Name: intestinal epithelial regeneration in response to ionizing irradiation
Uploaded: 2022-07-27T14:05:00
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Les auteurs tiennent à remercier le Stony Brook Cancer Center Histology Research Core pour son expertise dans la préparation des échantillons de tissus et la Division of Laboratory Animal Resources de l’Université Stony Brook pour son aide en matière de soins et de manipulation des animaux. Ce travail a été soutenu par des subventions des National Institutes of Health DK124342 accordées à Agnieszka B. Bialkowska et DK052230 au Dr Vincent W. Yang.

Toutes les souris ont été hébergées dans la Division of Laboratory Animal Resources (DLAR) de l’Université Stony Brook. Le Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux (IACUC) de l’Université Stony Brook a approuvé toutes les études et procédures impliquant des sujets animaux. Les expériences impliquant des sujets animaux ont été menées en stricte conformité avec le protocole approuvé de manipulation des animaux (IACUC #245094).
NOTE: Les souches de souris B...

Ce protocole décrit un modèle robuste et reproductible de lésions radioactives. Il permet l’analyse précise des changements dans l’épithélium intestinal au cours des 7 jours suivant la blessure. Il est important de noter que les points temporels sélectionnés reflètent les étapes cruciales de la lésion et sont caractérisés par des altérations distinctes de l’intestin (phases de lésion, d’apoptose, de régénération et de normalisation)60. Ce modèle d’irradiation a été ?...

