Name: intestinal epithelial regeneration in response to ionizing irradiation
Uploaded: 2022-07-27T14:05:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Intestinal Epithelial Regeneration in Response to Ionizing Irradiation at JoVE.com

המחברים מבקשים להודות לליבת המחקר ההיסטולוגיה של מרכז סטוני ברוק לסרטן על סיוע מומחה בהכנת דגימות רקמה ולמחלקה למשאבי חיות מעבדה באוניברסיטת סטוני ברוק על סיוע בטיפול וטיפול בבעלי חיים. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מהמכונים הלאומיים לבריאות DK124342 שהוענקו לאגניישקה ב. ביאלקובסקה ו- DK052230 לד"ר וינסנט ו. יאנג.

כל העכברים שוכנו במחלקה למשאבי חיות מעבדה (DLAR) באוניברסיטת סטוני ברוק. הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של אוניברסיטת סטוני ברוק (IACUC) אישרה את כל המחקרים והנהלים המערבים נבדקים בבעלי חיים. ניסויים בבעלי חיים נערכו אך ורק בהתאם לפרוטוקול הטיפול בבעלי חיים המאושר (IACUC #245094).
<p class="jove_...

פרוטוקול זה מתאר מודל חזק וניתן לשחזור של פגיעות קרינה. זה מאפשר ניתוח מדויק של השינויים אפיתל המעי במהלך 7 ימים לאחר הפציעה. חשוב לציין כי נקודות הזמן שנבחרו משקפות שלבים מכריעים של פציעה ומאופיינות בשינויים מובהקים במעי (שלבי פציעה, אפופטוזיס, התחדשות ונורמליזציה)60. מודל זה ?...

