain de badminton s’il était placé complètement à plat1. Au lieu de cela, cette couche cellulaire unique séparant les humains du contenu de leurs intestins est compactée en une série de projections, de villosités et d’indentations en forme de doigts, des cryptes qui maximisent la surface des intestins. Les cellules de l’épithélium se différencient le long d’un axe crypte-villosités. Les villosités sont principalement constituées d’entérocytes absorbant les nutriments, de cellules caliciformes sécrétrices de mucus et de cellules entéroendocrines productrices d’hormones, tandis que les cryptes sont principalement constituées de cellules de Paneth productrices de défensine, de cellules souches actives et de réserve et de cellules progénitrices 2,3,4,5. De plus, la communication bidirectionnelle de ces cellules avec les cellules stromales et immunitaires du compartiment mésenchymateux sous-jacent et le microbiote de la lumière génère un réseau complexe d’interactions qui maintient l’homéostasie intestinale et est essentiel à la récupération après une blessure 6,7,8.
L’épithélium intestinal est le tissu qui s’auto-renouvelle le plus rapidement dans le corps humain, avec un taux de renouvellement de 2-6 jours 9,10,11. Au cours de l’homéostasie, les cellules souches actives à la base des cryptes intestinales (cellules cylindriques de la base cryptique), marquées par l’expression du récepteur couplé à la protéine G 5 (LGR5) riche en protéines répétées et riche en leucine, se divisent rapidement et fournissent des cellules progénitrices qui se différencient en toutes les autres lignées épithéliales intestinales. Cependant, en raison de leur taux mitotique élevé, les cellules souches actives et leurs progéniteurs immédiats sont particulièrement sensibles aux lésions par rayonnement gamma et subissent une apoptose après irradiation 5,12,13,14. Lors de leur perte, les cellules souches de réserve et les cellules non souches (sous-population de progéniteurs et certaines cellules différenciées en phase terminale) au sein des cryptes intestinales subissent une activation et reconstituent le compartiment de la crypte basale, qui peut alors reconstituer les populations cellulaires des villosités et, ainsi, régénérer l’épithéliumintestinal 15. En utilisant des techniques de traçage de la lignée, plusieurs groupes de recherche ont démontré que les cellules souches de réserve (quiescentes) sont capables de soutenir la régénération lors de la perte de cellules souches actives 13,16,17,18,19,20,21,22. Ces cellules sont caractérisées par la présence de l’oncogène de la protéine 1 du complexe polycomb (Bmi1), du gène de la transcriptase inverse de la télomérase de souris (mTert), de l’homéobox du houblon (Hopx) et du gène de la protéine 1 répétitive riche en leucine (Lrig1). En outre, il a été démontré que les cellules non souches sont capables de reconstituer les cryptes intestinales en cas de lésion 23,24,25,26,27,28,29,30,31. En particulier, il a été démontré que les progéniteurs des cellules sécrétoires et des entérocytes subissent une dédifférenciation lors d’une blessure, redeviennent des cellules souches et favorisent la régénération de l’épithélium intestinal. Des études récentes ont identifié des cellules exprimant plusieurs marqueurs qui possèdent la capacité d’acquérir des caractéristiques de type souche en cas de blessure (telles que DLL+, ATOH1+, PROX1+, MIST1+, DCLK1+)32,33,34,35,36. Étonnamment, Yu et al. ont montré que même les cellules de Paneth matures (LYZ +) peuvent contribuer à la régénération intestinale37. De plus, en plus de provoquer l’apoptose des cellules épithéliales intestinales et de perturber la fonction de barrière épithéliale, l’irradiation entraîne une dysbiose de la flore intestinale, l’activation des cellules immunitaires et l’initiation d’une réponse pro-inflammatoire, ainsi que l’activation des cellules mésenchymateuses et stromales38,39.
Le rayonnement gamma est un outil thérapeutique précieux dans le traitement du cancer, en particulier pour les tumeurs colorectales40. Cependant, l’irradiation affecte de manière significative l’homéostasie intestinale en induisant des dommages aux cellules, ce qui conduit à l’apoptose. L’exposition aux rayonnements provoque de multiples perturbations qui ralentissent le rétablissement d’un patient et est marquée par des lésions muqueuses et une inflammation dans la phase aiguë et de la diarrhée, de l’incontinence, des saignements et des douleurs abdominales à long terme. Cette panoplie de manifestations est appelée toxicité des rayonnements gastro-intestinaux. De plus, la progression radio-induite de la fibrose transmurale et/ou de la sclérose vasculaire peut ne se manifester que des années après le traitement38,41. Simultanément à la blessure elle-même, le rayonnement induit une réponse de réparation dans les cellules intestinales qui active les voies de signalisation responsables de l’initiation et de l’orchestration de la régénération42. La maladie de l’intestin grêle radio-induite peut provenir d’une radiothérapie pelvienne ou abdominale administrée à d’autres organes (comme le col de l’utérus, la prostate, le pancréas, le rectum)41,43,44,45,46. Les lésions par irradiation intestinale constituent donc un problème clinique important, et une meilleure compréhension de la physiopathologie qui en résulte est susceptible de faire progresser le développement d’interventions visant à atténuer les complications gastro-intestinales associées à la radiothérapie. Il existe d’autres techniques qui permettent d’étudier le but régénérateur de l’épithélium intestinal en dehors de la radiation. Des modèles murins transgéniques et chimiques pour étudier l’inflammation et la régénération par la suite ont été développés47. Le sulfate de sodium de dextrane (DSS) induit une inflammation dans l’intestin et conduit au développement de caractéristiques similaires à celles de la maladie inflammatoire de l’intestin48. Une combinaison de traitement DSS avec le composé pro-cancérogène azoxyméthane (OMA) peut entraîner le développement d’un cancer associé à la colite48,49. Les lésions induites par la reperfusion ischémique sont une autre méthode utilisée pour étudier le potentiel de régénération de l’épithélium intestinal. Cette technique nécessite de l’expérience et des connaissances chirurgicales50. En outre, les techniques susmentionnées causent différents types de lésions que les rayonnements et peuvent entraîner l’implication de différents mécanismes de régénération. De plus, ces modèles prennent beaucoup de temps, alors que la technique de rayonnement est assez brève. Récemment, des méthodes in vitro utilisant des entéroïdes et des colonoïdes générés par l’intestin et le côlon ont été utilisées en combinaison avec des lésions radiologiques pour étudier les mécanismes de la régénération intestinale51,52. Cependant, ces techniques ne récapitulent pas complètement l’organe qu’elles modélisent53,54.