L’épithélium intestinal humain couvrirait approximativement la surface d’un demi-terrain de badminton s’il était placé complètement à plat1. Au lieu de cela, cette couche cellulaire unique séparant les humains du contenu de leurs intestins est compactée en une série de projections, de villosités et d’indentations en forme de doigts, des cryptes qui maximisent la surface des intestins. Les cellules de l’épithélium se différencient le long d’un axe crypte-villosités. Les villosités sont principalement constituées d’entérocytes absorbant les nutriments, de cellules caliciformes sécrétrices de mucus et de cellules entéroendocrines productrices d’hormones, tandis que les cryptes sont principalement constituées de cellules de Paneth productrices de défensine, de cellules souches actives et de réserve et de cellules progénitrices 2,3,4,5. De plus, la communication bidirectionnelle de ces cellules avec les cellules stromales et immunitaires du compartiment mésenchymateux sous-jacent et le microbiote de la lumière génère un réseau complexe d’interactions qui maintient l’homéostasie intestinale et est essentiel à la récupération après une blessure 6,7,8.
L’épithélium intestinal est le tissu qui s’auto-renouvelle le plus rapidement dans le corps humain, avec un taux de renouvellement de 2-6 jours 9,10,11. Au cours de l’homéostasie, les cellules souches actives à la base des cryptes intestinales (cellules cylindriques de la base cryptique), marquées par l’expression du récepteur couplé à la protéine G 5 (LGR5) riche en protéines répétées et riche en leucine, se divisent rapidement et fournissent des cellules progénitrices qui se différencient en toutes les autres lignées épithéliales intestinales. Cependant, en raison de leur taux mitotique élevé, les cellules souches actives et leurs progéniteurs immédiats sont particulièrement sensibles aux lésions par rayonnement gamma et subissent une apoptose après irradiation 5,12,13,14. Lors de leur perte, les cellules souches de réserve et les cellules non souches (sous-population de progéniteurs et certaines cellules différenciées en phase terminale) au sein des cryptes intestinales subissent une activation et reconstituent le compartiment de la crypte basale, qui peut alors reconstituer les populations cellulaires des villosités et, ainsi, régénérer l’épithéliumintestinal 15. En utilisant des techniques de traçage de la lignée, plusieurs groupes de recherche ont démontré que les cellules souches de réserve (quiescentes) sont capables de soutenir la régénération lors de la perte de cellules souches actives 13,16,17,18,19,20,21,22. Ces cellules sont caractérisées par la présence de l’oncogène de la protéine 1 du complexe polycomb (Bmi1), du gène de la transcriptase inverse de la télomérase de souris (mTert), de l’homéobox du houblon (Hopx) et du gène de la protéine 1 répétitive riche en leucine (Lrig1). En outre, il a été démontré que les cellules non souches sont capables de reconstituer les cryptes intestinales en cas de lésion 23,24,25,26,27,28,29,30,31. En particulier, il a été démontré que les progéniteurs des cellules sécrétoires et des entérocytes subissent une dédifférenciation lors d’une blessure, redeviennent des cellules souches et favorisent la régénération de l’épithélium intestinal. Des études récentes ont identifié des cellules exprimant plusieurs marqueurs qui possèdent la capacité d’acquérir des caractéristiques de type souche en cas de blessure (telles que DLL+, ATOH1+, PROX1+, MIST1+, DCLK1+)32,33,34,35,36. Étonnamment, Yu et al. ont montré que même les cellules de Paneth matures (LYZ +) peuvent contribuer à la régénération intestinale37. De plus, en plus de provoquer l’apoptose des cellules épithéliales intestinales et de perturber la fonction de barrière épithéliale, l’irradiation entraîne une dysbiose de la flore intestinale, l’activation des cellules immunitaires et l’initiation d’une réponse pro-inflammatoire, ainsi que l’activation des cellules mésenchymateuses et stromales38,39.
Le rayonnement gamma est un outil thérapeutique précieux dans le traitement du cancer, en particulier pour les tumeurs colorectales40. Cependant, l’irradiation affecte de manière significative l’homéostasie intestinale en induisant des dommages aux cellules, ce qui conduit à l’apoptose. L’exposition aux rayonnements provoque de multiples perturbations qui ralentissent le rétablissement d’un patient et est marquée par des lésions muqueuses et une inflammation dans la phase aiguë et de la diarrhée, de l’incontinence, des saignements et des douleurs abdominales à long terme. Cette panoplie de manifestations est appelée toxicité des rayonnements gastro-intestinaux. De plus, la progression radio-induite de la fibrose transmurale et/ou de la sclérose vasculaire peut ne se manifester que des années après le traitement38,41. Simultanément à la blessure elle-même, le rayonnement induit une réponse de réparation dans les cellules intestinales qui active les voies de signalisation responsables de l’initiation et de l’orchestration de la régénération42. La maladie de l’intestin grêle radio-induite peut provenir d’une radiothérapie pelvienne ou abdominale administrée à d’autres organes (comme le col de l’utérus, la prostate, le pancréas, le rectum)41,43,44,45,46. Les lésions par irradiation intestinale constituent donc un problème clinique important, et une meilleure compréhension de la physiopathologie qui en résulte est susceptible de faire progresser le développement d’interventions visant à atténuer les complications gastro-intestinales associées à la radiothérapie. Il existe d’autres techniques qui permettent d’étudier le but régénérateur de l’épithélium intestinal en dehors de la radiation. Des modèles murins transgéniques et chimiques pour étudier l’inflammation et la régénération par la suite ont été développés47. Le sulfate de sodium de dextrane (DSS) induit une inflammation dans l’intestin et conduit au développement de caractéristiques similaires à celles de la maladie inflammatoire de l’intestin48. Une combinaison de traitement DSS avec le composé pro-cancérogène azoxyméthane (OMA) peut entraîner le développement d’un cancer associé à la colite48,49. Les lésions induites par la reperfusion ischémique sont une autre méthode utilisée pour étudier le potentiel de régénération de l’épithélium intestinal. Cette technique nécessite de l’expérience et des connaissances chirurgicales50. En outre, les techniques susmentionnées causent différents types de lésions que les rayonnements et peuvent entraîner l’implication de différents mécanismes de régénération. De plus, ces modèles prennent beaucoup de temps, alors que la technique de rayonnement est assez brève. Récemment, des méthodes in vitro utilisant des entéroïdes et des colonoïdes générés par l’intestin et le côlon ont été utilisées en combinaison avec des lésions radiologiques pour étudier les mécanismes de la régénération intestinale51,52. Cependant, ces techniques ne récapitulent pas complètement l’organe qu’elles modélisent53,54.