אפיתל המעי האנושי יכסה בערך את פני השטח של חצי מגרש בדמינטון אם ימוקם שטוח לחלוטין1. במקום זאת, שכבת התא הבודדת הזו המפרידה בין בני אדם לתכולת המעיים שלהם נדחסת לסדרה של הקרנות דמויות אצבע, וילי ושקעים, קריפטות שממקסמות את שטח הפנים של המעיים. תאי האפיתל מתמיינים לאורך ציר קריפט-וילוס. הווילוס מורכב בעיקר מאנטרוציטים סופגי חומרים מזינים, תאי גביע מפרישי ריר ותאים אנטרואנדוקריניים מייצרי הורמונים, בעוד שהקריפטים מורכבים בעיקר מתאי פאנת מייצרי דפנסין, תאי גזע פעילים ומילואים, ותאי אב 2,3,4,5. יתר על כן, התקשורת הדו-כיוונית שיש לתאים אלה עם תאי הסטרומה ומערכת החיסון של התא המזנכימלי הבסיסי והמיקרוביוטה של הלומן יוצרת רשת מורכבת של אינטראקציות השומרת על הומאוסטזיס המעי והיא קריטית להחלמה לאחר פציעה 6,7,8.
אפיתל המעי הוא הרקמה המתחדשת העצמית המהירה ביותר בגוף האדם, עם קצב תחלופה של 2-6 ימים 9,10,11. במהלך ההומאוסטזיס, תאי גזע פעילים בבסיס קריפטים של המעי (crypt base columnar cells), המסומנים על ידי ביטוי של קולטן מצומד G-protein 5 (LGR5) עשיר בלאוצין, מתחלקים במהירות ומספקים תאי אב המתמיינים לכל שושלות אפיתל המעי האחרות. עם זאת, בשל הקצב המיטוטי הגבוה שלהם, תאי גזע פעילים ואבותיהם המיידיים רגישים במיוחד לפגיעה בקרינת גמא ועוברים אפופטוזיס לאחר הקרנה 5,12,13,14. עם אובדנם, תאי גזע רזרבה ותאים שאינם גזע (תת-אוכלוסייה של אבות וכמה תאים ממוינים סופניים) בתוך קריפטות מעיים עוברים הפעלה ומחדשים את תא הקריפטה הבסיסי, אשר לאחר מכן יכול לשחזר אוכלוסיות תאים של הווילי, ובכך לחדש את אפיתל המעי15. באמצעות טכניקות מעקב אחר שושלת, קבוצות מחקר רבות הוכיחו כי תאי גזע רזרבה (שקטים) מסוגלים לתמוך בהתחדשות עם אובדן תאי גזע פעילים 13,16,17,18,19,20,21,22. תאים אלה מאופיינים בנוכחות של אונקוגן קומפלקס פוליקומב חלבון 1 (Bmi1), גן שעתוק הפוך של עכבר טלומראז (mTert), הופ הומיאובוקס (Hopx), וגן חלבון חוזר עשיר בלאוצין 1 (Lrig1). בנוסף, הוכח כי תאים שאינם גזע מסוגלים לחדש את crypts המעי עם פציעה 23,24,25,26,27,28,29,30,31. בפרט, הוכח כי אבות של תאים מפרישים ו enterocytes לעבור dedifferentiation עם פציעה, לחזור תאים דמויי גזע, ולתמוך התחדשות של אפיתל המעי. מחקרים אחרונים זיהו תאים המבטאים סמנים מרובים בעלי יכולת לרכוש מאפיינים דמויי גזע בעת פציעה (כגון DLL+, ATOH1+, PROX1+, MIST1+, DCLK1+)32,33,34,35,36. באופן מפתיע, Yu et al. הראו כי אפילו תאי Paneth בוגרים (LYZ+) יכולים לתרום להתחדשות המעי37. יתר על כן, בנוסף לגרימת אפופטוזיס של תאי אפיתל במעי ושיבוש תפקוד מחסום האפיתל, הקרנה גורמת לדיסביוזה של פלורת המעי, הפעלת תאי מערכת החיסון והתחלת תגובה פרו-דלקתית, והפעלת תאים מזנכימליים וסטרומליים38,39.
קרינת גמא היא כלי טיפולי רב ערך בטיפול בסרטן, במיוחד כשמדובר בגידולים במעי הגס40. עם זאת, הקרנה משפיעה באופן משמעותי על הומאוסטזיס המעי על ידי גרימת נזק לתאים, מה שמוביל אפופטוזיס. חשיפה לקרינה גורמת להפרעות מרובות המאטות את החלמתו של המטופל ומאופיינת בפגיעה ברירית ודלקת בשלב החריף ובשלשולים, בריחת שתן, דימום וכאבי בטן לטווח ארוך. מכלול זה של ביטויים מכונה רעילות קרינה במערכת העיכול. בנוסף, התקדמות הנגרמת על ידי קרינה של פיברוזיס טרנסמורלי ו / או טרשת וסקולרית עשויה להתבטא רק שנים לאחר הטיפול38,41. במקביל לפציעה עצמה, הקרינה גורמת לתגובת תיקון בתאי המעי המפעילה מסלולי איתות האחראים על ייזום ותזמור התחדשות42. מחלת מעי דק הנגרמת על ידי קרינה יכולה לנבוע מהקרנות אגן או בטן הניתנות לאיברים אחרים (כגון צוואר הרחם, הערמונית, הלבלב, פי הטבעת)41,43,44,45,46. פגיעה בהקרנת מעיים היא, אם כן, בעיה קלינית משמעותית, והבנה טובה יותר של הפתופיזיולוגיה הנובעת מכך עשויה לקדם את הפיתוח של התערבויות להקלת הסיבוכים במערכת העיכול הקשורים להקרנות. ישנן טכניקות אחרות המאפשרות לחקור את המטרה הרגנרטיבית של אפיתל המעי מלבד קרינה. מודלים של מורין מהונדס וכימי לחקר דלקת וההתחדשות לאחר מכן פותחו47. דקסטרן נתרן גופרתי (DSS) גורם לדלקת במעי ומוביל להתפתחות מאפיינים דומים לאלה של מחלות מעי דלקתיות48. שילוב של טיפול DSS עם התרכובת המסרטנת azoxymethane (AOM) יכול לגרום להתפתחות סרטן הקשור קוליטיס48,49. פגיעה הנגרמת על ידי איסכמיה היא שיטה נוספת המשמשת לחקר הפוטנציאל ההתחדשות של אפיתל המעי. טכניקה זו דורשת ניסיון וידע כירורגי50. יתר על כן, הטכניקות הנ"ל גורמות לסוגים שונים של פגיעה מאשר קרינה ועלולות להוביל למעורבות של מנגנוני התחדשות שונים. בנוסף, מודלים אלה גוזלים זמן, בעוד טכניקת הקרינה קצרה למדי. לאחרונה, שיטות במבחנה המשתמשות באנטרואידים וקולונואידים המופקים מהמעי ומהמעי הגס שימשו בשילוב עם פגיעה בקרינה כדי לחקור את מנגנוני התחדשות המעי51,52. עם זאת, טכניקות אלה אינן משחזרות באופן מלא את האיבר שהן מדגימות53,54.
הפרוטוקול המוצג כולל תיאור של מודל מורין של פגיעה בקרינת גמא בשילוב עם מודל גנטי המאפשר לאחר טיפול בטמוקסיפן התחקות אחר שושלות שמקורן באוכלוסיית תאי הגזע השמורות (Bmi1-CreER; רוזה26eYFP). מודל זה משתמש בהקרנה של 12 Gy לכל הגוף, אשר גורמת לפגיעה משמעותית מספיק במעיים כדי להפעיל תאי גזע רזרבה ועדיין מאפשרת חקירה עוקבת של יכולת התחדשות המעי תוך 7 ימים מהפציעה55.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mL syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309659</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16G Reusable Small Animal Feeding Needles: Straight</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20068-630</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>27G x 1/2&#34; needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>305109</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>28G x 1/2&#34; Monoject 1mL insulin syringe</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>1188128012</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-Ethynyl-2&#8242;-deoxyuridine (EdU)</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc284628A</td>
			<td>10 mg/mL in sterile DMSO:water (1:4 v/v), aliquot and store in -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Azer Scientific&#160;10% Neutral Buffered Formalin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-026-213</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B6.129X1-Gt(ROSA)26Sortm1(EYFP)Cos/J</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>Strain #:006148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B6;129-Bmi1tm1(cre/ERT)Mrc/J</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>Strain #:010531</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin Fraction V, heat shock</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>3116956001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken anti-GFP</td>
			<td>Aves</td>
			<td>GFP-1020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Click-IT plus EdU Alexa Fluor 555 imaging kit, Invitrogen</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C10638</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corn oil</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>C8267</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Decloaking Chamber</td>
			<td>Biocare Medical</td>
			<td>DC2012</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP231-100</td>
			<td>light sensitive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase-free proteinase K</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C10618H</td>
			<td>diluted 25x in DPBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-chicken AF647</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>703-605-155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>21-031-CV</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence Microscope Nikon Eclipse 90i Bright and fluoerescent light, with objectives: 10X, 20X</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount Aqueous Mounting Medium</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>F4680-25ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gamma Cell 40 Exactor</td>
			<td>Best Theratronics Ltd.</td>
			<td>-</td>
			<td>0.759 Gy min-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit AF488</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>111-545-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin Solution, Gill No. 3</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>GHS332</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HM 325 Rotary Microtome from Thermo Scientific</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>23-900-668</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33258, Pentahydrate (bis-Benzimide)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>H3569</td>
			<td>dilution 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen Peroxide Solution, ACS, 29-32%, Spectrum Chemical</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>18-603-252</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>In Situ Cell Death Detection Kit, Fluorescein (Roche)</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>11684795910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid Blocker Super PAP PEN, Mini</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>DAI-PAP-S-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lithium Carbonate (Powder/Certified ACS), Fisher Chemical</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>L119-500</td>
			<td>0.5g/1L dH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer-Lok Syringe sterile, single use, 10 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89215-218</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH1135-4LP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pharmco Products&#160;Ethyl alcohol, 200 PROOF</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC1675398</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pharmco-Aaper 281000ACSCSLT Acetic Acid ACS Grade</td>
			<td>Capitol Scientific</td>
			<td>AAP-281000ACSCSLT</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-Ki67</td>
			<td>BioCare Medical</td>
			<td>CRM325</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Richard-Allan Scientific Cytoseal XYL Mounting Medium</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-050-262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scientific Industries Incubator-Genie for baking slides at 65 degree</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-728-103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Citrate Dihydrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S279-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless Steel Dissecting Kit</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25640-002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost Plus micro slides [size: 25 x 75 x 1 mm]</td>
			<td>VWR</td>
			<td>&#160;48311-703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tamoxifen</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>T5648</td>
			<td>30 mg/mL in sterile corn oil, preferably fresh or short-sterm storage in -20&#176;C, light sensitive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek 24-Slide Holders with Detachable Handle</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4465</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek&#160;Accu-Edge&#160;Low Profile Blades</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4689</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek&#160;Manual Slide Staining Set</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4451</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek Staining Dish, Green with Lid</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4456</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek Staining Dish, White with Lid</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4457</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>P7949</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Unisette Processing Cassettes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>87002-292</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Micro Cover Glasses</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48393-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>X5P-1GAL</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