Le protocole présenté comprend la description d’un modèle murin de lésion par rayonnement gamma en combinaison avec un modèle génétique qui, après un traitement au tamoxifène, permet de retracer les lignées provenant de la population de cellules souches de réserve (Bmi1-CreER; Rosa26eYFP). Ce modèle utilise une irradiation totale du corps de 12 Gy, qui induit des lésions intestinales suffisamment importantes pour activer les cellules souches de réserve tout en permettant l’étude ultérieure de la capacité de régénération intestinale dans les 7 jours suivant la lésion55.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mL syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309659</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16G Reusable Small Animal Feeding Needles: Straight</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20068-630</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>27G x 1/2&#34; needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>305109</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>28G x 1/2&#34; Monoject 1mL insulin syringe</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>1188128012</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-Ethynyl-2&#8242;-deoxyuridine (EdU)</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc284628A</td>
			<td>10 mg/mL in sterile DMSO:water (1:4 v/v), aliquot and store in -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Azer Scientific&#160;10% Neutral Buffered Formalin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-026-213</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B6.129X1-Gt(ROSA)26Sortm1(EYFP)Cos/J</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>Strain #:006148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B6;129-Bmi1tm1(cre/ERT)Mrc/J</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>Strain #:010531</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin Fraction V, heat shock</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>3116956001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken anti-GFP</td>
			<td>Aves</td>
			<td>GFP-1020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Click-IT plus EdU Alexa Fluor 555 imaging kit, Invitrogen</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C10638</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corn oil</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>C8267</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Decloaking Chamber</td>
			<td>Biocare Medical</td>
			<td>DC2012</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP231-100</td>
			<td>light sensitive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase-free proteinase K</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C10618H</td>
			<td>diluted 25x in DPBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-chicken AF647</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>703-605-155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>21-031-CV</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence Microscope Nikon Eclipse 90i Bright and fluoerescent light, with objectives: 10X, 20X</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount Aqueous Mounting Medium</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>F4680-25ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gamma Cell 40 Exactor</td>
			<td>Best Theratronics Ltd.</td>
			<td>-</td>
			<td>0.759 Gy min-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit AF488</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>111-545-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin Solution, Gill No. 3</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>GHS332</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HM 325 Rotary Microtome from Thermo Scientific</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>23-900-668</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33258, Pentahydrate (bis-Benzimide)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>H3569</td>
			<td>dilution 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen Peroxide Solution, ACS, 29-32%, Spectrum Chemical</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>18-603-252</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>In Situ Cell Death Detection Kit, Fluorescein (Roche)</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>11684795910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid Blocker Super PAP PEN, Mini</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>DAI-PAP-S-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lithium Carbonate (Powder/Certified ACS), Fisher Chemical</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>L119-500</td>
			<td>0.5g/1L dH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer-Lok Syringe sterile, single use, 10 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89215-218</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH1135-4LP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pharmco Products&#160;Ethyl alcohol, 200 PROOF</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC1675398</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pharmco-Aaper 281000ACSCSLT Acetic Acid ACS Grade</td>
			<td>Capitol Scientific</td>
			<td>AAP-281000ACSCSLT</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-Ki67</td>
			<td>BioCare Medical</td>
			<td>CRM325</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Richard-Allan Scientific Cytoseal XYL Mounting Medium</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-050-262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scientific Industries Incubator-Genie for baking slides at 65 degree</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-728-103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Citrate Dihydrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S279-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless Steel Dissecting Kit</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25640-002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost Plus micro slides [size: 25 x 75 x 1 mm]</td>
			<td>VWR</td>
			<td>&#160;48311-703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tamoxifen</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>T5648</td>
			<td>30 mg/mL in sterile corn oil, preferably fresh or short-sterm storage in -20&#176;C, light sensitive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek 24-Slide Holders with Detachable Handle</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4465</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek&#160;Accu-Edge&#160;Low Profile Blades</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4689</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek&#160;Manual Slide Staining Set</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4451</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek Staining Dish, Green with Lid</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4456</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek Staining Dish, White with Lid</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4457</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>P7949</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Unisette Processing Cassettes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>87002-292</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Micro Cover Glasses</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48393-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>X5P-1GAL</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