Le protocole présenté comprend la description d’un modèle murin de lésion par rayonnement gamma en combinaison avec un modèle génétique qui, après un traitement au tamoxifène, permet de retracer les lignées provenant de la population de cellules souches de réserve (Bmi1-CreER; Rosa26eYFP). Ce modèle utilise une irradiation totale du corps de 12 Gy, qui induit des lésions intestinales suffisamment importantes pour activer les cellules souches de réserve tout en permettant l’étude ultérieure de la capacité de régénération intestinale dans les 7 jours suivant la lésion55.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mL syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309659</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16G Reusable Small Animal Feeding Needles: Straight</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20068-630</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>27G x 1/2&#34; needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>305109</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>28G x 1/2&#34; Monoject 1mL insulin syringe</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>1188128012</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-Ethynyl-2&#8242;-deoxyuridine (EdU)</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc284628A</td>
			<td>10 mg/mL in sterile DMSO:water (1:4 v/v), aliquot and store in -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Azer Scientific&#160;10% Neutral Buffered Formalin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-026-213</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B6.129X1-Gt(ROSA)26Sortm1(EYFP)Cos/J</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>Strain #:006148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B6;129-Bmi1tm1(cre/ERT)Mrc/J</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>Strain #:010531</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin Fraction V, heat shock</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>3116956001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken anti-GFP</td>
			<td>Aves</td>
			<td>GFP-1020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Click-IT plus EdU Alexa Fluor 555 imaging kit, Invitrogen</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C10638</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corn oil</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>C8267</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Decloaking Chamber</td>
			<td>Biocare Medical</td>
			<td>DC2012</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP231-100</td>
			<td>light sensitive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase-free proteinase K</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C10618H</td>
			<td>diluted 25x in DPBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-chicken AF647</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>703-605-155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>21-031-CV</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence Microscope Nikon Eclipse 90i Bright and fluoerescent light, with objectives: 10X, 20X</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount Aqueous Mounting Medium</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>F4680-25ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gamma Cell 40 Exactor</td>
			<td>Best Theratronics Ltd.</td>
			<td>-</td>
			<td>0.759 Gy min-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit AF488</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>111-545-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin Solution, Gill No. 3</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>GHS332</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HM 325 Rotary Microtome from Thermo Scientific</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>23-900-668</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33258, Pentahydrate (bis-Benzimide)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>H3569</td>
			<td>dilution 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen Peroxide Solution, ACS, 29-32%, Spectrum Chemical</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>18-603-252</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>In Situ Cell Death Detection Kit, Fluorescein (Roche)</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>11684795910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid Blocker Super PAP PEN, Mini</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>DAI-PAP-S-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lithium Carbonate (Powder/Certified ACS), Fisher Chemical</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>L119-500</td>
			<td>0.5g/1L dH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer-Lok Syringe sterile, single use, 10 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89215-218</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH1135-4LP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pharmco Products&#160;Ethyl alcohol, 200 PROOF</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC1675398</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pharmco-Aaper 281000ACSCSLT Acetic Acid ACS Grade</td>
			<td>Capitol Scientific</td>
			<td>AAP-281000ACSCSLT</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-Ki67</td>
			<td>BioCare Medical</td>
			<td>CRM325</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Richard-Allan Scientific Cytoseal XYL Mounting Medium</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-050-262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scientific Industries Incubator-Genie for baking slides at 65 degree</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-728-103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Citrate Dihydrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S279-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless Steel Dissecting Kit</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25640-002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost Plus micro slides [size: 25 x 75 x 1 mm]</td>
			<td>VWR</td>
			<td>&#160;48311-703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tamoxifen</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>T5648</td>
			<td>30 mg/mL in sterile corn oil, preferably fresh or short-sterm storage in -20&#176;C, light sensitive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek 24-Slide Holders with Detachable Handle</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4465</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek&#160;Accu-Edge&#160;Low Profile Blades</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4689</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek&#160;Manual Slide Staining Set</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4451</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek Staining Dish, Green with Lid</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4456</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek Staining Dish, White with Lid</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4457</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>P7949</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Unisette Processing Cassettes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>87002-292</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Micro Cover Glasses</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48393-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>X5P-1GAL</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