intestinal epithelial regeneration in response to ionizing irradiation

אפיתל המעי מורכב משכבה אחת של תאים אך מכיל סוגים רבים של תאים ממוינים סופניים, אשר נוצרים על ידי התפשטות פעילה של תאי גזע מעיים הממוקמים בתחתית crypts המעי. עם זאת, במהלך אירועים של פגיעה חריפה במעי, תאי גזע פעילים אלה עוברים מוות תאי. הקרנת גמא היא טיפול נפוץ בסרטן המעי הגס, אשר, בעוד יעיל מבחינה טיפולית, יש את תופעת הלוואי של דלדול מאגר תאי הגזע הפעיל. ואכן, חולים חווים לעתים קרובות תסמונת קרינה במערכת העיכול בזמן שהם עוברים הקרנות, בין היתר בשל דלדול תאי גזע פעילים. אובדן תאי גזע פעילים במעיים מפעיל מאגר של תאי גזע במעי שבדרך כלל נמצאים ברזרבה שקטה וגורם להתמיינות של תאים מבשרי הפרשה ואנטרוציט. אלמלא תאים אלה, אפיתל המעי היה חסר את היכולת להתאושש מהקרנות ופגיעות רקמה גדולות אחרות. פיתוחים חדשים בטכנולוגיות למעקב אחר שושלות מאפשרים מעקב אחר ההפעלה, ההתמיינות והנדידה של תאים במהלך רגנרציה, ושימשו בהצלחה לחקר זה במעיים. מחקר זה נועד לתאר שיטה לניתוח תאים בתוך אפיתל המעי של העכבר לאחר פגיעה בקרינה.

השימוש בקרינה הכוללת של 12 Gy (TBI) בשילוב עם מעקב אחר שושלת גנטית של מורין מאפשר ניתוח מעמיק של ההשלכות של פגיעה בקרינה במעיים. כדי להתחיל, Bmi1-CreER; עכברי Rosa26eYFP קיבלו זריקת טמוקסיפן יחידה, הגורמת לביטוי משופר של חלבון פלואורסצנטי צהוב (EYFP) באוכלוסיית תאי גזע מסוג Bmi1+ . יומיי...

Watch this Scientific Journal Video about Intestinal Epithelial Regeneration in Response to Ionizing Irradiation at JoVE.com

Intestinal Epithelial Regeneration in Response to Ionizing Irradiation

מערכת העיכול היא אחד האיברים הרגישים ביותר לפגיעה בטיפולי סרטן רדיותרפיים. זוהי בו זמנית מערכת איברים עם אחת מיכולות ההתחדשות הגבוהות ביותר בעקבות עלבונות כאלה. הפרוטוקול המוצג מתאר שיטה יעילה לחקר יכולת ההתחדשות של אפיתל המעי.

התחדשות אפיתל המעי בתגובה לקרינה מייננת

The intestinal epithelium consists of a single layer of cells yet contains multiple types of terminally differentiated cells, which are generated by the ...