intestinal epithelial regeneration in response to ionizing irradiation

L’épithélium intestinal est constitué d’une seule couche de cellules, mais contient plusieurs types de cellules différenciées en phase terminale, qui sont générées par la prolifération active de cellules souches intestinales situées au fond des cryptes intestinales. Cependant, lors d’événements de lésions intestinales aiguës, ces cellules souches intestinales actives subissent la mort cellulaire. L’irradiation gamma est un traitement du cancer colorectal largement utilisé qui, bien qu’efficace sur le plan thérapeutique, a pour effet secondaire d’épuiser le pool de cellules souches actives. En effet, les patients souffrent fréquemment d’un syndrome de radiation gastro-intestinale pendant la radiothérapie, en partie en raison de l’épuisement actif des cellules souches. La perte de cellules souches intestinales actives dans les cryptes intestinales active un pool de cellules souches intestinales de réserve typiquement quiescentes et induit une dédifférenciation des cellules précurseurs sécrétoires et entérocytaires. Sans ces cellules, l’épithélium intestinal n’aurait pas la capacité de se remettre de la radiothérapie et d’autres agressions tissulaires majeures. De nouvelles avancées dans les technologies de traçage de lignée permettent de suivre l’activation, la différenciation et la migration des cellules pendant la régénération et ont été utilisées avec succès pour étudier cela dans l’intestin. Cette étude vise à décrire une méthode d’analyse des cellules de l’épithélium intestinal de la souris à la suite d’une lésion radiologique.

L’utilisation de l’irradiation totale du corps (TBI) de 12 Gy en combinaison avec le traçage génétique murin de la lignée permet une analyse approfondie des conséquences des lésions radiologiques dans l’intestin. Pour commencer, Bmi1-CreER; Les souris Rosa26eYFP ont reçu une seule injection de tamoxifène, ce qui induit une expression améliorée de la protéine fluorescente jaune (EYFP) au sein d’une population de cellules souches de réserve Bmi1+ . Deux jours ap...

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Intestinal Epithelial Regeneration in Response to Ionizing Irradiation

Le tractus gastro-intestinal est l’un des organes les plus sensibles aux blessures lors des traitements radiothérapeutiques contre le cancer. C’est à la fois un système d’organes avec l’une des capacités de régénération les plus élevées à la suite de telles insultes. Le protocole présenté décrit une méthode efficace pour étudier la capacité de régénération de l’épithélium intestinal.

Régénération épithéliale intestinale en réponse à une irradiation ionisante

The intestinal epithelium consists of a single layer of cells yet contains multiple types of terminally differentiated cells, which are generated by the ...