intestinal epithelial regeneration in response to ionizing irradiation

L’épithélium intestinal est constitué d’une seule couche de cellules, mais contient plusieurs types de cellules différenciées en phase terminale, qui sont générées par la prolifération active de cellules souches intestinales situées au fond des cryptes intestinales. Cependant, lors d’événements de lésions intestinales aiguës, ces cellules souches intestinales actives subissent la mort cellulaire. L’irradiation gamma est un traitement du cancer colorectal largement utilisé qui, bien qu’efficace sur le plan thérapeutique, a pour effet secondaire d’épuiser le pool de cellules souches actives. En effet, les patients souffrent fréquemment d’un syndrome de radiation gastro-intestinale pendant la radiothérapie, en partie en raison de l’épuisement actif des cellules souches. La perte de cellules souches intestinales actives dans les cryptes intestinales active un pool de cellules souches intestinales de réserve typiquement quiescentes et induit une dédifférenciation des cellules précurseurs sécrétoires et entérocytaires. Sans ces cellules, l’épithélium intestinal n’aurait pas la capacité de se remettre de la radiothérapie et d’autres agressions tissulaires majeures. De nouvelles avancées dans les technologies de traçage de lignée permettent de suivre l’activation, la différenciation et la migration des cellules pendant la régénération et ont été utilisées avec succès pour étudier cela dans l’intestin. Cette étude vise à décrire une méthode d’analyse des cellules de l’épithélium intestinal de la souris à la suite d’une lésion radiologique.

L’utilisation de l’irradiation totale du corps (TBI) de 12 Gy en combinaison avec le traçage génétique murin de la lignée permet une analyse approfondie des conséquences des lésions radiologiques dans l’intestin. Pour commencer, Bmi1-CreER; Les souris Rosa26eYFP ont reçu une seule injection de tamoxifène, ce qui induit une expression améliorée de la protéine fluorescente jaune (EYFP) au sein d’une population de cellules souches de réserve Bmi1+ . Deux jours ap...

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Intestinal Epithelial Regeneration in Response to Ionizing Irradiation

Le tractus gastro-intestinal est l’un des organes les plus sensibles aux blessures lors des traitements radiothérapeutiques contre le cancer. C’est à la fois un système d’organes avec l’une des capacités de régénération les plus élevées à la suite de telles insultes. Le protocole présenté décrit une méthode efficace pour étudier la capacité de régénération de l’épithélium intestinal.

Régénération épithéliale intestinale en réponse à une irradiation ionisante

The intestinal epithelium consists of a single layer of cells yet contains multiple types of terminally differentiated cells, which are generated by the ...