הקרנת גמא היא טיפול נפוץ לסרטן המעי הגס. ובעוד זה יעיל מבחינה טיפולית, יש לו השפעות שליליות על מערכת העיכול. הפרוטוקול המוצג מתאר שיטה יעילה לחקר ההפעלה, ההתמיינות והנדידה של תאים במהלך התחדשות לאחר פגיעה בקרינה.פרוטוקול זה מתאר מודל חזק וניתן לשחזור של פגיעות קרינה. חשוב לציין, מודל זה מאפשר לעקוב אחר גורל תאי המעי לאחר פציעה ובכך מספק הבנה טובה יותר של יכולת ההתחדשות של תת-אוכלוסיית תאים ספציפית. טכניקה זו יכולה להשתמש במודלים שונים של בעלי חיים העוקבים אחר שושלת כדי לחקור את ההתנהגות בזמן אמת ואת האינטראקציה של תת-אוכלוסיות שונות של תאים לאחר פציעה.שינויים קלים בפרוטוקול זה אמורים לאפשר לחקור את היחסים בין מיקרוביוטה לבין אוכלוסיות שונות של תאי אפיתל, סטרומה ומערכת החיסון בעת פגיעה בקרינה. כדי להתחיל, להשעות אבקת טמוקסיפן בשמן תירס סטרילי בריכוז של 30 מיקרוגרם למיקרוליטר. סוניק במשך שלוש דקות במחזורי כיבוי של 30 שניות עם משרעת של 60%.מערבבים בסיבוב בחושך במשך שעה בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, הכינו את EdU על ידי הוספת DMSO סטרילי לאבקת EdU. מוסיפים 1/5 מהנפח הכולל, ומוסיפים לאט לאט את הנפח הנותר של מים סטריליים טהורים במיוחד.כאשר מומס לחלוטין, aliquot ולאחסן ב 20 מעלות צלזיוס. הכינו ריאגנטים לאיסוף וקיבוע רקמות, כגון אתנול 70% במים, DPBS מקורר לארבע מעלות צלזיוס, חיץ קיבוע של Bouin, ופורמלין חוצץ 10%. לאחר מכן, להכין את הציוד הדרוש, כגון ערכת דיסקציה עכברים, צלחות פטרי, מחט gavage 16 מד מחובר מזרק 10 מיליליטר קלטות היסטולוגיות.יומיים לפני החשיפה לקרינת גמא, הכינו את חיות הניסוי להזרקת טמוקסיפן. לשקול כל חיה, ולחשב את המינון הנדרש. יש לחטא את אזור הבטן באתנול 70%.לאחר מכן, יש לתת מנה אחת של טמוקסיפן תוך צפקי באמצעות מחט של 27 מד המחוברת למזרק של מיליליטר כדי לגרום לרקומבינציה בתיווך Cre. התבוננו בבעלי חיים במשך 48 השעות הבאות כדי למנוע רעילות פוטנציאלית של טמוקסיפן. לאחר 48 שעות, העבירו את בעלי החיים לחדר הקרנה.יש לחטא את תא הדגימה במקרין הגמא בתמיסת אתנול 70%. הניחו את משטח הספיגה ובעלי החיים בתוך תא הדגימה. מניחים את המכסה וסוגרים את החדר.תכנת את מקרין הגמא כך שיחשוף בעלי חיים לקרינת גוף כוללת של 12 אפורים. לאחר מכן, סובב את המקש למיקום ההתחלה ולחץ על התחל כדי להתחיל את החשיפה. השאירו את החדר לזמן חשיפה פעיל.לאחר שחלף הזמן שנקבע מראש, המכונה תפסיק אוטומטית ותתחיל לצפצף. כבה את המכונה על-ידי הפיכת המפתח למצב עצירה. פתח את תא הדגימה והסר את המכסה.מעבירים את בעלי החיים לכלוב, ומחטאים את תא הדגימה באתנול 70%. העבירו את בעלי החיים בחזרה לחדר הדיור הקונבנציונלי, והתבוננו במצבם לאחר הטיפול. עקוב אחר משקל בעלי החיים מדי יום.שלוש שעות לפני המתת החסד המתוכננת, יש לחטא את אזור הבטן ולהזריק לעכברים תוך צפקית 100 מיקרוליטר של תמיסת מלאי EdU באמצעות מזרק אינסולין בעל 28 מד. לאחר המתת החיה, לאסוף את המעיים פרוקסימלי בנקודות זמן שונות לאחר הקרנה. לנתח את החלק הפרוקסימלי של המעי הדק, ולהסיר רקמות מחוברות.שטפו את הרקמה ב-DPBS קר באמצעות מחט הזנה ישרה בעלת 16 מד המחוברת למזרק של 10 מיליליטר, וקיבעו את הרקמה באמצעות חיץ הקיבוע של Bouin. חתכו את המעיים לאורך, וגלגלו את המעיים הפרוקסימליים בטכניקת סוויס-רול. הניחו את הרקמות בקלטת היסטולוגית במיכל עם 10% פורמלין חוצץ, ודגרו עליו במשך 24 עד 48 שעות בטמפרטורת החדר.לאחר הדגירה, להעביר את הקלטות היסטולוגיות ל 70% אתנול, ולהטמיע את הרקמה בפרפין. לאחר ההטבעה, הניחו את הקלטות ההיסטולוגיות על קרח למשך שעה לפחות. לאחר מכן, חתכו חלקים אופקיים בעובי חמישה מיקרון באמצעות מיקרוטום.מעבירים את חלקי הרקמה לאמבט מים המחומם עד 45 מעלות צלזיוס, ומניחים את המקטעים על מגלשות טעונות. השאירו את המגלשות על מדף למשך הלילה בטמפרטורת החדר לייבוש. תמונות המטוקסילין ואוזין של דגימות מעי דק הראו אפיתל מעי הומיאוסטטי בשעת אפס, ואחריו אובדן תאים בתוך תאי קריפטה במהלך השלב האפופטוטי.לאחר מכן הגיע השלב הרגנרטיבי שבו תאים מתרבים מאוד אכלסו את הקריפטות, מה שהוביל לשלב הנורמליזציה ביום השביעי. מעקב אחר שושלת על ידי EYFP הראה כי במהלך הומאוסטזיס, התאים שמקורם בתאי גזע עתודות חיוביות Bmi1 הוגבלו לפלוס ארבעה עד פלוס שישה מיקומים בתוך קריפטות. צביעת EdU ו- Ki-67 הראתה הומאוסטזיס מעיים תקין בעכברים מוקרנים דמה, המשתרעת מתאי גזע פעילים דרך אזור הגברת המעבר.במהלך השלב האפופטוטי, מספר התאים החיוביים ל-EYFP ירד, מלווה באובדן תאים מתרבים שנגרם כתוצאה מנזקי קרינה. בשלב הרגנרטיבי נצפתה הפעלה של תאי גזע רזרבה והתפשטות מהירה של תאים חיוביים ל- Bmi1. התפשטות נוספת והגירה החזירו את שלמות אפיתל המעי.צביעת טונל הראתה כי תאים אפופטוטיים נעדרים במהלך הומאוסטזיס. עלייה בצביעת טונל נצפתה בשלב מאוחר בשלב האפופטוטי. במהלך השלב הרגנרטיבי, צביעת טונל פחתה בהתמדה בתוך הקריפטים המתחדשים וכמעט נעדרה כאשר הקריפטים נרמלו.ניתן לשלב טכניקה זו עם ריצוף RNA, ריצוף RNA חד-תאי, מיון תאים המופעלים על ידי פלואורסצנטיות או אנליזה פרוטאומית כדי ללקט ידע מעמיק יותר על תפקידן של שושלות תאים ספציפיות במהלך התחדשות המעי לאחר פציעה. החוקרים יכולים לחקור את יחסי הגומלין בין מיקרוביוטה לבין אוכלוסיות תאי אפיתל, סטרומה ומערכת החיסון בהתחדשות המעי כדי להרחיב את ההבנה של יכולת ההתחדשות של אפיתל המעי.