L’irradiation gamma est un traitement largement utilisé pour le cancer colorectal. Et bien qu’il soit thérapeutiquement efficace, il a des effets négatifs sur le tractus gastro-intestinal. Le protocole présenté décrit une méthode efficace pour étudier l’activation, la différenciation et la migration des cellules pendant la régénération après une lésion radiologique.Ce protocole décrit un modèle robuste et reproductible de lésions radioactives. Il est important de noter que ce modèle permet de suivre le devenir des cellules intestinales à la suite d’une blessure et permet ainsi de mieux comprendre la capacité de régénération d’une sous-population cellulaire spécifique. Cette technique peut utiliser des modèles animaux distincts de traçage de lignée pour étudier le comportement en temps réel et l’interaction de diverses sous-populations de cellules après une blessure.Des modifications mineures de ce protocole devraient permettre d’étudier les relations entre le microbiote et différentes populations de cellules épithéliales, stromales et immunitaires en cas de lésion radiologique. Pour commencer, remettez en suspension la poudre de tamoxifène dans de l’huile de maïs stérile à une concentration de 30 microgrammes par microlitre. Sonicate pendant trois minutes en 30 secondes cycles marche-arrêt avec une amplitude de 60%.Mélanger par rotation dans l’obscurité pendant une heure à température ambiante. Ensuite, préparez EdU en ajoutant du DMSO stérile à la poudre EdU. Ajouter 1/5 du volume total et ajouter lentement le volume restant d’eau ultrapure stérile.Une fois complètement dissous, aliquote et conserver à 20 degrés Celsius. Préparer des réactifs pour la collecte et la fixation des tissus, tels que l’éthanol à 70 % dans l’eau, le DPBS refroidi à quatre degrés Celsius, le tampon fixateur de Bouin et le formol tamponné à 10 %. Ensuite, préparez l’équipement nécessaire, tel qu’un kit de dissection de souris, des boîtes de Petri, une aiguille de gavage de calibre 16 fixée à une seringue de 10 millilitres et des cassettes histologiques.Deux jours avant l’exposition à l’irradiation gamma, préparer les animaux de laboratoire à l’injection de tamoxifène. Pesez chaque animal et calculez la dose requise. Désinfectez la région abdominale avec de l’éthanol à 70%.Ensuite, administrer une dose unique de tamoxifène par voie intrapéritonéale à l’aide d’une aiguille de calibre 27 fixée à une seringue d’un millilitre pour induire une recombinaison médiée par Cre. Observez les animaux pendant les prochaines 48 heures pour exclure toute toxicité potentielle du tamoxifène. Après 48 heures, transférez les animaux dans la salle d’irradiation.Désinfectez la chambre d’échantillonnage dans l’irradiateur gamma avec une solution d’éthanol à 70%. Placez le tapis absorbant et les animaux à l’intérieur de la chambre d’échantillonnage. Placez le couvercle et fermez la chambre.Programmez l’irradiateur gamma pour exposer les animaux à 12 gris d’irradiation corporelle totale. Ensuite, tournez la clé sur la position de départ et appuyez sur Démarrer pour lancer l’exposition. Quittez la pièce pour un temps d’exposition actif.Une fois le temps prédéfini écoulé, la machine s’arrête automatiquement et commence à émettre un bip. Éteignez la machine en tournant la clé en position d’arrêt. Ouvrez la chambre d’échantillonnage et retirez le couvercle.Transférer les animaux dans la cage et désinfecter la chambre d’échantillonnage avec de l’éthanol à 70%. Transférez les animaux dans la salle de logement conventionnelle et observez leur état après le traitement. Surveillez le poids des animaux tous les jours.Trois heures avant l’euthanasie prévue, désinfectez la région abdominale et injectez aux souris par voie intrapéritonéale 100 microlitres de solution mère d’EdU à l’aide d’une seringue à insuline de calibre 28. Après avoir euthanasié l’animal, prélever les intestins proximaux à différents moments après l’irradiation. Disséquez la partie proximale de l’intestin grêle et retirez les tissus attachés.Rincez le tissu avec du DPBS froid à l’aide d’une aiguille d’alimentation droite de calibre 16 fixée à une seringue de 10 millilitres et fixez le tissu avec le tampon fixateur de Bouin. Coupez les intestins ouverts longitudinalement et roulez les intestins proximaux en utilisant la technique Swiss-roll. Placez les tissus dans une cassette histologique dans un récipient contenant du formol tamponné à 10% et incuber pendant 24 à 48 heures à température ambiante.Après l’incubation, transférer les cassettes histologiques à 70% d’éthanol et incorporer le tissu dans de la paraffine. Après l’intégration, placez les cassettes histologiques sur de la glace pendant au moins une heure. Ensuite, coupez des sections horizontales de cinq microns d’épaisseur à l’aide d’un microtome.Transférer les sections de tissu dans un bain-marie chauffé à 45 degrés Celsius et placer les sections sur des lames chargées. Laissez sécher les lames sur une grille pendant la nuit à température ambiante. Les images d’hématoxyline et d’éosine d’échantillons d’intestin grêle ont montré un épithélium intestinal homéostatique à zéro heure, suivi de la perte de cellules dans les compartiments cryptiques pendant la phase apoptotique.Cela a été suivi par la phase de régénération dans laquelle les cellules hautement prolifératives ont peuplé les cryptes, conduisant à la phase de normalisation au septième jour. Le traçage de la lignée par EYFP a montré que pendant l’homéostasie, les cellules provenant des cellules souches de réserve positive Bmi1 étaient limitées aux positions plus quatre à plus six dans les cryptes. La coloration EdU et Ki-67 a montré une homéostasie intestinale normale chez des souris irradiées simulées, s’étendant des cellules souches actives à travers la zone amplifiant le transit.Au cours de la phase apoptotique, le nombre de cellules EYFP-positives a diminué, accompagné d’une perte de cellules prolifératives causée par les dommages causés par les radiations. Dans la phase de régénération, l’activation des cellules souches de réserve et la prolifération rapide des cellules Bmi1-positives ont été observées. La poursuite de la prolifération et de la migration a restauré l’intégrité de l’épithélium intestinal.La coloration TUNEL a montré que les cellules apoptotiques sont absentes pendant l’homéostasie. Une augmentation de la coloration TUNEL a été observée tard dans la phase apoptotique. Au cours de la phase de régénération, la coloration TUNEL a diminué régulièrement dans les cryptes en régénération et était presque absente lorsque les cryptes se sont normalisées.Cette technique peut être combinée avec le séquençage de l’ARN, le séquençage de l’ARN unicellulaire, le tri cellulaire activé par fluorescence ou l’analyse protéomique pour glaner des connaissances plus approfondies sur le rôle de lignées cellulaires spécifiques pendant la régénération intestinale à la suite d’une blessure. Les chercheurs peuvent étudier les interactions entre le microbiote et les populations de cellules épithéliales, stromales et immunitaires dans la régénération intestinale afin d’élargir la compréhension de la capacité de régénération de l’épithélium intestinal.