L’irradiation gamma est un traitement largement utilisé pour le cancer colorectal. Et bien qu’il soit thérapeutiquement efficace, il a des effets négatifs sur le tractus gastro-intestinal. Le protocole présenté décrit une méthode efficace pour étudier l’activation, la différenciation et la migration des cellules pendant la régénération après une lésion radiologique.Ce protocole décrit un modèle robuste et reproductible de lésions radioactives. Il est important de noter que ce modèle permet de suivre le devenir des cellules intestinales à la suite d’une blessure et permet ainsi de mieux comprendre la capacité de régénération d’une sous-population cellulaire spécifique. Cette technique peut utiliser des modèles animaux distincts de traçage de lignée pour étudier le comportement en temps réel et l’interaction de diverses sous-populations de cellules après une blessure.Des modifications mineures de ce protocole devraient permettre d’étudier les relations entre le microbiote et différentes populations de cellules épithéliales, stromales et immunitaires en cas de lésion radiologique. Pour commencer, remettez en suspension la poudre de tamoxifène dans de l’huile de maïs stérile à une concentration de 30 microgrammes par microlitre. Sonicate pendant trois minutes en 30 secondes cycles marche-arrêt avec une amplitude de 60%.Mélanger par rotation dans l’obscurité pendant une heure à température ambiante. Ensuite, préparez EdU en ajoutant du DMSO stérile à la poudre EdU. Ajouter 1/5 du volume total et ajouter lentement le volume restant d’eau ultrapure stérile.Une fois complètement dissous, aliquote et conserver à 20 degrés Celsius. Préparer des réactifs pour la collecte et la fixation des tissus, tels que l’éthanol à 70 % dans l’eau, le DPBS refroidi à quatre degrés Celsius, le tampon fixateur de Bouin et le formol tamponné à 10 %. Ensuite, préparez l’équipement nécessaire, tel qu’un kit de dissection de souris, des boîtes de Petri, une aiguille de gavage de calibre 16 fixée à une seringue de 10 millilitres et des cassettes histologiques.Deux jours avant l’exposition à l’irradiation gamma, préparer les animaux de laboratoire à l’injection de tamoxifène. Pesez chaque animal et calculez la dose requise. Désinfectez la région abdominale avec de l’éthanol à 70%.Ensuite, administrer une dose unique de tamoxifène par voie intrapéritonéale à l’aide d’une aiguille de calibre 27 fixée à une seringue d’un millilitre pour induire une recombinaison médiée par Cre. Observez les animaux pendant les prochaines 48 heures pour exclure toute toxicité potentielle du tamoxifène. Après 48 heures, transférez les animaux dans la salle d’irradiation.Désinfectez la chambre d’échantillonnage dans l’irradiateur gamma avec une solution d’éthanol à 70%. Placez le tapis absorbant et les animaux à l’intérieur de la chambre d’échantillonnage. Placez le couvercle et fermez la chambre.Programmez l’irradiateur gamma pour exposer les animaux à 12 gris d’irradiation corporelle totale. Ensuite, tournez la clé sur la position de départ et appuyez sur Démarrer pour lancer l’exposition. Quittez la pièce pour un temps d’exposition actif.Une fois le temps prédéfini écoulé, la machine s’arrête automatiquement et commence à émettre un bip. Éteignez la machine en tournant la clé en position d’arrêt. Ouvrez la chambre d’échantillonnage et retirez le couvercle.Transférer les animaux dans la cage et désinfecter la chambre d’échantillonnage avec de l’éthanol à 70%. Transférez les animaux dans la salle de logement conventionnelle et observez leur état après le traitement. Surveillez le poids des animaux tous les jours.Trois heures avant l’euthanasie prévue, désinfectez la région abdominale et injectez aux souris par voie intrapéritonéale 100 microlitres de solution mère d’EdU à l’aide d’une seringue à insuline de calibre 28. Après avoir euthanasié l’animal, prélever les intestins proximaux à différents moments après l’irradiation. Disséquez la partie proximale de l’intestin grêle et retirez les tissus attachés.Rincez le tissu avec du DPBS froid à l’aide d’une aiguille d’alimentation droite de calibre 16 fixée à une seringue de 10 millilitres et fixez le tissu avec le tampon fixateur de Bouin. Coupez les intestins ouverts longitudinalement et roulez les intestins proximaux en utilisant la technique Swiss-roll. Placez les tissus dans une cassette