intestinal-epithelial-regeneration-in-response-to-ionizing-irradiation

Research

JoVE Journal

Biology

Cortical Neurogenesis: Transitioning from Advances in the Laboratory to Cell-Based Therapies

Neurogenesis קליפתיים: מעבר מן ההתקדמות מעבדה כדי Cell טיפולים מבוססי

Quantification of &gamma;H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

DNA double-strand breaks (DSBs), which are induced by either endogenous metabolic processes or by exogenous sources, are one of the most critical DNA lesions with respect to survival and preservation of genomic integrity. An early response to the induction of DSBs is phosphorylation of the H2A histone variant, H2AX, at the serine-139 residue, in the highly conserved C-terminal SQEY motif, forming &gamma;H2AX1. Following induction of DSBs, H2AX is rapidly phosphorylated by the phosphatidyl-inosito 3-kinase (PIKK) family of proteins, ataxia telangiectasia mutated (ATM), DNA-protein kinase catalytic subunit and ATM and RAD3-related (ATR)2. Typically, only a few base-pairs (bp) are implicated in a DSB, however, there is significant signal amplification, given the importance of chromatin modifications in DNA damage signalling and repair. Phosphorylation of H2AX mediated predominantly by ATM spreads to adjacent areas of chromatin, affecting approximately 0.03% of total cellular H2AX per DSB2,3. This corresponds to phosphorylation of approximately 2000 H2AX molecules spanning ~2 Mbp regions of chromatin surrounding the site of the DSB and results in the formation of discrete &gamma;H2AX foci which can be easily visualized and quantitated by immunofluorescence microscopy2. The loss of &gamma;H2AX at DSB reflects repair, however, there is some controversy as to what defines complete repair of DSBs; it has been proposed that rejoining of both strands of DNA is adequate however, it has also been suggested that re-instatement of the original chromatin state of compaction is necessary4-8. The disappearence of &gamma;H2AX involves at least in part, dephosphorylation by phosphatases, phosphatase 2A and phosphatase 4C5,6. Further, removal of &gamma;H2AX by redistribution involving histone exchange with H2A.Z has been implicated7,8. Importantly, the quantitative analysis of &gamma;H2AX foci has led to a wide range of applications in medical and nuclear research. Here, we demonstrate the most commonly used immunofluorescence method for evaluation of initial DNA damage by detection and quantitation of &gamma;H2AX foci in &gamma;-irradiated adherent human keratinocytes9.

Quantification of &amp;#947;H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

Quantification of DNA double-strand streaks using &gamma;H2AX formation as a molecular marker has become an invaluable tool in radiation biology. Here we demonstrate the use of an immunofluorescence assay for quantification of &gamma;H2AX foci after exposure of cells to radiation.

כימות γH2AX מוקדים בתגובה קרינה Ionising

DNA double-strand breaks (DSBs), which are induced by either endogenous metabolic processes or by exogenous sources, are one of the most critical DNA ...