intestinal-epithelial-regeneration-in-response-to-ionizing-irradiation

Research

JoVE Journal

Biology

Cortical Neurogenesis: Transitioning from Advances in the Laboratory to Cell-Based Therapies

Neurogenèse corticale: Passage de progrès dans le laboratoire pour des thérapies cellulaires

Recherche

Biologie

Quantification of &gamma;H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

DNA double-strand breaks (DSBs), which are induced by either endogenous metabolic processes or by exogenous sources, are one of the most critical DNA lesions with respect to survival and preservation of genomic integrity. An early response to the induction of DSBs is phosphorylation of the H2A histone variant, H2AX, at the serine-139 residue, in the highly conserved C-terminal SQEY motif, forming &gamma;H2AX1. Following induction of DSBs, H2AX is rapidly phosphorylated by the phosphatidyl-inosito 3-kinase (PIKK) family of proteins, ataxia telangiectasia mutated (ATM), DNA-protein kinase catalytic subunit and ATM and RAD3-related (ATR)2. Typically, only a few base-pairs (bp) are implicated in a DSB, however, there is significant signal amplification, given the importance of chromatin modifications in DNA damage signalling and repair. Phosphorylation of H2AX mediated predominantly by ATM spreads to adjacent areas of chromatin, affecting approximately 0.03% of total cellular H2AX per DSB2,3. This corresponds to phosphorylation of approximately 2000 H2AX molecules spanning ~2 Mbp regions of chromatin surrounding the site of the DSB and results in the formation of discrete &gamma;H2AX foci which can be easily visualized and quantitated by immunofluorescence microscopy2. The loss of &gamma;H2AX at DSB reflects repair, however, there is some controversy as to what defines complete repair of DSBs; it has been proposed that rejoining of both strands of DNA is adequate however, it has also been suggested that re-instatement of the original chromatin state of compaction is necessary4-8. The disappearence of &gamma;H2AX involves at least in part, dephosphorylation by phosphatases, phosphatase 2A and phosphatase 4C5,6. Further, removal of &gamma;H2AX by redistribution involving histone exchange with H2A.Z has been implicated7,8. Importantly, the quantitative analysis of &gamma;H2AX foci has led to a wide range of applications in medical and nuclear research. Here, we demonstrate the most commonly used immunofluorescence method for evaluation of initial DNA damage by detection and quantitation of &gamma;H2AX foci in &gamma;-irradiated adherent human keratinocytes9.

Quantification of &amp;#947;H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

Quantification of DNA double-strand streaks using &gamma;H2AX formation as a molecular marker has become an invaluable tool in radiation biology. Here we demonstrate the use of an immunofluorescence assay for quantification of &gamma;H2AX foci after exposure of cells to radiation.

Quantification des γH2AX Foci en réponse aux radiations ionisantes

DNA double-strand breaks (DSBs), which are induced by either endogenous metabolic processes or by exogenous sources, are one of the most critical DNA ...

Evaluation of the Spatial Distribution of &gamma;H2AX following Ionizing Radiation

An early molecular response to DNA double-strand breaks (DSBs) is phosphorylation of the Ser-139 residue within the terminal SQEY motif of the histone H2AX1,2. This phosphorylation of H2AX is mediated by the phosphatidyl-inosito 3-kinase (PI3K) family of proteins, ataxia telangiectasia mutated (ATM), DNA-protein kinase catalytic subunit and ATM and RAD3-related (ATR)3. The phosphorylated form of H2AX, referred to as &gamma;H2AX, spreads to adjacent regions of chromatin from the site of the DSB, forming discrete foci, which are easily visualized by immunofluorecence microscopy3. Analysis and quantitation of &gamma;H2AX foci has been widely used to evaluate DSB formation and repair, particularly in response to ionizing radiation and for evaluating the efficacy of various radiation modifying compounds and cytotoxic compounds4.
Given the exquisite specificity and sensitivity of this de novo marker of DSBs, it has provided new insights into the processes of DNA damage and repair in the context of chromatin. For example, in radiation biology the central paradigm is that the nuclear DNA is the critical target with respect to radiation sensitivity. Indeed, the general consensus in the field has largely been to view chromatin as a homogeneous template for DNA damage and repair. However, with the use of &gamma;H2AX as molecular marker of DSBs, a disparity in &gamma;-irradiation-induced &gamma;H2AX foci formation in euchromatin and heterochromatin has been observed5-7. Recently, we used a panel of antibodies to either mono-, di- or tri- methylated histone H3 at lysine 9 (H3K9me1, H3K9me2, H3K9me3) which are epigenetic imprints of constitutive heterochromatin and transcriptional silencing and lysine 4 (H3K4me1, H3K4me2, H3K4me3), which are tightly correlated actively transcribing euchromatic regions, to investigate the spatial distribution of &gamma;H2AX following ionizing radiation8. In accordance with the prevailing ideas regarding chromatin biology, our findings indicated a close correlation between &gamma;H2AX formation and active transcription9. Here we demonstrate our immunofluorescence method for detection and quantitation of &gamma;H2AX foci in non-adherent cells, with a particular focus on co-localization with other epigenetic markers, image analysis and 3D-modeling.