histologique dans un récipient contenant du formol tamponné à 10% et incuber pendant 24 à 48 heures à température ambiante.Après l’incubation, transférer les cassettes histologiques à 70% d’éthanol et incorporer le tissu dans de la paraffine. Après l’intégration, placez les cassettes histologiques sur de la glace pendant au moins une heure. Ensuite, coupez des sections horizontales de cinq microns d’épaisseur à l’aide d’un microtome.Transférer les sections de tissu dans un bain-marie chauffé à 45 degrés Celsius et placer les sections sur des lames chargées. Laissez sécher les lames sur une grille pendant la nuit à température ambiante. Les images d’hématoxyline et d’éosine d’échantillons d’intestin grêle ont montré un épithélium intestinal homéostatique à zéro heure, suivi de la perte de cellules dans les compartiments cryptiques pendant la phase apoptotique.Cela a été suivi par la phase de régénération dans laquelle les cellules hautement prolifératives ont peuplé les cryptes, conduisant à la phase de normalisation au septième jour. Le traçage de la lignée par EYFP a montré que pendant l’homéostasie, les cellules provenant des cellules souches de réserve positive Bmi1 étaient limitées aux positions plus quatre à plus six dans les cryptes. La coloration EdU et Ki-67 a montré une homéostasie intestinale normale chez des souris irradiées simulées, s’étendant des cellules souches actives à travers la zone amplifiant le transit.Au cours de la phase apoptotique, le nombre de cellules EYFP-positives a diminué, accompagné d’une perte de cellules prolifératives causée par les dommages causés par les radiations. Dans la phase de régénération, l’activation des cellules souches de réserve et la prolifération rapide des cellules Bmi1-positives ont été observées. La poursuite de la prolifération et de la migration a restauré l’intégrité de l’épithélium intestinal.La coloration TUNEL a montré que les cellules apoptotiques sont absentes pendant l’homéostasie. Une augmentation de la coloration TUNEL a été observée tard dans la phase apoptotique. Au cours de la phase de régénération, la coloration TUNEL a diminué régulièrement dans les cryptes en régénération et était presque absente lorsque les cryptes se sont normalisées.Cette technique peut être combinée avec le séquençage de l’ARN, le séquençage de l’ARN unicellulaire, le tri cellulaire activé par fluorescence ou l’analyse protéomique pour glaner des connaissances plus approfondies sur le rôle de lignées cellulaires spécifiques pendant la régénération intestinale à la suite d’une blessure. Les chercheurs peuvent étudier les interactions entre le microbiote et les populations de cellules épithéliales, stromales et immunitaires dans la régénération intestinale afin d’élargir la compréhension de la capacité de régénération de l’épithélium intestinal.

Research

JoVE Journal

Biology

Cortical Neurogenesis: Transitioning from Advances in the Laboratory to Cell-Based Therapies

Neurogenèse corticale: Passage de progrès dans le laboratoire pour des thérapies cellulaires

Recherche

Biologie

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Quantification des γH2AX Foci en réponse aux radiations ionisantes

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Evaluation of the Spatial Distribution of &gamma;H2AX following Ionizing Radiation

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An early molecular response to DNA double-strand breaks (DSBs) is phosphorylation of the Ser-139 residue within the terminal SQEY motif of the histone ...

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Salamanders like newt and axolotl possess the ability to regenerate many of its lost body parts such as limbs, the tail with spinal cord, eye, brain, ...

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Isolement de la chromatine par purification d&#39;ARN (CHIRP)

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Analyse rapide de la génétique des épithélio-mésenchymateuse signalisation lors de la régénération des cheveux

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an ...

Measuring Glutathione-induced Feeding Response in Hydra

Mesure induite glutathion-réponse d&#39;alimentation à Hydra

Hydra is among the most primitive organisms possessing a nervous system and chemosensation for detecting reduced glutathione (GSH) for capturing the prey. ...