Evaluation of the Spatial Distribution of &gamma;H2AX following Ionizing Radiation

An early molecular response to DNA double-strand breaks (DSBs) is phosphorylation of the Ser-139 residue within the terminal SQEY motif of the histone H2AX1,2. This phosphorylation of H2AX is mediated by the phosphatidyl-inosito 3-kinase (PI3K) family of proteins, ataxia telangiectasia mutated (ATM), DNA-protein kinase catalytic subunit and ATM and RAD3-related (ATR)3. The phosphorylated form of H2AX, referred to as &gamma;H2AX, spreads to adjacent regions of chromatin from the site of the DSB, forming discrete foci, which are easily visualized by immunofluorecence microscopy3. Analysis and quantitation of &gamma;H2AX foci has been widely used to evaluate DSB formation and repair, particularly in response to ionizing radiation and for evaluating the efficacy of various radiation modifying compounds and cytotoxic compounds4.
Given the exquisite specificity and sensitivity of this de novo marker of DSBs, it has provided new insights into the processes of DNA damage and repair in the context of chromatin. For example, in radiation biology the central paradigm is that the nuclear DNA is the critical target with respect to radiation sensitivity. Indeed, the general consensus in the field has largely been to view chromatin as a homogeneous template for DNA damage and repair. However, with the use of &gamma;H2AX as molecular marker of DSBs, a disparity in &gamma;-irradiation-induced &gamma;H2AX foci formation in euchromatin and heterochromatin has been observed5-7. Recently, we used a panel of antibodies to either mono-, di- or tri- methylated histone H3 at lysine 9 (H3K9me1, H3K9me2, H3K9me3) which are epigenetic imprints of constitutive heterochromatin and transcriptional silencing and lysine 4 (H3K4me1, H3K4me2, H3K4me3), which are tightly correlated actively transcribing euchromatic regions, to investigate the spatial distribution of &gamma;H2AX following ionizing radiation8. In accordance with the prevailing ideas regarding chromatin biology, our findings indicated a close correlation between &gamma;H2AX formation and active transcription9. Here we demonstrate our immunofluorescence method for detection and quantitation of &gamma;H2AX foci in non-adherent cells, with a particular focus on co-localization with other epigenetic markers, image analysis and 3D-modeling.

Evaluation of the Spatial Distribution of &amp;#947;H2AX following Ionizing Radiation

Microscopic analysis of &gamma;H2AX foci, which form following the phosphorylation of H2AX at Ser-139 in response to DNA double-strand breaks, has become an invaluable tool in radiation biology. Here we used an antibody to mono-methylated histone H3 at lysine 4 as an epigenetic marker of actively transcribing euchromatin, to evaluate the spatial distribution of radiation-induced &gamma;H2AX formation within the nucleus.

הערכת התפלגות מרחבית של γH2AX הבאים בקרינה מייננת

An early molecular response to DNA double-strand breaks (DSBs) is phosphorylation of the Ser-139 residue within the terminal SQEY motif of the histone ...

A System for Culturing Iris Pigment Epithelial Cells to Study Lens Regeneration in Newt

Salamanders like newt and axolotl possess the ability to regenerate many of its lost body parts such as limbs, the tail with spinal cord, eye, brain, heart, the jaw 1. Specifically, newts are unique for its lens regeneration capability. Upon lens removal, IPE cells of the dorsal iris transdifferentiate to lens cells and eventually form a new lens in about a month 2,3. This property of regeneration is never exhibited by the ventral iris cells. The regeneration potential of the iris cells can be studied by making transplants of the in vitro cultured IPE cells. For the culture, the dorsal and ventral iris cells are first isolated from the eye and cultured separately for a time period of 2 weeks (Figure 1). These cultured cells are reaggregated and implanted back to the newt eye. Past studies have shown that the dorsal reaggregate maintains its lens forming capacity whereas the ventral aggregate does not form a lens, recapitulating, thus the in vivo process (Figure 2) 4,5. This system of determining regeneration potential of dorsal and ventral iris cells is very useful in studying the role of genes and proteins involved in lens regeneration.

In newt, the lens regenerates always from the dorsal iris by transdifferentiation of the iris pigmented epithelial cells (IPEs). Here we describe a procedure to culture dorsal and ventral newt IPE cells and their implantation to the newt eye. The implanted cells are then studied by tissue sectioning and immunohistochemistry.

מערכת culturing איריס תאים פיגמנט אפיתל לחקר התחדשות עדשה של ניוט

Salamanders like newt and axolotl possess the ability to regenerate many of its lost body parts such as limbs, the tail with spinal cord, eye, brain, ...

Laser Ablation of the Zebrafish Pronephros to Study Renal Epithelial Regeneration