Evaluation of the Spatial Distribution of &amp;#947;H2AX following Ionizing Radiation

Microscopic analysis of &gamma;H2AX foci, which form following the phosphorylation of H2AX at Ser-139 in response to DNA double-strand breaks, has become an invaluable tool in radiation biology. Here we used an antibody to mono-methylated histone H3 at lysine 4 as an epigenetic marker of actively transcribing euchromatin, to evaluate the spatial distribution of radiation-induced &gamma;H2AX formation within the nucleus.

Évaluation de la distribution spatiale des rayonnements ionisants suivantes γH2AX

An early molecular response to DNA double-strand breaks (DSBs) is phosphorylation of the Ser-139 residue within the terminal SQEY motif of the histone ...

A System for Culturing Iris Pigment Epithelial Cells to Study Lens Regeneration in Newt

Salamanders like newt and axolotl possess the ability to regenerate many of its lost body parts such as limbs, the tail with spinal cord, eye, brain, heart, the jaw 1. Specifically, newts are unique for its lens regeneration capability. Upon lens removal, IPE cells of the dorsal iris transdifferentiate to lens cells and eventually form a new lens in about a month 2,3. This property of regeneration is never exhibited by the ventral iris cells. The regeneration potential of the iris cells can be studied by making transplants of the in vitro cultured IPE cells. For the culture, the dorsal and ventral iris cells are first isolated from the eye and cultured separately for a time period of 2 weeks (Figure 1). These cultured cells are reaggregated and implanted back to the newt eye. Past studies have shown that the dorsal reaggregate maintains its lens forming capacity whereas the ventral aggregate does not form a lens, recapitulating, thus the in vivo process (Figure 2) 4,5. This system of determining regeneration potential of dorsal and ventral iris cells is very useful in studying the role of genes and proteins involved in lens regeneration.

In newt, the lens regenerates always from the dorsal iris by transdifferentiation of the iris pigmented epithelial cells (IPEs). Here we describe a procedure to culture dorsal and ventral newt IPE cells and their implantation to the newt eye. The implanted cells are then studied by tissue sectioning and immunohistochemistry.

Un système de culture de cellules épithéliales de l&#39;iris Pigment étudier la régénération Lens Newt

Salamanders like newt and axolotl possess the ability to regenerate many of its lost body parts such as limbs, the tail with spinal cord, eye, brain, ...

Laser Ablation of the Zebrafish Pronephros to Study Renal Epithelial Regeneration

Acute kidney injury (AKI) is characterized by high mortality rates from deterioration of renal function over a period of hours or days that culminates in renal failure1. AKI can be caused by a number of factors including ischemia, drug-based toxicity, or obstructive injury1. This results in an inability to maintain fluid and electrolyte homeostasis. While AKI has been observed for decades, effective clinical therapies have yet to be developed. Intriguingly, some patients with AKI recover renal functions over time, a mysterious phenomenon that has been only rudimentally characterized1,2. Research using mammalian models of AKI has shown that ischemic or nephrotoxin-injured kidneys experience epithelial cell death in nephron tubules1,2, the functional units of the kidney that are made up of a series of specialized regions (segments) of epithelial cell types3. Within nephrons, epithelial cell death is highest in proximal tubule cells. There is evidence that suggests cell destruction is followed by dedifferentiation, proliferation, and migration of surrounding epithelial cells, which can regenerate the nephron entirely1,2. However, there are many unanswered questions about the mechanisms of renal epithelial regeneration, ranging from the signals that modulate these events to reasons for the wide variation of abilities among humans to regenerate injured kidneys.
The larval zebrafish provides an excellent model to study kidney epithelial regeneration as its pronephric kidney is comprised of nephrons that are conserved with higher vertebrates including mammals4,5. The nephrons of zebrafish larvae can be visualized with fluorescence techniques because of the relative transparency of the young zebrafish6. This provides a unique opportunity to image cell and molecular changes in real-time, in contrast to mammalian models where nephrons are inaccessible because the kidneys are structurally complex systems internalized within the animal. Recent studies have employed the aminoglycoside gentamicin as a toxic causative agent for study of AKI and subsequent renal failure: gentamicin and other antibiotics have been shown to cause AKI in humans, and researchers have formulated methods to use this agent to trigger kidney damage in zebrafish7,8. However, the effects of aminoglycoside toxicity in zebrafish larvae are catastrophic and lethal, which presents a difficulty when studying epithelial regeneration and function over time. Our method presents the use of targeted cell ablation as a novel tool for the study of epithelial injury in zebrafish. Laser ablation gives researchers the ability to induce cell death in a limited population of cells. Varying areas of cells can be targeted based on morphological location, function, or even expression of a particular cellular phenotype. Thus, laser ablation will increase the specificity of what researchers can study, and can be a powerful new approach to shed light on the mechanisms of renal epithelial regeneration. This protocol can be broadly applied to target cell populations in other organs in the zebrafish embryo to study injury and regeneration in any number of contexts of interest.