Acute kidney injury (AKI) is characterized by high mortality rates from deterioration of renal function over a period of hours or days that culminates in renal failure1. AKI can be caused by a number of factors including ischemia, drug-based toxicity, or obstructive injury1. This results in an inability to maintain fluid and electrolyte homeostasis. While AKI has been observed for decades, effective clinical therapies have yet to be developed. Intriguingly, some patients with AKI recover renal functions over time, a mysterious phenomenon that has been only rudimentally characterized1,2. Research using mammalian models of AKI has shown that ischemic or nephrotoxin-injured kidneys experience epithelial cell death in nephron tubules1,2, the functional units of the kidney that are made up of a series of specialized regions (segments) of epithelial cell types3. Within nephrons, epithelial cell death is highest in proximal tubule cells. There is evidence that suggests cell destruction is followed by dedifferentiation, proliferation, and migration of surrounding epithelial cells, which can regenerate the nephron entirely1,2. However, there are many unanswered questions about the mechanisms of renal epithelial regeneration, ranging from the signals that modulate these events to reasons for the wide variation of abilities among humans to regenerate injured kidneys.
The larval zebrafish provides an excellent model to study kidney epithelial regeneration as its pronephric kidney is comprised of nephrons that are conserved with higher vertebrates including mammals4,5. The nephrons of zebrafish larvae can be visualized with fluorescence techniques because of the relative transparency of the young zebrafish6. This provides a unique opportunity to image cell and molecular changes in real-time, in contrast to mammalian models where nephrons are inaccessible because the kidneys are structurally complex systems internalized within the animal. Recent studies have employed the aminoglycoside gentamicin as a toxic causative agent for study of AKI and subsequent renal failure: gentamicin and other antibiotics have been shown to cause AKI in humans, and researchers have formulated methods to use this agent to trigger kidney damage in zebrafish7,8. However, the effects of aminoglycoside toxicity in zebrafish larvae are catastrophic and lethal, which presents a difficulty when studying epithelial regeneration and function over time. Our method presents the use of targeted cell ablation as a novel tool for the study of epithelial injury in zebrafish. Laser ablation gives researchers the ability to induce cell death in a limited population of cells. Varying areas of cells can be targeted based on morphological location, function, or even expression of a particular cellular phenotype. Thus, laser ablation will increase the specificity of what researchers can study, and can be a powerful new approach to shed light on the mechanisms of renal epithelial regeneration. This protocol can be broadly applied to target cell populations in other organs in the zebrafish embryo to study injury and regeneration in any number of contexts of interest.

Acute kidney injury (AKI) in humans is a common clinical problem caused by damage to the epithelial cells that comprise kidney nephrons, and AKI is associated with high mortality rates of 50-70%1. Following epithelial cell destruction, nephrons have a limited ability to regenerate, though the mechanisms and limitations that guide this phenomenon remain poorly understood. In this video article, we describe our technique for targeted laser ablation of kidney nephron cells in the zebrafish embryo kidney, or pronephros. Our new method can be used to complement nephrotoxicity-induced models of AKI and gain a high-resolution understanding of the cell and molecular alterations that are associated with epithelial regeneration in the kidney nephron.

אבלציה בלייזר של דג הזברה כלית ראשית לחקר התחדשות אפיתל הכליה

Acute kidney injury (AKI) is characterized by high mortality rates from deterioration of renal function over a period of hours or days that culminates in ...

Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP)

Long noncoding RNAs are key regulators of chromatin states for important biological processes such as dosage compensation, imprinting, and developmental gene expression 1,2,3,4,5,6,7. The recent discovery of thousands of lncRNAs in association with specific chromatin modification complexes, such as Polycomb Repressive Complex 2 (PRC2) that mediates histone H3 lysine 27 trimethylation (H3K27me3), suggests broad roles for numerous lncRNAs in managing chromatin states in a gene-specific fashion 8,9. While some lncRNAs are thought to work in cis on neighboring genes, other lncRNAs work in trans to regulate distantly located genes. For instance, Drosophila lncRNAs roX1 and roX2 bind numerous regions on the X chromosome of male cells, and are critical for dosage compensation 10,11. However, the exact locations of their binding sites are not known at high resolution. Similarly, human lncRNA HOTAIR can affect PRC2 occupancy on hundreds of genes genome-wide 3,12,13, but how specificity is achieved is unclear. LncRNAs can also serve as modular scaffolds to recruit the assembly of multiple protein complexes. The classic trans-acting RNA scaffold is the TERC RNA that serves as the template and scaffold for the telomerase complex 14; HOTAIR can also serve as a scaffold for PRC2 and a H3K4 demethylase complex 13.
Prior studies mapping RNA occupancy at chromatin have revealed substantial insights 15,16, but only at a single gene locus at a time. The occupancy sites of most lncRNAs are not known, and the roles of lncRNAs in chromatin regulation have been mostly inferred from the indirect effects of lncRNA perturbation. Just as chromatin immunoprecipitation followed by microarray or deep sequencing (ChIP-chip or ChIP-seq, respectively) has greatly improved our understanding of protein-DNA interactions on a genomic scale, here we illustrate a recently published strategy to map long RNA occupancy genome-wide at high resolution 17. This method, Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP) (Figure 1), is based on affinity capture of target lncRNA:chromatin complex by tiling antisense-oligos, which then generates a map of genomic binding sites at a resolution of several hundred bases with high sensitivity and low background. ChIRP is applicable to many lncRNAs because the design of affinity-probes is straightforward given the RNA sequence and requires no knowledge of the RNA's structure or functional domains.

Chromatin Isolation by RNA Purification ChIRP

ChIRP is a novel and rapid technique to map genomic binding sites of long noncoding RNAs (lncRNAs). The method takes advantage of the specificity of anti-sense tiling oligonucleotides to allow the enumeration of lncRNA-bound genomic sites.

בידוד הכרומטין על ידי טיהור RNA (ציוץ)

Long noncoding RNAs are key regulators of chromatin states for important biological processes such as dosage compensation, imprinting, and developmental ...