Acute kidney injury (AKI) in humans is a common clinical problem caused by damage to the epithelial cells that comprise kidney nephrons, and AKI is associated with high mortality rates of 50-70%1. Following epithelial cell destruction, nephrons have a limited ability to regenerate, though the mechanisms and limitations that guide this phenomenon remain poorly understood. In this video article, we describe our technique for targeted laser ablation of kidney nephron cells in the zebrafish embryo kidney, or pronephros. Our new method can be used to complement nephrotoxicity-induced models of AKI and gain a high-resolution understanding of the cell and molecular alterations that are associated with epithelial regeneration in the kidney nephron.

Laser Ablation de l&#39;pronéphros Zebrafish d&#39;étude rénale régénération épithéliale

Acute kidney injury (AKI) is characterized by high mortality rates from deterioration of renal function over a period of hours or days that culminates in ...

Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP)

Long noncoding RNAs are key regulators of chromatin states for important biological processes such as dosage compensation, imprinting, and developmental gene expression 1,2,3,4,5,6,7. The recent discovery of thousands of lncRNAs in association with specific chromatin modification complexes, such as Polycomb Repressive Complex 2 (PRC2) that mediates histone H3 lysine 27 trimethylation (H3K27me3), suggests broad roles for numerous lncRNAs in managing chromatin states in a gene-specific fashion 8,9. While some lncRNAs are thought to work in cis on neighboring genes, other lncRNAs work in trans to regulate distantly located genes. For instance, Drosophila lncRNAs roX1 and roX2 bind numerous regions on the X chromosome of male cells, and are critical for dosage compensation 10,11. However, the exact locations of their binding sites are not known at high resolution. Similarly, human lncRNA HOTAIR can affect PRC2 occupancy on hundreds of genes genome-wide 3,12,13, but how specificity is achieved is unclear. LncRNAs can also serve as modular scaffolds to recruit the assembly of multiple protein complexes. The classic trans-acting RNA scaffold is the TERC RNA that serves as the template and scaffold for the telomerase complex 14; HOTAIR can also serve as a scaffold for PRC2 and a H3K4 demethylase complex 13.
Prior studies mapping RNA occupancy at chromatin have revealed substantial insights 15,16, but only at a single gene locus at a time. The occupancy sites of most lncRNAs are not known, and the roles of lncRNAs in chromatin regulation have been mostly inferred from the indirect effects of lncRNA perturbation. Just as chromatin immunoprecipitation followed by microarray or deep sequencing (ChIP-chip or ChIP-seq, respectively) has greatly improved our understanding of protein-DNA interactions on a genomic scale, here we illustrate a recently published strategy to map long RNA occupancy genome-wide at high resolution 17. This method, Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP) (Figure 1), is based on affinity capture of target lncRNA:chromatin complex by tiling antisense-oligos, which then generates a map of genomic binding sites at a resolution of several hundred bases with high sensitivity and low background. ChIRP is applicable to many lncRNAs because the design of affinity-probes is straightforward given the RNA sequence and requires no knowledge of the RNA's structure or functional domains.

Chromatin Isolation by RNA Purification ChIRP

ChIRP is a novel and rapid technique to map genomic binding sites of long noncoding RNAs (lncRNAs). The method takes advantage of the specificity of anti-sense tiling oligonucleotides to allow the enumeration of lncRNA-bound genomic sites.

Isolement de la chromatine par purification d&#39;ARN (CHIRP)

Long noncoding RNAs are key regulators of chromatin states for important biological processes such as dosage compensation, imprinting, and developmental ...

Rapid Genetic Analysis of Epithelial-Mesenchymal Signaling During Hair Regeneration

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an attractive model system to study organ development and tissue-specific signaling. Although hair follicle development is genetically tractable, fast and reproducible analysis of factors essential for this process remains a challenge. Here we describe a procedure to generate targeted overexpression or shRNA-mediated knockdown of factors using lentivirus in a tissue-specific manner. Using a modified version of a hair regeneration model 5, 6, 11, we can achieve robust gain- or loss-of-function analysis in primary mouse keratinocytes or dermal cells to facilitate study of epithelial-mesenchymal signaling pathways that lead to hair follicle morphogenesis. We describe how to isolate fresh primary mouse keratinocytes and dermal cells, which contain dermal papilla cells and their precursors, deliver lentivirus containing either shRNA or cDNA to one of the cell populations, and combine the cells to generate fully formed hair follicles on the backs of nude mice. This approach allows analysis of tissue-specific factors required to generate hair follicles within three weeks and provides a fast and convenient companion to existing genetic models.

Tissue-specific analysis of a hair follicle regeneration model using lentivirus to mediate gain- or loss-of-function.

Analyse rapide de la génétique des épithélio-mésenchymateuse signalisation lors de la régénération des cheveux

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an ...

Measuring Glutathione-induced Feeding Response in Hydra

Hydra is among the most primitive organisms possessing a nervous system and chemosensation for detecting reduced glutathione (GSH) for capturing the prey. The movement of prey organisms causes mechanosensory discharge of the stinging cells called nematocysts from hydra, which are inserted into the prey. The feeding response in hydra, which includes curling of the tentacles to bring the prey towards the mouth, opening of the mouth and consequent engulfing of the prey, is triggered by GSH present in the fluid released from the injured prey. To be able to identify the molecular mechanism of the feeding response in hydra which is unknown to date, it is necessary to establish an assay to measure the feeding response. Here, we describe a simple method for the quantitation of the feeding response in which the distance between the apical end of the tentacle and mouth of hydra is measured and the ratio of such distance before and after the addition of GSH is determined. The ratio, called the relative tentacle spread, was found to give a measure of the feeding response. This assay was validated using a starvation model in which starved hydra show an enhanced feeding response in comparison with daily fed hydra.

Here we describe a simple assay for the quantification of the feeding response in hydra induced by the reduced form of glutathione. This assay relies on measuring the distance between the apical end of the tentacle and mouth of hydra.

Mesure induite glutathion-réponse d&#39;alimentation à Hydra

Hydra is among the most primitive organisms possessing a nervous system and chemosensation for detecting reduced glutathione (GSH) for capturing the prey. ...

In Vitro and In Vivo Approaches to Determine Intestinal Epithelial Cell Permeability

The intestinal barrier defends against pathogenic microorganism and microbial toxin. Its function is regulated by tight junction permeability and epithelial cell integrity, and disruption of the intestinal barrier function contributes to progression of gastrointestinal and systemic disease. Two simple methods are described here to measure the permeability of intestinal epithelium. In vitro, Caco-2BBe cells are plated in tissue culture wells as a monolayer and transepithelial electrical resistance (TER) can be measured by an epithelial (volt/ohm) meter. This method is convincing because of its user-friendly operation and repeatability. In vivo, mice are gavaged with 4 kDa fluorescein isothiocyanate (FITC)-dextran, and the FITC-dextran concentrations are measured in collected serum samples from mice to determine the epithelial permeability. Oral gavage provides an accurate dose, and therefore is the preferred method to measure the intestinal permeability in vivo. Taken together, these two methods can measure the permeability of the intestinal epithelium in vitro and in vivo, and hence be used to study the connection between diseases and barrier function.

In Vitro and In Vivo Approaches to Determine Intestinal Epithelial Cell Permeability

Two methods are presented here to determine intestinal barrier function. An epithelial meter (volt/ohm) is used for measurements of transepithelial electrical resistance of cultured epithelia directly in tissue culture wells. In mice, the FITC-dextran gavage method is used to determine the intestinal permeability in vivo.

In Vitro et In Vivo des approches pour déterminer la perméabilité des cellules épithéliales intestinales

The intestinal barrier defends against pathogenic microorganism and microbial toxin. Its function is regulated by tight junction permeability and ...

Dosimetry for Cell Irradiation using Orthovoltage (40-300 kV) X-Ray Facilities

The importance of dosimetry protocols and standards for radiobiological studies is self-evident. Several protocols have been proposed for dose determination using low energy X-ray facilities, but depending on the irradiation configurations, samples, materials or beam quality, it is sometimes difficult to know which protocol is the most appropriate to employ. We, therefore, propose a dosimetry protocol for cell irradiations using low energy X-ray facility. The aim of this method is to perform the dose estimation at the level of the cell monolayer to make it as close as possible to real cell irradiation conditions. The different steps of the protocol are as follows: determination of the irradiation parameters (high voltage, intensity, cell container etc.), determination of the beam quality index (high voltage-half value layer couple), dose rate measurement with ionization chamber calibrated in air kerma conditions, quantification of the attenuation and scattering of the cell culture medium with EBT3 radiochromic films, and determination of the dose rate at the cellular level. This methodology must be performed for each new cell irradiation configuration as the modification of only one parameter can strongly impact the real dose deposition at the level of the cell monolayer, particularly involving low energy X-rays.

Dosimetry for Cell Irradiation using Orthovoltage 40-300 kV X-Ray Facilities

This document describes a new dosimetry protocol for cell irradiations using low energy X-ray equipment. Measurements are performed in conditions simulating real cell irradiation conditions as much as possible.