Rapid Genetic Analysis of Epithelial-Mesenchymal Signaling During Hair Regeneration

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an attractive model system to study organ development and tissue-specific signaling. Although hair follicle development is genetically tractable, fast and reproducible analysis of factors essential for this process remains a challenge. Here we describe a procedure to generate targeted overexpression or shRNA-mediated knockdown of factors using lentivirus in a tissue-specific manner. Using a modified version of a hair regeneration model 5, 6, 11, we can achieve robust gain- or loss-of-function analysis in primary mouse keratinocytes or dermal cells to facilitate study of epithelial-mesenchymal signaling pathways that lead to hair follicle morphogenesis. We describe how to isolate fresh primary mouse keratinocytes and dermal cells, which contain dermal papilla cells and their precursors, deliver lentivirus containing either shRNA or cDNA to one of the cell populations, and combine the cells to generate fully formed hair follicles on the backs of nude mice. This approach allows analysis of tissue-specific factors required to generate hair follicles within three weeks and provides a fast and convenient companion to existing genetic models.

Tissue-specific analysis of a hair follicle regeneration model using lentivirus to mediate gain- or loss-of-function.

ניתוח גנטי מהיר של איתות אפיתל-mesenchymal במהלך התחדשות שיער

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an ...

Measuring Glutathione-induced Feeding Response in Hydra

Hydra is among the most primitive organisms possessing a nervous system and chemosensation for detecting reduced glutathione (GSH) for capturing the prey. The movement of prey organisms causes mechanosensory discharge of the stinging cells called nematocysts from hydra, which are inserted into the prey. The feeding response in hydra, which includes curling of the tentacles to bring the prey towards the mouth, opening of the mouth and consequent engulfing of the prey, is triggered by GSH present in the fluid released from the injured prey. To be able to identify the molecular mechanism of the feeding response in hydra which is unknown to date, it is necessary to establish an assay to measure the feeding response. Here, we describe a simple method for the quantitation of the feeding response in which the distance between the apical end of the tentacle and mouth of hydra is measured and the ratio of such distance before and after the addition of GSH is determined. The ratio, called the relative tentacle spread, was found to give a measure of the feeding response. This assay was validated using a starvation model in which starved hydra show an enhanced feeding response in comparison with daily fed hydra.

Here we describe a simple assay for the quantification of the feeding response in hydra induced by the reduced form of glutathione. This assay relies on measuring the distance between the apical end of the tentacle and mouth of hydra.

מדידת תגובת האכלה מושרה גלוטתיון בהידרה

Hydra is among the most primitive organisms possessing a nervous system and chemosensation for detecting reduced glutathione (GSH) for capturing the prey. ...

In Vitro and In Vivo Approaches to Determine Intestinal Epithelial Cell Permeability

The intestinal barrier defends against pathogenic microorganism and microbial toxin. Its function is regulated by tight junction permeability and epithelial cell integrity, and disruption of the intestinal barrier function contributes to progression of gastrointestinal and systemic disease. Two simple methods are described here to measure the permeability of intestinal epithelium. In vitro, Caco-2BBe cells are plated in tissue culture wells as a monolayer and transepithelial electrical resistance (TER) can be measured by an epithelial (volt/ohm) meter. This method is convincing because of its user-friendly operation and repeatability. In vivo, mice are gavaged with 4 kDa fluorescein isothiocyanate (FITC)-dextran, and the FITC-dextran concentrations are measured in collected serum samples from mice to determine the epithelial permeability. Oral gavage provides an accurate dose, and therefore is the preferred method to measure the intestinal permeability in vivo. Taken together, these two methods can measure the permeability of the intestinal epithelium in vitro and in vivo, and hence be used to study the connection between diseases and barrier function.

In Vitro and In Vivo Approaches to Determine Intestinal Epithelial Cell Permeability

Two methods are presented here to determine intestinal barrier function. An epithelial meter (volt/ohm) is used for measurements of transepithelial electrical resistance of cultured epithelia directly in tissue culture wells. In mice, the FITC-dextran gavage method is used to determine the intestinal permeability in vivo.

במבחנה , גישות In Vivo כדי לקבוע חדירות תאים אפיתל המעי

The intestinal barrier defends against pathogenic microorganism and microbial toxin. Its function is regulated by tight junction permeability and ...

Dosimetry for Cell Irradiation using Orthovoltage (40-300 kV) X-Ray Facilities

The importance of dosimetry protocols and standards for radiobiological studies is self-evident. Several protocols have been proposed for dose determination using low energy X-ray facilities, but depending on the irradiation configurations, samples, materials or beam quality, it is sometimes difficult to know which protocol is the most appropriate to employ. We, therefore, propose a dosimetry protocol for cell irradiations using low energy X-ray facility. The aim of this method is to perform the dose estimation at the level of the cell monolayer to make it as close as possible to real cell irradiation conditions. The different steps of the protocol are as follows: determination of the irradiation parameters (high voltage, intensity, cell container etc.), determination of the beam quality index (high voltage-half value layer couple), dose rate measurement with ionization chamber calibrated in air kerma conditions, quantification of the attenuation and scattering of the cell culture medium with EBT3 radiochromic films, and determination of the dose rate at the cellular level. This methodology must be performed for each new cell irradiation configuration as the modification of only one parameter can strongly impact the real dose deposition at the level of the cell monolayer, particularly involving low energy X-rays.

Dosimetry for Cell Irradiation using Orthovoltage 40-300 kV X-Ray Facilities

This document describes a new dosimetry protocol for cell irradiations using low energy X-ray equipment. Measurements are performed in conditions simulating real cell irradiation conditions as much as possible.